我国是世界上鸡蛋生产和消费大国，近年来，随着人们对食品安全的重视，鸡蛋的安全问题亦日趋成为社会关注的主要问题，饲料和矿物元素成为重金属暴露的主要渠道[1]。前期调查研究发现，蛋鸡配合饲粮[2]和原料特别是菜籽粕和谷物加工副产物(麦麸、米糠)中重金属镉(Cd)、铅(Pb)、铬(Cr)和钒(V)含量存在超标现象(Cd、Pb、Cr含量参考《饲料卫生标准GB 13078—2017》，V含量参考美国《Mineral Tolerance of Animals》)[3]。重金属污染物随饲粮进入家禽体内，在家禽的主要代谢器官沉积，引起家禽的慢性中毒，当剂量增加时还可以导致家禽急性中毒，甚至死亡，而小剂量的重金属持续进入到蛋鸡体内，还可以残留到鸡蛋中引起生物蓄积，危害鸡蛋的安全性[1, 4]。Cd对人和动物毒害作用呈多系统和多器官性，具有致癌、致畸、致突变的作用[4-5]。Pb具有较强的蓄积性和毒性，高剂量的Pb(100 mg/kg)可降低蛋鸡体重以及抗氧化能力和蛋品质，影响肝脏和血清中脂肪酸的形成[6-7]。钼(Mo)是一种过渡金属，是身体必需的微量元素，但过量的Mo会引起腹泻、代谢障碍、骨骼形态变化、肝脏与肾脏功能损伤[8-9]。V也是过渡金属，参与蛋白质、核酸、糖和脂类代谢，也被证明当饲粮中含量 > 5 mg/g可以导致蛋白品质的下降和机体的蓄积[10-11]。前人研究报道也证实各种不同的重金属可以通过氧化应激造成繁殖性能衰退，这可能是蛋鸡生产性能和蛋品质下降的主要原因之一[4, 12]。
茶多酚(TP)是茶叶中多酚类物质的总称，主要为儿茶素类(占60%~80%)，是茶叶中有保健功能的主要成分之一。TP具有较强的抗氧化能力，研究表明其抗氧化能力是维生素C的25倍，是维生素E的80倍[13]。添加250~1 000 mg/kg TP可降低产蛋后期的破蛋、软蛋率，延缓鸡蛋哈氏单位下降[14]，我们前期研究也发现600和1 000 mg/kg TP可以缓解由重金属V带来的鸡蛋品质的下降[10]。但是，TP是否可以缓解由于重金属带来的蛋鸡生产性能和蛋品质的下降，尚未见研究报道。
重金属可以通过蓄积到蛋鸡组织和器官引起氧化应激进而危害蛋鸡健康，降低蛋鸡生产性能和蛋品质，而TP是否可以通过缓解氧化应激，进而缓解由重金属带来的生产性能和蛋品质的下降，有待进一步的揭示。因此，本试验以蛋鸡为研究对象，模拟实际生产中存在于饲粮中Cd、Mo和V含量，并根据《饲料卫生标准GB 13078—2017》中对Cd、Pb元素的限定以及结合前人的研究结果，进一步探讨联合重金属暴露对产蛋高峰后期蛋鸡生产性能和血清抗氧化状态的影响以及TP的缓解效应，有利于进一步认识重金属毒性效应，并为缓解畜禽重金属暴露提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料重金属Cd(CdCl2·2.5H2O)、Pb[Pb(NO3)2]、Mo(Na2MoO4·2H2O)和V(NH4VO3)均购买自上海金山亭化学试剂厂。TP产品由四川克鲁尼茶叶生物科技有限公司提供，TP总含量为63.58%，其中儿茶素含量为40.20%，表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)含量为21.97%，咖啡碱含量为6.84%。
1.2 试验设计试验选用300只65周龄健康罗曼粉壳蛋鸡，采用单因素完全随机设计，将蛋鸡分为3组，对照组饲喂基础饲粮，重金属联合暴露(HEM)组在基础饲粮中添加重金属(5 mg/kg Pb+0.5 mg/kg Cd+5 mg/kg V+10 mg/kg Mo)，TP组在HEM组基础上添加TP(1 000 mg/kg)，每组10个重复，每个重复10只(2只/笼)，试验期为5周。基础饲粮为玉米-豆粕型饲粮，参照《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)中蛋鸡营养成分推荐值配制，其组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
每天纪录各组总产蛋数、总蛋重，每周统计采食量，计算日产蛋率、平均蛋重、平均日采食量、软壳蛋率和料蛋比。
1.3.2 蛋品质在试验的第5周结束时，每个重复采集3枚外形完好、重量接近平均蛋重的鸡蛋，共计90枚蛋，采用蛋品质全自动测定仪(日本EMT-7300)对蛋壳厚度、蛋壳强度、蛋白高度、蛋黄颜色、哈氏单位进行测定。用分蛋器将蛋白和蛋黄分离，并对蛋黄、蛋壳、蛋白重量进行测定。
1.3.3 鸡蛋中重金属残留在试验的第5周结束时，每个重复采集2枚鸡蛋，将蛋白和蛋黄充分混匀，称取适量样品，采用微波消解法处理样品，置于4 ℃保存，待测。采用电感耦合等离子质谱仪(ICP-MS)测定鸡蛋中Cd、Pb、V、Mo、铁(Fe)、铜(Cu)、锰(Mn)、锌(Zn)和硒(Se)的含量。
1.3.4 血清抗氧化状态在试验的第5周结束时，每个重复随机挑选2只蛋鸡，每组20只鸡，禁食24 h后从翅静脉抽取10 mL血液，分离血清，-20 ℃保存。血清总抗氧化能力(T-AOC)，总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性，丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)含量均用试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)测定。
1.4 数据处理试验数据采用SAS 9.0的one-way ANOVA程序进行分析，并以Duncan氏法进行多重比较，P≤0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 重金属联合暴露和茶多酚对蛋鸡生产性能的影响由表 2可知，与对照组相比，饲粮中重金属联合暴露使蛋鸡的日产蛋率显著降低了8.26%(P < 0.05)，料蛋比显著增加了16.06%(P < 0.05)，软壳蛋率也显著增加(P < 0.05)。而TP组日产蛋率和料蛋比与对照组相比差异不显著(P > 0.05)。平均蛋重和平均日采食量各组间差异不显著(P > 0.05)。
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表 2 重金属和茶多酚对蛋鸡生产性能的影响 Table 2 Effects of heavy metals and tea polyphenol on performance of laying hens |
由表 3可知，与对照组相比，HEM组蛋壳厚度和蛋黄颜色显著降低(P < 0.05)，蛋壳颜色的亮度(L*)值显著增加(P < 0.05)，红度(a*)和黄度(b*)值显著降低(P < 0.05)；HEM组蛋白高度和哈氏单位较对照组分别降低了20.08%和16.19%(P < 0.05)。TP组的蛋壳厚度和蛋黄颜色显著低于对照组(P < 0.05)；另外，TP组的蛋白高度和哈氏单位显著高于HEM组(P < 0.05)，但与对照组相比没有显著差异(P > 0.05)。蛋黄、蛋白和蛋壳重量各组间无显著差异(P > 0.05)。
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表 3 重金属和茶多酚对蛋品质的影响 Table 3 Effects of heavy metals and tea polyphenol on egg quality of laying hens |
由表 4可知，与对照组相比，HEM组鸡蛋中Fe、Zn和Se的含量显著下降(P < 0.05)，分别下降了23.12%、28.66%和65.43%，而Cd、Pb、V和Mo含量显著上升(P < 0.05)，分别提高了30.42%、21.58%、51.67%和30.66%。TP组鸡蛋中所检测的微量元素和重金属的含量与HEM组具有同样的趋势，但并没有减少重金属Cd、Pb、V和Mo在鸡蛋中的含量。鸡蛋中Cu、Mn含量各组间差异不显著(P > 0.05)。
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表 4 重金属和茶多酚对鸡蛋重金属残留的影响 Table 4 Effects of heavy metals and tea polyphenol on heavy metal retention in eggs of laying hens |
由表 5可知，与对照组相比，HEM组血清中GSH-Px活性和GSH含量分别降低了25.37%和53.97%(P < 0.05)，MDA含量增加了100.00%(P < 0.05)。TP组与HEM组相比，血清中GSH-Px活性和GSH含量显著增加(P < 0.05)，MDA含量有所降低(P > 0.05)，但均与对照组不存在显著差异(P > 0.05)。
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表 5 重金属和茶多酚对蛋鸡血清抗氧化状态的影响 Table 5 Effects of heavy metals and tea polyphenol on serum antioxidant status of laying hens |
Pb和Cd是生产和生活中接触频率大、暴露范围广的蓄积性毒物。本研究发现，重金属联合暴露显著降低了蛋鸡日产蛋率和料蛋比。朱莎等[15]发现饲料Pb污染显著降低了蛋鸡采食量，但并不会影响产蛋率和料蛋比。V是自然界分布极广的元素，饲料原料中特别是磷酸盐中的V含量较高，容易导致鸡尤其是蛋鸡饲粮中V含量过高。研究发现蛋鸡饲粮中添加30 mg/kg V可降低产蛋率、采食量和体增重[16-17]。目前，Mo对蛋鸡生产性能的影响尚未见报道。由此可见，本试验研究中的重金属Pb(5 mg/kg)、Cd(0.5 mg/kg)、V(5 mg/kg)和Mo(10 mg/kg)的含量虽然都比前人研究报道中引起生产性能降低的水平低，但联合暴露可能一定程度上增加了对蛋鸡的毒性作用。
3.2 重金属联合暴露对蛋品质和鸡蛋中重金属残留的影响本研究发现，重金属联合暴露降低了蛋壳厚度、蛋白高度、哈氏单位和蛋壳颜色(蛋壳亮度值更高，红度和黄度值更低)。本研究结果与朱莎等[15]研究结果类似，其研究发现，饲粮中添加Cd(20 mg/kg)或Pb(60 mg/kg)可降低蛋壳厚度，增加软壳蛋率。这可能一方面与重金属通过竞争性抑制直接抑制了细胞对钙的主动转运有关；另一方面与重金属通过损伤肝脏和肾脏功能，降低了维生素D3(VD3)转化为其活性形式1, 25(OH)2D3的能力下降，间接影响钙代谢有关[18-19]。同时, 蛋壳颜色也可以在一定程度上反映蛋鸡机体健康和应激状态。本实验室的前期研究也发现了V具有降低蛋壳颜色、蛋壳厚度和蛋壳强度的作用[10, 20]。蛋白高度和哈氏单位都是鸡蛋新鲜度的指标，其降低代表鸡蛋蛋白品质的下降。本实验室前期研究也同样发现，低于5 mg/kg V可以降低蛋白高度和哈氏单位[10, 20]。具体的机制仍不清楚，可能是由于V抑制了输卵管膨大部的运动引起输卵管膨大部肌肉萎缩[11, 21]。此外, 重金属Cd、Pb、V都是强氧化剂，可以造成输卵管膨大部氧化应激，影响其结构和功能，从而降低蛋白品质。
本研究发现，饲粮中添加不同低剂量Pb、Cd、V和Mo降低了鸡蛋中微量元素的含量，增加了对应重金属Pb、Cd、V和Mo的含量。已有研究表明，微量元素Zn、Cu、Mn、Fe和Se是许多代谢酶和特定抗氧化酶的必要组成部分，在生物学过程中发挥至关重要的作用[12]。其中Zn、Cu和Mn是超氧化物歧化酶(SOD)的活性中心，参与铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn-SOD)和锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)的构成。Cd、Pb、Mo等同属二价金属元素，与Cu、Zn、Mn等微量元素共同转运，相互存在着竞争抑制作用[22]。因此，前者的过量会干扰Cu、Zn、Mn等必需微量元素的代谢过程，使得机体不能正常吸收和利用这些元素，从而降低其在鸡蛋中的沉积。同样的，王倩倩等[23]也发现Pb(100 mg/kg)和Cd (50 mg/kg)联合暴露降低了蛋鸡肝脏和肾脏中Cu、Fe、Zn和Se的含量，但增加了肝脏和肾脏中Pb和Cd的含量。由此可见，重金属对动物的毒性作用可以通过其他元素如钙(Ca)、Cu、Zn和Mn的相互作用，影响矿物元素吸收和微量元素的稳态，从而直接和间接影响其他矿物元素的正常生理功能，进而降低蛋品质和增加重金属在鸡蛋中的残留。
3.3 重金属联合暴露对蛋鸡血清抗氧化状态的影响Cd和Pb在动物体内慢性毒性作用主要通过诱导体内脂质过氧化物的生成，同时抑制抗氧化酶活性，产生大量的氧自由基，使机体产生氧化应激[24]。MDA是脂质过氧化产物，直接反映体内脂质过氧化水平的高低。本研究中，重金属联合暴露增加了蛋鸡血清中MDA含量，证明重金属的联合暴露增加了体内脂质过氧化水平。本试验还发现虽然血清中T-AOC没有受到显著影响，但GSH-Px活性和GSH含量显著下降。有研究报道，Cd进入体内以后，与GSH-Px活性中心-硒代半胱氨酸结合生成复合物，降低GSH-Px活性[25]。本试验的结果与孙涛等[26]和朱莎等[15]结果一致，他们也发现，蛋鸡饲粮中添加Cd和Pb可以增加血液中MDA的含量，降低SOD活性。与Cd导致机体氧化损伤类似，研究发现V也可以通过降低抗氧化酶活性，导致雏鸡和蛋鸡肝脏、肾脏、肠道和输卵管氧化应激[10]。研究表明亚慢性Mo和Cd中毒会造成山羊肝脏抗氧化功能降低，导致细胞增殖分化受阻[27]。由此可见，重金属Cd、Pb、V和Mo均可以一定程度降低蛋鸡机体抗氧化状态，造成氧化应激，这可能是重金属降低生产性能和蛋品质的主要原因。
3.4 茶多酚的缓解效应重金属Cd、Pb、V和Mo可以通过造成氧化应激从而降低动物生产性能和机体健康。但关于TP缓解Cd、Pb和Mo毒性的数据尚未见试验报道，有待进一步的研究。本研究发现，在重金属联合暴露的条件下，给蛋鸡饲喂TP可以一定程度上缓解生产性能、蛋品质和血清抗氧化状态的降低。TP可以保护蛋鸡生产性能和鸡蛋质量的变差可能由于其可以通过清除活性氧或螯合过渡金属发挥抗氧化功能[28]。Wang等[14]发现饲粮中添加TP可以提高产蛋后期蛋鸡机体抗氧化能力，进而提高生产性能和蛋品质。本实验室前期的研究发现600和1 000 mg/kg TP可以缓解由于V导致的鸡蛋蛋品质的下降(提高蛋白高度、哈氏单位和蛋壳颜色)[10]。同时，TP也可以提高V应激下肝脏谷胱甘肽转移酶(GST)和GSH-Px的活性[14]，说明TP缓解V过量导致的鸡蛋蛋品质的下降与其提高机体抗氧化能力密切相关，但具体的机制有待进一步的验证。
4 结论重金属联合暴露引起蛋鸡生产性能和蛋品质降低，增加蛋中对应重金属的残留，降低机体氧化酶活性，而茶多酚TP在一定程度上缓解了重金属联合暴露导致的生产性能、蛋品质降低，这可能与其提高了机体抗氧化状态有关。
| [1] |
CALDAS D, PESTANA I A, ALMEIDA M G, et al. Risk of ingesting As, Cd, and Pb in animal products in north Rio de Janeiro state, Brazil[J]. Chemosphere, 2016, 164: 508-515. DOI:10.1016/j.chemosphere.2016.08.130 |
| [2] |
原泽鸿, 黄选洋, 张克英, 等. 四川省蛋鸡配合饲料及鸡蛋重金属含量分布[J]. 动物营养学报, 2015, 27(11): 3485-3494. DOI:10.3969/j.issn.1006-267x.2015.11.020 |
| [3] |
柏雪, 原泽鸿, 王建萍, 等. 四川省常用能量饲料和蛋白质饲料中重金属分布研究[J]. 动物营养学报, 2016, 28(9): 2847-2860. DOI:10.3969/j.issn.1006-267x.2016.09.024 |
| [4] |
SATO S, MASASHI O, EMOTO T, et al. Restriction of cadmium transfer to eggs from laying hens exposed to cadmium[J]. Journal of Toxicology and Environmental Health, 1997, 51(1): 15-22. DOI:10.1080/00984109708984008 |
| [5] |
SAHAN S, DENIZ G, KUTSAL O, et al. Chronic effects of cadmium on kidney, liver, testis, and fertility of male rats[J]. Biological Trace Element Research, 1991, 31(3): 209-214. DOI:10.1007/BF02990191 |
| [6] |
JURCZUK M, MONIUSZKO-JAKONIUK J, BRZÓSKA M M. Involvement of some low-molecular thiols in the peroxidative mechanisms of lead and ethanol action on rat liver and kidney[J]. Toxicology, 2006, 219(1/2/3): 11-21. |
| [7] |
GURER H, ERCAL N. Can antioxidants be beneficial in the treatment of lead poisoning?[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2000, 29(10): 927-945. DOI:10.1016/S0891-5849(00)00413-5 |
| [8] |
TURNLUND J R, KEYES W R. Plasma molybdenum reflects dietary molybdenum intake[J]. The Journal of Nutritional Biochemistry, 2004, 15(2): 90-95. DOI:10.1016/j.jnutbio.2003.10.003 |
| [9] |
李君.钼致小鼠亚急性肝脏毒性研究[D].硕士学位论文.沈阳: 辽宁医学院.2015. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10160-1015445064.htm
|
| [10] |
YUAN Z H, ZHANG K Y, DING X M, et al. Effect of tea polyphenols on production performance, egg quality, and hepatic antioxidant status of laying hens in vanadium-containing diets[J]. Poultry Science, 2016, 95(7): 1709-1717. DOI:10.3382/ps/pew097 |
| [11] |
EYAL A, MORAN E, Jr. Egg changes associated with reduced interior quality because of dietary vanadium toxicity in the hen[J]. Poultry Science, 1984, 63(7): 1378-1385. DOI:10.3382/ps.0631378 |
| [12] |
HUANG Y L, SHEU J Y, LIN T H. Association between oxidative stress and changes of trace elements in patients with breast cancer[J]. Clinical Biochemistry, 1999, 32(2): 131-136. DOI:10.1016/S0009-9120(98)00096-4 |
| [13] |
YANG C S, LAMBERT J D, SANG S M. Antioxidative and anti-carcinogenic activities of tea polyphenols[J]. Archives of Toxicology, 2009, 83(1): 11-21. DOI:10.1007/s00204-008-0372-0 |
| [14] |
WANG X C, WANG X H, WANG J, et al. Dietary tea polyphenol supplementation improved egg production performance, albumen quality, and magnum morphology of Hy-Line Brown hens during the late laying period[J]. Journal of Animal Science, 2018, 96(1): 225-235. DOI:10.1093/jas/skx007 |
| [15] |
朱莎, 张爱婷, 代腊, 等. 饲料铅污染对蛋鸡生产性能、蛋品质以及抗氧化性能的影响[J]. 动物营养学报, 2012, 24(3): 534-542. DOI:10.3969/j.issn.1006-267x.2012.03.021 |
| [16] |
OUSTERHOUT L E, BERG L R. Effects of diet composition on vanadium toxicity in laying hens[J]. Poultry Science, 1981, 60(6): 1152-1159. DOI:10.3382/ps.0601152 |
| [17] |
KUBENA L F, PHILLIPS T D. Toxicity of vanadium in female Leghorn chichens[J]. Poultry Science, 1983, 62(1): 47-50. DOI:10.3382/ps.0620047 |
| [18] |
STAESSEN J, AMERY A, BERNARD A, et al. Effects of exposure to cadmium on calcium metabolism:a population study[J]. British Journal of Industrial Medicine, 1991, 48(10): 710-714. |
| [19] |
KAZANTZIS G. Cadmium, osteoporosis and calcium metabolism[J]. Biometals, 2004, 17(5): 493-498. DOI:10.1023/B:BIOM.0000045727.76054.f3 |
| [20] |
WANG J P, HE K R, DING X M, et al. Effect of feeding and withdrawal of vanadium and vitamin C on egg quality and vanadium residual over time in laying hens[J]. Biological Trace Element Research, 2017, 177(2): 367-375. DOI:10.1007/s12011-016-0887-9 |
| [21] |
TOUSSANT M J, SWAYNE D E, LATSHAW J D. Morphologic characteristics of oviducts from hens producing eggs of different Haugh units caused by genetics and by feeding vanadium as determined with computer software-integrated digitizing technology[J]. Poultry science, 1995, 74(10): 1671-1676. DOI:10.3382/ps.0741671 |
| [22] |
ZHANG D, GAO J F, ZHANG K R, et al. Effects of chronic cadmium poisoning on Zn, Cu, Fe, Ca, and metallothionein in liver and kidney of rats[J]. Biological Trace Element Research, 2012, 149(1): 57-63. DOI:10.1007/s12011-012-9394-9 |
| [23] |
王倩倩, 陈大伟. 铅镉联合暴露对蛋鸡肝脏、肾脏中多种微量元素含量的影响[J]. 广西畜牧兽医, 2017, 33(1): 20-23. DOI:10.3969/j.issn.1002-5235.2017.01.008 |
| [24] |
LÓPEZ E, ARCE C, OSET-GASQUE M J, et al. Cadmium induces reactive oxygen species generation and lipid peroxidation in cortical neurons in culture[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2006, 40(6): 940-951. DOI:10.1016/j.freeradbiomed.2005.10.062 |
| [25] |
HAN X Y, XU Z R, WANG Y Z, et al. Effect of cadmium on lipid peroxidation and activities of antioxidant enzymes in growing pigs[J]. Biological Trace Element Research, 2006, 110(3): 251-264. DOI:10.1385/BTER:110:3 |
| [26] |
孙涛, 代腊, 唐飞江, 等. 饲料中镉对产蛋鸡生产性能、抗氧化功能及其体内残留的影响[J]. 畜牧兽医学报, 2012, 43(2): 232-241. |
| [27] |
YANG F, ZHANG C, ZHUANG Y, et al. Oxidative stress and cell apoptosis in caprine liver induced by molybdenum and cadmium in combination[J]. Biological Trace Element Research, 173(1): 79-86. |
| [28] |
FREI B, HIGDON J V. Antioxidant activity of tea polyphenols in vivo:evidence from animal studies[J]. The Journal of Nutrition, 2003, 133(10): 3275S-3284S. DOI:10.1093/jn/133.10.3275S |