我国饲料资源匮乏,且原料价格昂贵,寻找廉价、高产及高效的饲料资源尤为重要。辣木(Moringa oleifera Lam.)是一种多年生落叶乔木,原产于印度、非洲等地,目前广泛种植于热带和亚热带国家和地区[1],能在降雨250~3 000 mm、土壤pH 5.0~9.0的环境中生长,适应性强,耐高湿、耐贫瘠[2]。辣木生长速度较快,3个月即可收获枝叶,辣木鲜叶年产量250 t/hm2,在气候适宜、管理良好的情况下,产量甚至可达1 000 t/hm2[3],是一种有独特经济价值、尚未充分开发的热带植物,享有“奇迹之树”和“植物钻石”的美誉[4]。我国20世纪中后期开始引种辣木,主要在广东、福建、广西、云南、台湾及海南等省份种植,其中云南省种植最多,产量也最大,占中国辣木市场的2/3。研究发现,辣木叶中含有抗坏血酸、黄酮类、酚类和胡萝卜素等多种抗氧化成分,以及多糖、生物碱、水溶性蛋白质等生物活性成分[5-6],具有促消化、通便、降低血压和胆固醇[7]、调节甲状腺激素[8]及杀菌抗炎等特性,可外敷用于治疗溃疡、皮肤感染及腺体增生。据报道,辣木产品能够提高肉鸡增重及免疫功能[9-12]。但是对于辣木提取物在肉鸡饲粮添加的安全限量问题未见报道。因此,本试验通过在饲粮中添加中等及高剂量的辣木提取物,研究其对爱拔益加(AA)肉鸡生长性能、抗氧化功能、血液学指标、脏器指数、消化及免疫系统各器官组织病理学的影响,确定辣木提取物在肉鸡饲粮中的安全添加限量。
1 材料与方法 1.1 试验动物及饲粮选用购自北京华都肉鸡公司的健康1日龄AA肉鸡288只,平均体重为(45±2) g。试验采用玉米-豆粕-杂粕型基础饲粮,参照《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)配制,其组成及营养水平见表 1。
本试验采用单因素完全随机试验设计,将288只肉鸡随机分为3个组,每组6个重复,每个重复16只。对照组饲喂基础饲粮,试验组饲喂分别在基础饲粮中添加0.75和10.00 g/kg辣木提取物的饲粮。辣木提取物由四川伟康生物科技有限公司提供,含25%的辣木叶水提物和75%的麦芽糊精,其中包含0.92%总黄酮、0.87%总皂苷和1.84%植物多糖。试验组以辣木提取物等比例替代基础饲粮中的沸石粉。试验期6周。每天观察试验鸡的精神状态、食欲及粪便情况,记录死亡只数,按常规程序进行预防免疫。
1.3 样品采集与测定 1.3.1 生长性能试验于肉鸡21和42日龄,鸡只空腹12 h后,分别对每个重复鸡进行称重、结料。计算1~21日龄、22~42日龄和1~42日龄肉鸡平均体重、平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F/G)和死淘率。
1.3.2 样品采集于肉鸡21和42日龄时,每重复随机挑选肉鸡各1只,翅下采血,测定21和42日龄肉鸡的血常规指标、血清生化指标及42日龄肉鸡的血清及肝脏抗氧化指标。全血采集10 mL,置于一次性真空采血管(内含分离胶与促凝剂)内,室温静置l h后,3 500 r/min离心10 min制备血清,分装于EP管中-20 ℃冰箱保存;另外5 mL血液收集于含乙二胺四乙酸二钾(EDTA-2K)抗凝剂的EP管,30 min之内进行血常规测定。42日龄时,肉鸡采血后屠宰,立即分离心脏、肝脏、脾脏、嗉囊、肌胃、十二指肠、空肠、回肠和盲肠,用滤纸吸去血渍、剔除脂肪后称鲜重以计算组织器官指数。采集10 g肝脏用锡箔纸包好,液氮速冻用于抗氧化指标的测定,并将十二指肠、空肠、回肠、盲肠、胸腺、心脏、肝脏、肺、肾脏、脾脏、胰腺和肌胃保存于福尔马林溶液用于制作组织病理切片。
1.3.3 指标测定 1.3.3.1 器官指数和抗氧化功能器官指数(%)=器官重量/宰前活重。
肝脏样品解冻后,用生理盐水冲洗干净并用滤纸吸干后称重,肝脏与生理盐水按1 : 9(质量体积比)比例冰浴匀桨,用冷冻离心机4 ℃下8 000 r/min离心20 min,取上清液测定抗氧化指标。血清及肝脏中的丙二醛(malonddialdehyde,MDA)含量和总抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)测定采用硫代巴比妥酸法,所用试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.3.3.2 血常规与血清生化指标采用日立7160全自动生化仪测定血清中的胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、葡萄糖(GLU)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和尿素(UREA)含量以及谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH)和碱性磷酸酶(ALP)活性。采用全自动血细胞分析仪进行血常规检查,包括白细胞(WBC)和红细胞(RBC)数量、血红蛋白(HGB)含量、红细胞压积(HCT)、红细胞平均体积(MCV)、平均血红蛋白(MCH)含量、平均血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞分布宽度(RDW)、血小板(PLT)数量、血小板平均体积(MPV)、血小板分布宽度(PDW)以及淋巴细胞(LYM)、单核细胞(MON)、中性粒细胞(NEUT)、嗜酸性粒细胞(EOS)、嗜碱性粒细胞(BAS)含量及比例。
1.3.3.3 组织器官病理切片将固定好的标本经水洗、脱水、透明等步骤处理,再用石蜡包埋,冷却凝固后,制作厚度5 μm的连续切片,苏木精-伊红染色,树脂封片。在石蜡切片中选出典型视野,采用荧光倒置显色镜检查组织病变。
1.4 统计分析试验数据采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析,LSD法进行两两比较检验,以P < 0.05作为差异显著性判断标准,结果用平均值±标准差(mean±SD)表示。
2 结果 2.1 辣木提取物对肉鸡生长性能的影响由表 2可知,饲粮添加辣木提取物显著提高42日龄肉鸡体重及1~21日龄和1~42日龄ADG(P < 0.05),对各阶段ADFI均无显著影响(P>0.05),但有降低F/G的趋势(P>0.05)。
由表 3可知,饲粮添加辣木提取物对42日龄肉鸡消化器官和免疫器官指数无显著影响(P>0.05)。
由表 4可知,饲粮添加辣木提取物显著提高了42日龄肉鸡血清T-AOC(P < 0.05),显著降低了42日龄肉鸡血清MDA含量(P < 0.05),2个添加剂量组间无显著差异(P>0.05)。饲粮添加辣木提取物对42日龄肉鸡肝脏T-AOC和MDA含量均无显著影响(P>0.05),有提高肝脏T-AOC的趋势。
由表 5和表 6可知,饲粮添加辣木提取物对21和42日龄肉鸡血清生化指标没有显著影响(P>0.05)。
由表 7和表 8可知,饲粮添加0.75 g/kg辣木提取物显著提高了21日龄肉鸡MPV(P < 0.05);饲粮添加0.75和10.00 g/kg辣木提取物显著提高了21日龄肉鸡PDW(P < 0.05);饲粮添加辣木提取物对21日龄肉鸡其他血常规指标的作用效果不显著(P>0.05)。饲粮添加辣木提取物对42日龄肉鸡血常规指标无显著影响(P>0.05)。
由表 9可知,饲粮添加辣木提取物可以降低肉鸡的死淘率(因死淘鸡只数较少,没有进行统计分析)。
饲粮添加10.00 g/kg辣木提取物对42日龄肉鸡十二指肠、空肠、回肠、盲肠、胸腺、心脏、肝脏、肺、肾脏、脾脏、胰腺、肌胃、腺胃和肾脏病理学的影响见图 1。其总体诊断印象为:各组鸡的组织结构未见明显异常现象。
本试验中,与对照组相比,在肉鸡饲粮中添加辣木提取物显著增加了42日龄肉鸡体重以及各阶段的ADG,这与El Tazi[13]的研究结论是一致的,即饲喂添加辣木叶的饲粮能显著提高肉鸡的体重。Kakengi等[14]也报道过饲粮中添加辣木叶能显著提高各个阶段的ADG。出现这一结果,一方面是由于辣木提取物有丰富的黄酮类物质,能促进蛋白质合成以及肌肉的生长[15];另一方面,辣木叶中有丰富的维生素C、烟酸和叶酸等物质,其中维生素C可以促进动物机体的新陈代谢,而烟酸、叶酸作为B族维生素可以促进机体消化系统的健康,对动物机体的生长发育有促进作用。本试验中,与对照组相比,饲粮添加辣木提取物对肉鸡的ADFI和F/G均无显著影响,但有降低F/G的趋势。Oke等[11]的试验证实饲粮中添加12 g/kg的辣木叶对肉鸡的F/G无显著影响,与本试验结果相一致。辣木提取物是对辣木叶进行了提纯,多糖、黄酮等生物活性成分的纯度比辣木叶要高以至于有效性也有所提高,这可能是本试验中试验组F/G与对照组相比有降低趋势的原因。
3.2 辣木提取物对肉鸡器官指数的影响器官指数对健康动物来说相对稳定,其大小的变化能反映器官充血、增生或萎缩及退行性变化等。此外,器官指数也可旁证组织形态学改变的可能性[16]。本研究表明,饲粮添加0.75和10.00 g/kg的辣木提取物对42日龄肉鸡的消化器官和免疫器官指数的作用效果均不显著。这与本研究中添加0.75和10.00 g/kg的辣木提取物未引起42日龄肉鸡血常规指标和血清生化指标变化的结果相应。
3.3 辣木提取物对肉鸡血清生化指标与血常规指标的影响血清生化指标是指血清中的一些酶和蛋白质,这些小分子酶和蛋白质可以反映机体新陈代谢、免疫调节、能量传递、组织细胞通透性以及生长发育等的改变,从而借此间接了解动物机体健康状况,血清生化指标的变化也是机体一些组织和器官将要损害的前导信号[17]。血清ALT、AST和ALP活性可反映肝功能,肝脏受到损伤时,其活性将会高于正常范围[18]。血清TP含量反映了机体蛋白质的代谢状况,ALB是血清中含量最高的蛋白质,具有增加抗体、提高免疫力等作用[19]。万家余等[20]研究表明,血清UREA含量能反映机体蛋白质和氨基酸的代谢状况,并可作为蛋白质沉积的一个指标。氨基酸平衡良好时,血清UREA含量下降;UREA含量直接反映动物体内蛋白质的分解代谢水平。血清TC和TG含量则反映体内脂类代谢情况,脂类在体内运输发生障碍时,血脂含量会升高。本研究表明,饲粮添加辣木提取物对21和42日龄肉鸡血清生化指标均没有显著影响,说明添加10.00 g/kg辣木提取物对于肉鸡的肝脏、肾脏等器官和肌肉以及蛋白质和脂类代谢均没有不利影响。这与Ewuola等[21]研究用辣木提取物饲喂怀孕及妊娠兔子各项血清指标活性也没有显著变化一致。而张幸怡等[22]发现,奶牛饲喂添加了辣木梗叶的饲粮,血清TG含量出现了显著的下降,其他血清指标并无显著差异,与本试验TG含量无显著差异不一致。本试验中,肉鸡血清TG含量有下降的趋势但不显著,TG含量下降是因为辣木中含有多种丰富的天然活性成分尤其是黄酮类、皂苷类、多糖类和挥发油等成分,其中植物固醇物质如β-谷甾醇、菜油甾醇等有降低胆固醇吸收的功效且无副作用;另外,黄酮有抗氧化作用,可防止肝脏的脂质过氧化,减少胆固醇以及脂质合成,从而维持脂类动态平衡[23]。
血液常规检查是全身体检中的基本体检项目,它的意义在于可以发现许多全身性疾病的早期迹象,诊断动物是否健康[24-25]。本研究发现,与对照组相比,饲粮添加0.75 g/kg辣木提取物显著提高了21日龄肉鸡MPV和PDW,添加10.00 g/kg辣木提取物显著提高了21日龄肉鸡PDW,对其他指标的作用效果不显著;饲粮添加辣木提取物对42日龄肉鸡血常规指标无显著影响。MPV定义为单个PLT体积的平均值,而PDW能反映MPV的差异程度,PDW越高,说明PLT体积大小不均,差异度大;PDW越低,PLT均一性越高[26]。不过,本试验中,饲粮添加0.75 g/kg辣木提取物在肉鸡21日龄出现MPV与PDW的升高并不是伴随着PLT的数量变化,而且变化是在正常范围内的;此外,42日龄肉鸡MPV与PDW与对照组相比也没有出现显著变化,也证明添加辣木提取物对动物的健康状况并未产生不利影响。
3.4 辣木提取物对肉鸡血清和肝脏抗氧化指标的影响动物机体在氧化代谢过程中不断产生自由基,具有强氧化性,机体对自由基的清除主要依赖于机体完整的抗氧化防御系统的预防性或阻断性控制,从而保护机体组织和细胞免受自由基的氧化损伤[27]。T-AOC是衡量机体抗氧化系统功能状态的综合性指标,反映机体的抗氧化能力。MDA是自由基作用于脂质后发生的过氧化反应的终产物,是脂质过氧化强度和膜系统损害程度的重要指标。本研究结果表明,与对照组相比,试验组血清T-AOC显著升高,说明辣木提取物可提高肉鸡机体的抗氧化能力;试验组血清MDA含量显著下降,说明辣木提取物减少了机体内脂质的过氧化,保护了细胞的完整性。有研究发现辣木叶中含有抗坏血酸、黄酮类、酚类和胡萝卜素等多种抗氧化成分,以及多糖、生物碱及水溶性蛋白质等生物活性成分[5-6],辣木叶中的水溶性多糖可清除羟自由基及超氧阴离子,发挥抗氧化作用[28]。而辣木提取物中也保留这些成分,所以辣木提取物也可以有效改善肉鸡的抗氧化能力。这一结果与张幸怡等[29]用辣木叶粉饲喂大鼠得到的结果一致,辣木叶添加可以显著提高血清T-AOC,降低MDA含量,提高试验动物的抗氧化能力。
3.5 辣木提取物对肉鸡死淘率及组织病理学的影响本研究发现,饲粮添加10.00 g/kg辣木提取物不会影响42日龄肉鸡十二指肠、空肠、回肠、盲肠、胸腺、心脏、肝脏、肺、肾脏、脾脏、胰腺、肌胃和腺胃的形态结构,也未出现器质性病变,这与本研究肉鸡血液学指标和脏器指数未发生显著变化的结果相一致。而且与对照组相比,试验组的死淘率有明显的下降,10.00 g/kg辣木提取物添加组的死淘率最低,说明10.00 g/kg辣木提取物对肉鸡未产生不利影响。
4 结论在本试验条件下,通过研究添加0.75(普通剂量)和10.00g/kg(高剂量)辣木提取物对肉鸡的生长性能、血清生化指标、血清和肝脏的抗氧化指标、血常规指标、肠道等器官相指数、死淘率及肝脏等组织的病理学观察的影响,表明饲粮中添加辣木提取物可以提高肉鸡的增重,提高肉鸡的抗氧化功能,降低肉鸡死淘率,在肉鸡饲粮中添加≤10.00 g/kg的辣木提取物是安全的。
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