2. 四川省畜牧科学研究院, 成都 610066
2. Sichuan Animal Science Academy, Chengdu 610066, China
近年来，养兔业集约化发展迅速且科技水平不断提高，早期断奶技术已成为提高母兔繁殖效率的关键技术之一。但早期断奶往往会使得仔兔腹泻率和死亡率大幅上升，造成巨大的经济损失。因此，一直以来，研究者从营养学、免疫学、组织形态学和酶学等多角度探索“早期断奶综合征”的病因，发现其根本原因在于仔兔断奶时身体机能尤其是胃肠道发育不健全。而胃肠道的发育和成熟主要表现在以下几个方面：1)胃肠道及黏膜重量、小肠长度；2)胃、肠液pH和消化酶的活性；3)小肠组织形态及黏膜柱状细胞和杯状细胞的数量；4)肠黏膜免疫功能的发育等[1]。近年来不少研究者通过在畜禽哺乳期饲粮中添加不同的添加剂，在不同程度上促进了断奶时仔畜机体及胃肠道的提前成熟，并且显著改善了断奶后生长发育缓慢、腹泻、体质量下降等问题[2-5]。因此，断奶时胃肠道发育的状况可能是影响仔兔早期断奶技术成败的关键。研究发现，酸化剂和血浆蛋白粉能够提高畜禽的生长性能、抗病力和抗应激力[6-7]，但其研究多集中在猪、鸡上，在哺乳仔兔上的研究还鲜有报道。本试验旨在探讨饲粮中添加酸化剂和血浆蛋白粉对哺乳仔兔生长性能及胃肠道发育的影响，以期为仔兔哺乳期的饲养管理及减轻早期断奶综合征的研究提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验用酸化剂购自美国建明公司，其原料组成为富马酸、乳酸、柠檬酸、丙酸和甲酸，载体为二氧化硅。酸化剂总酸含量为67.54%，其中主要成分含量：富马酸为45.00%、乳酸为19.50%, 有效物质为99%。试验用血浆蛋白粉购自潍坊市普润生物科技有限公司，主要营养成分含量：粗蛋白质≥70%、粗灰分≤12%、水分≤10%、可溶性氧化物≤5%、免疫球蛋白≥16%。
1.2 试验设计选择同期配种和产仔的新西兰经产母兔120窝，且均为3~6胎次之间的健康母兔。对每窝仔兔筛选后进行称重，以保证窝重差异不显著(P＞0.05)。将120窝仔兔随机分为4组，每组5个重复，每个重复6窝，分别饲喂基础饲粮(A组，对照组)、基础饲粮+0.1%酸化剂(B组)、基础饲粮+0.3%血浆蛋白粉(C组)、基础饲粮+0.1%酸化剂+0.3%血浆蛋白粉(D组)。消化能参照INRA(2004)的兔营养数据，其他参照李福昌[8]《家兔营养》的营养需要配制哺乳仔兔基础饲粮，其组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
各组均在18日龄开始补饲，饲养持续到35日龄断奶。所有试验动物均饲养在四川省畜牧科学研究院肉兔繁育基地统一封闭式兔舍内。各组采用统一的饲养管理方法，由同一人饲养，每日07:00和18：00投喂2次，投食量以兔充分吃饱而几乎不留料为准，自由饮水，定期打扫兔舍，疫苗免疫按常规进行，其他饲养管理一切按照兔场规定执行。
1.4 测定指标及方法 1.4.1 生长性能在试验期内每日记录试验兔的死亡情况，并分别在21、28、35日龄08:00测定每窝仔兔的体重。
1.4.2 胃肠道pH在21、28、35日龄早上，每组选10只健康且接近平均体重的仔兔屠宰。迅速打开腹腔，无菌条件下收集胃、十二指肠、空肠、回肠和盲肠内容物1 g左右，用蒸馏水稀释10倍，用PHBJ-290型便携式pH仪测定pH。
1.4.3 胃蛋白酶活性试验兔屠宰后立即取胃内部分食糜，迅速放入离心管中，置入液氮中冷冻, 30 min后取出放入-20 ℃冰柜中备测蛋白酶活性。蛋白酶活性采用安森法测定，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.4.4 小肠隐窝深度和绒毛高度屠宰并取完肠道内容物后，每只试验兔分别截取十二指肠、空肠和回肠中段2 cm组织，用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗干净，迅速放入预先配制好的4%的多聚甲醛溶液中固定。按常规方法制作石蜡切片并用苏木精-伊红染色，按照Sun等[9]的方法测定绒毛高度和隐窝深度。
1.5 数据处理试验数据采用Excel 2010进行初步处理，利用SPSS 19.0统计软件的ANOVA程序进行方差分析，差异显著时采用LSD方法进行多重比较，试验结果以平均值±标准差表示。P < 0.05为差异显著。
2 结果与分析 2.1 酸化剂和血浆蛋白粉对哺乳仔兔生长性能的影响由表 2可知，21日龄时，与对照组相比，各试验组窝重、活仔数和个体均重差异均不显著(P> 0.05)。28日龄时，与对照组相比，各试验组窝重、活仔数差异不显著(P>0.05)，而个体均重分别提高了5.38%、10.53%、16.07%，其中C、D组显著提高(P < 0.05)；各试验组间，C、D组的个体均重显著高于B组(P < 0.05)，C、D组之间差异不显著(P>0.05)。35日龄时，与对照组相比，各试验组个体均重分别提高了5.56%、11.70%、18.66%，其中C、D组显著提高(P < 0.05)，而各试验组间差异不显著(P>0.05)。
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表 2 酸化剂和血浆蛋白粉对哺乳仔兔生长性能的影响 Table 2 Effects of acidifiers and spray-dried plasma protein on growth performance of suckling rabbits |
由表 3可知，21日龄时，与对照组相比，各试验组仔兔胃肠道的pH均无显著差异(P>0.05)。28日龄时，与对照组相比，B、D组仔兔胃pH分别降低了18.72%、17.02%，十二指肠pH分别降低了4.46%、4.74%，且均达到了显著水平(P < 0.05)；C组仔兔胃肠道的pH均无显著差异(P>0.05)；35日龄时，与对照组相比，B、D组仔兔胃pH分别降低了24.57%、22.84%，十二指肠pH分别降低了7.89%、7.46%，且均达到了显著水平(P < 0.05)；C组仔兔胃肠道的pH均无显著差异(P>0.05)。
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表 3 酸化剂和血浆蛋白粉对哺乳仔兔胃肠道pH的影响 Table 3 Effects of acidifiers and spray-dried plasma protein on pH of gastrointestinal tract of suckling rabbits |
由表 4可知，28日龄时，与对照组相比，B、D组胃蛋白酶活性分别提高了10.26%、12.83%，且D组显著提高(P < 0.05)，但B、D组之间差异不显著(P>0.05)；C组胃蛋白酶活性无显著差异(P>0.05)。35日龄时，与对照组相比，B、D组胃蛋白酶活性分别提高了15.84%、21.07%(P < 0.05)，B、D组间差异不显著(P>0.05)；C组胃蛋白酶活性无显著差异(P>0.05)。
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表 4 酸化剂和血浆蛋白粉对哺乳仔兔胃蛋白酶活性的影响 Table 4 Effects of acidifiers and spray-dried plasma protein on pepsin activity of suckling rabbits |
由表 5可知，28日龄时，与对照组相比，C组仔兔十二指肠、空肠、回肠绒毛高度分别提高了2.95%、4.79%、4.22%，D组分别提高了5.18%、8.86%、5.29%，且D组达到了显著水平(P < 0.05)；在试验组之间，D组显著高于B组，但与C组无显著性差异(P>0.05)。35日龄时，与对照组相比，C组十二指肠、空肠、回肠绒毛高度分别提高了5.56%、10.36%、4.48%，D组分别提高了6.74%、14.33%、6.29%，且C、D组均达到了显著水平(P < 0.05)；在各试验组之间，C、D组显著高于B组(P < 0.05)，C、D组之间无显著差异(P>0.05)。
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表 5 酸化剂和血浆蛋白粉对哺乳仔兔肠道绒毛高度的影响 Table 5 Effects of acidifiers and spray-dried plasma protein on intestinal villus height of suckling rabbits |
由表 6可知，28日龄时，与对照组相比，C组十二指肠、空肠、回肠隐窝深度分别降低了7.46%、9.85%、9.95%，D组分别降低了12.76%、15.66%、12.19%，且D组达到了显著水平(P < 0.05)；各试验组之间，D组显著高于B组(P < 0.05)，但与C组无显著性差异(P>0.05)，B、C组之间无显著性差异(P>0.05)。35日龄时，C组十二指肠、空肠、回肠隐窝深度分别降低了13.50%、19.10%、17.67%，D组分别降低了20.48%、23.41%、21.62%，且C、D组均达到了显著水平(P < 0.05)，在各试验组之间，C、D组显著高于B组(P < 0.05)，C、D组之间无显著性差异(P>0.05)。
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表 6 酸化剂和血浆蛋白粉对哺乳仔兔肠道隐窝深度的影响 Table 6 Effects of acidifiers and spray-dried plasma protein on intestinal crypt depth of suckling rabbits |
仔兔断奶体重和成活率的高低直接关系到育种质量和肉兔的肥育效果，同时也会影响养兔生产的经济效益，因此，仔兔的成活率及断奶体重也就成为衡量养兔生产水平的重要指标。研究表明，饲粮中添加适量的血浆蛋白粉和酸化剂均能改善畜禽的生长性能。Gao等[10]对4日龄的新生仔猪进行研究，发现血浆蛋白粉可以显著提高4日龄仔猪的平均日增重和平均日采食量，仔猪4~21日龄的平均日增重可以提高到260 g/d，与母猪哺乳的仔猪平均日增重水平相近。Van Dijk等[11]统计分析发现，在仔猪饲粮中添加血浆蛋白粉，仔猪断奶后2周的平均日增重和平均日采食量分别提高了26.8%和24.5%。Abdel-Fattah等[12]研究发现，在肉鸡饲粮中添加有机酸化剂，能够显著改善其体增重和饲料转化率。Li等[13]在仔猪的饲粮中添加0.5%的有机酸化剂发现，断奶仔猪的体增重和饲料转化效率显著提高。潘孝青等[14]研究表明，在基础饲粮中添加0.2%的苹果酸能够显著提高断奶仔兔的体增重，在21 d结束时，比对照组提高了5.98%。本研究结果显示，哺乳仔兔饲粮中添加血浆蛋白粉或同时添加血浆蛋白粉与酸化剂均能显著提高28、35日龄的个体均重，且同时添加组要优于血浆蛋白粉组，说明酸化剂和血浆蛋白粉具有一定的协同效应。这可能是因为血浆蛋白粉含有蛋白质、脂肪、碳水化合物及一些必需的常量和微量矿物质元素等营养成分，还含有免疫球蛋白、促生长因子、干扰素、激素、溶菌酶等免疫活性物质，能够提高仔畜的生长性能[15-16]。而酸化剂可以直接刺激口腔内的味蕾细胞，增加唾液的分泌量，掩盖饲粮中的不良气味，有效改善饲粮的风味，增强食欲，提高采食量，并且间接性地抑制胃蠕动，降低胃排空的速度，使营养物质有更多的时间在胃内消化，减轻小肠负担，从而提高消化率。
3.2 酸化剂和血浆蛋白粉对哺乳仔兔胃肠道pH的影响胃肠道pH是影响动物体消化系统发挥正常生理功能的重要因素之一，在动物消化、吸收营养物质过程中起着关键作用。消化道内偏酸性的环境(pH < 7.0)不仅有利于维持消化酶的活性、促进食物消化，还有助于乳酸杆菌等有益菌的生长繁殖[17]。本研究结果显示，28和35日龄时，酸化剂组和同时添加组的胃及十二指肠pH显著低于对照组。这与Rice等[18]报道，在断奶仔猪饲粮中添加3.0%柠檬酸，胃内容物的pH显著低于对照组以及Paul等[19]在肉鸡饲粮中添加1.5%有机酸盐能够降低肉鸡胃肠道pH的结果一致。添加酸化剂对于空肠、回肠和盲肠起不到增加酸度的效果，可能是因为部分未经保护处理的酸化剂容易与饲料原料结合，也可能在仔猪消化道中还未产生酸化作用就已经被吸收，因此很难到达后面的肠道发挥作用。
3.3 酸化剂和血浆蛋白粉对哺乳仔兔胃蛋白酶活性的影响早期哺乳仔兔消化系统发育不完善，自身分泌胃酸不足，加上教槽料系酸力强，结合了许多游离酸，导致仔兔胃肠道酸度达不到各种消化酶发挥作用所需的pH范围。添加酸化剂可以降低饲粮的pH，进而降低仔兔胃肠道的pH，为胃蛋白酶等消化酶发挥作用提供适宜的酸性环境。而消化酶活性的提高不仅可以促进机体消化系统对营养成分的消化吸收，还能促进肠道内有益菌群的增殖，提高消化效率，最终促进动物生长。冷向军等[20]研究表明，胃蛋白酶原激活率与pH有关，pH越低，胃蛋白酶原激活率越高，在体外试验中，随pH下降，胃蛋白酶原激活率呈三次曲线上升。肖芹等[21]研究发现饲粮中添加复合酸化剂对42日龄肉鸡的消化道pH和消化酶活性影响显著，并且复合酸化剂添加水平为0.1%时，肉鸡消化能力最优。本研究结果显示，饲粮中添加酸化剂可以显著提高28和35日龄仔兔胃蛋白酶活性。这可能是因为进入肠道的酸化剂在一定程度上降低胃肠道pH，提高胃肠道酸度，激活蛋白酶原，同时直接刺激消化酶活力；另外，酸化剂可以诱导胰岛素和胰高血糖素的合成分泌[22]，而胰岛素能增加胰淀粉酶的释放，并通过和胰腺腺泡细胞上的特异受体结合，调节胰消化酶的生物合成。
3.4 酸化剂和血浆蛋白粉对哺乳仔兔小肠绒毛高度和隐窝深度的影响小肠是机体营养物质消化、吸收和转运的主要部位。良好的小肠黏膜结构对完善消化生理功能，促进机体生长发育尤为重要。小肠黏膜上皮绒毛变短、隐窝加深意味着肠道黏膜上皮绒毛萎缩，吸收能力下降；绒毛加长，隐窝变浅，两者比值增大，说明肠内膜面积较大，消化吸收能力较强[23]。本研究结果显示，28日龄时，血浆蛋白粉和酸化剂同时添加组的绒毛高度和隐窝深度与对照组存在显著差异；35日龄时，血浆蛋白粉组和同时添加组的绒毛高度、隐窝深度与对照组和酸化剂组都存在显著差异，且同时添加组要略微优于血浆蛋白粉组。这说明酸化剂和血浆蛋白粉有一定的协同效应。
研究发现，血浆蛋白粉可以改善小肠形态，维持肠道黏膜的完整性。其原因可以从血浆蛋白粉对细胞因子的调控来解释：γ干扰素和肿瘤坏死因子-α的释放可以影响肠上皮的通透性，这2种细胞因子可减少紧密连接蛋白-1和闭合蛋白的表达，从而使上皮细胞的通透性增加，恶化小肠形态；Nofrarías等[24]研究发现，给断奶仔猪饲喂血浆蛋白粉可以降低血液中的免疫细胞亚群的比例。对于大肠杆菌脂多糖刺激的断奶仔猪，饲粮中添加7%的血浆蛋白粉可以降低促炎细胞因子的表达[25]。从而缓解紧密连接蛋白表达的抑制，维护小肠形态的正常发育。
也有研究认为，仔猪小肠绒毛高度降低和隐窝深度增加与纹状缘蔗糖酶和乳糖酶活性下降相关。蔗糖酶和乳糖酶是仔猪小肠中重要的碳水化合物分解酶，而小肠内容物的酸度会影响消化酶的分泌和活性[26]。晏家友等[27]在断奶仔猪的饲粮中添加微胶囊型复合酸化剂进行试验后推测，可以通过降低断奶仔猪肠道pH，增强小肠消化酶活性，从而改善肠组织形态。也有研究认为，酸性pH可以影响细胞的生长，pH减小可促进细胞分裂。这也解释了本试验中同时添加组的小肠绒毛高度与隐窝深度要优于血浆蛋白粉组的现象，但由于本试验中所添加的酸化剂没做任何缓释保护，几乎没有到达小肠后半段，所以对空肠、回肠的绒毛高度与隐窝深度起不到明显的作用。
4 结论① 饲粮中添加0.1%的酸化剂或0.3%血浆蛋白粉均能提高哺乳仔兔28、35日龄的个体均重，且酸化剂和血浆蛋白粉同时添加效果要优于单个添加。
② 饲粮中添加0.1%的酸化剂能显著降低哺乳仔兔28、35日龄胃和十二指肠的pH，并且显著提高胃蛋白酶活性。
③ 饲粮中添加0.3%的血浆蛋白粉能显著改善哺乳仔兔28、35日龄的绒毛高度和隐窝深度。
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