霉菌毒素是一组结构多样的次生代谢产物,常见于温带地区的谷类作物和谷类食品[1-3]。食品和饲料成分中霉菌毒素污染广泛存在,并且已知脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)和黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1, AFB1)会危害动物和人类的健康[4-5]。DON和AFB1分别是由禾谷镰刀菌和黄曲霉菌产生的次级代谢产物,也是饲料污染中最常见的2种霉菌毒素[6-7]。
肠道作为机体与外界物质接触的第1道屏障,不仅可以阻止异型生物质如天然毒素、微生物以及霉菌毒素等的入侵,同时也极易成为外源性物质的攻击靶标。人们普遍认为,肠道菌群在健康和疾病中具有重要作用[8-9]。肠道菌群不仅形成黏膜屏障,而且还参与食物消化,刺激免疫力;同时,它们还被看作是内在的环境因素。肠道黏膜屏障完整性的破坏通常发生在各种病理学中,可引起生态失调和致病性细菌移位。肠道内的生态失调可以增加肠道的通透性[10-11]。
目前,国内外对霉菌毒素的毒性研究大多局限于单一毒素,对DON与AFB1的联合毒性对肠道菌群影响的研究国内外研究报道甚少。高通量测序技术是通过分析测序序列的构成来分析特定环境中微生物群体的构成情况或基因的组成以及功能,以便于分析特定环境中菌群的多样性和丰度[12]。因此,本试验采用Illumina HiSeq高通量测序技术研究DON与AFB1单一及联合染毒对小鼠肠道菌群的影响,阐明其肠道菌群结构的变化,筛选肠道内对DON与AFB1的敏感菌群,为安全评价饲料中的霉菌污染探索新的路径和方法。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验所用DON(纯度≥98.0%)和AFB1(纯度≥98.0%)标准品均购于美国Sigma公司。试验动物为18日龄昆明系雄性小鼠[体重为(14±1) g],购于爱尔麦特科技有限公司。
1.2 试验设计将96只小鼠随机分成4组(对照组、DON组、AFB1组、DON+AFB1组),每组4个重复,每个重复6只。DON组、AFB1组、DON+AFB1组分别按500 μg/kg DON、200 μg/kg AFB1、500 μg/kg DON+200 μg/kg AFB1的染毒剂量灌胃,对照组灌服与染毒组相同剂量(1 mL)的生理盐水。试验期45 d。
1.3 饲养管理饲养试验开始前先对所有器具(饮水器、鼠笼等)进行清洗并用新洁尔灭进行消毒,小鼠饲养实验室通风24 h。
试验期间,每天观察各组小鼠的精神状态,每3 d更换1次垫料,饲养期间室温为25~26 ℃,保证周围环境清洁卫生。预饲7 d后开始正式试验,每天09:00—11:00各组小鼠按照试验设计进行灌胃,持续灌胃45 d。试验期间小鼠自由采食市售商品鼠粮(其主要营养水平如下:水分含量10%、粗蛋白质含量20%、粗脂肪含量4%、粗纤维含量5%、粗灰分含量8%、钙含量1.0%~1.8%、总磷含量0.6%~1.2%、赖氨酸含量1.32%、蛋氨酸+半胱氨酸含量0.78%),自由饮水。
1.4 样品采集试验开始前(第0天),随机选取3只小鼠,采取颈椎脱臼法将小鼠处死,在无菌条件下采取小鼠直肠内的新鲜粪便置于1.5 mL高压灭菌冻存管中,-80 ℃超低温冰箱保存。试验结束时(第45天),每组随机选取3只小鼠,采取颈椎脱臼法将小鼠处死,在无菌条件下采取小鼠直肠内的新鲜粪便置于1.5 mL高压灭菌冻存管中,-80 ℃超低温冰箱保存。
1.5 指标检测 1.5.1 DNA测序每组分别选取3份粪便样品,每份准确称取0.2 g置于2 mL离心管中,采用粪便DNA提取试剂盒提取粪便DNA,Qubit Fluorometer测定DNA浓度,琼脂糖凝胶电泳检测纯度(琼脂糖凝胶浓度:1%;电压:150 V; 时间:40 min),随后将DNA样品送往深圳华大基因股份有限公司测序分析。
1.5.2 文库构建对检测合格的DNA样品构建文库:首先,回收目的Amplicon片段,用T4 DNA Polymerase、Klenow DNA Polymerase和T4 PNK将打断形成的黏性末端修复成平末端;然后,通过3′端加碱基“A”,使得DNA片段能与3′端带有“T”碱基的特殊接头连接;或者设计合成含有测序接头的双Index融合引物,以基因组DNA为模板,进行融合引物PCR,磁珠筛选目的Amplicon片段;最后,用合格的文库进行Cluster制备和测序。
1.5.3 生物信息分析经过数据过滤,滤除低质量的reads,剩余高质量的Clean Data方可用于后期分析;通过reads之间的Overlap关系将reads拼接成Tags;在给定的相似度下将Tags聚成操作分类单元(operational taxonomic units,OTU),然后通过OTU与数据库比对,对OTU进行物种注释;基于OTU和物种注释结果进行样品物种复杂度分析以及组间物种差异分析。
1.5.4 数据统计在进行数据处理过滤时[13],对原始的测序数据进行如下处理获得Clean Data,具体步骤如下:1)采取按窗口去低质量的方法,具体操作如下为设置30 bp为窗口长度,如果窗口平均质量值低于20,从窗口开始截除reads末端序列,移除最终reads长度低于原始reads长度75%的reads;2)去除接头污染reads(默认adapter序列与reads序列有15 bp的overlap,设置为15 bp,允许错配数为3);3)去除含N的reads;4)去除低复杂度reads(默认reads中某个碱基连续出现的长度≥10,设置10 bp)。
如果样品通过barcode合并建库,得到Clean Data后,利用barcode序列通过内部撰写的程序对样品进行拆分。barcode序列与测序reads比对允许的错配个数为0。
1.5.5 序列拼接序列拼接使用FLASH(v1.2.11)软件[14],利用重叠关系将双末端测序得到的成对reads组装成1条序列,得到高变区的Tags。
1.5.6 物种分类及丰度分析将经过上述处理的Clean Tags进行OTU聚类,然后通过对OTU注释完成OTU的物种分类。利用USEARCH(v7.0.1090)软件[15]将拼接好的Tags聚类为OTU。得到OTU代表序列后,通过RDP classifer(v2.2)软件将OTU代表序列与数据库比对进行物种注释,置信度阈值设置为0.6。
1.6 数据统计与分析肠道菌群在门和纲水平上的丰度数据均以平均值±标准差(mean±SD)表示,采用SPSS 20.0统计软件进行单因素方差分析,组间多重比较采用LSD法进行,P < 0.05为差异显著。
2 结果与分析 2.1 小鼠粪便样本物种丰度及多样性由表 1可知,各组样本的有效序列数均在31 651~35 062之间,覆盖度也都约等于1.00(保留2位小数后),说明了该测序结果已基本覆盖样本的多样性。运用Mothur(v1.31.2)软件计算97%相似度水平上各样本的OTU数量,在各样本中,OTU数量最多为433,最少为346,表明小鼠直肠内容物中微生物的丰富度较高。
为了分析样本量的增加对物种丰富度的影响,引进了物种积累曲线,如图 1所示。从图中可以看出,随着样本量的加大,曲线急剧上升,说明此样本群落中有大量物种被发现,然后曲线逐渐平稳,说明样本量充分,能够用于估计物种丰富度。
通过Venn图(图 2)分析各组小鼠之间独有和共有OTU数,从而比较各组间物种组成重叠程度和相似度。其中,第0天时独有18个OTU;对照组独有12个OTU;DON组独有14个OTU;AFB1组独有12个OTU;DON+AFB1组独有6个OTU。对照组OTU总数为546个,与第0天共有的OTU数为361个,说明小鼠肠道细菌物种会随着生长发育而发生改变。对照组和试验组共有的OTU数为331个,说明毒素降低了小鼠之间的肠道菌群的相似度。
依据随机抽到的序列数与观测到的OTU数构建的稀释曲线如图 3所示。由稀释曲线图可知,各样本曲线逐渐趋于平缓,说明有效测序数已经能够较好地覆盖细菌物种的多样性。
门水平上物种分布如图 4所示。由图可知,通过Illumina HiSeq测序,共检测到11个菌门,有3个优势菌群(丰度>0.5%为优势菌群),分别是拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria),这些3个菌门的微生物数占小鼠直肠微生物总数的93.01%以上。
由表 2可知,对照组拟杆菌门的丰度与第0天相比极显著降低(P < 0.01);DON组、AFB1组以及DON+AFB1组拟杆菌门的丰度与对照组相比均极显著降低(P < 0.01)。对照组厚壁菌门的丰度与第0天相比极显著升高(P < 0.01);DON组、AFB1组以及DON+AFB1组厚壁菌门的丰度与对照组相比均极显著升高(P < 0.01)。对照组变形菌门的丰度与第0天相比极显著升高(P < 0.01);DON组和AFB1组变形菌门的丰度与对照组相比均极显著降低(P < 0.01);DON+AFB1组变形菌门的丰度与对照组相比极显著升高(P < 0.01)。对照组脱铁杆菌门(Deferribacteres)和软壁菌门(Tenericutes)的丰度与第0天相比均极显著升高(P < 0.01);DON组、AFB1组以及DON+AFB1组脱铁杆菌门和软壁菌门的丰度与对照组相比均极显著降低(P < 0.01);DON+AFB1组脱铁杆菌门的丰度与DON组和AFB1组相比均极显著升高(P < 0.01);DON+AFB1组软壁菌门的丰度与DON组和AFB1组相比无显著差异(P>0.05)。对照组螺旋体门的丰度与第0天相比极显著升高(P < 0.01);DON组和DON+AFB1组螺旋体门的丰度与对照组相比极显著升高(P < 0.01)。
纲水平上物种分布如图 6所示。由图可知,优势菌群为拟杆菌门的拟杆菌纲(Bacteroidia)、厚壁菌门的梭菌纲(Clostridia)、变形菌门的δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)和ε-变形菌纲(Epsilonproteobacteria)。
由表 3可知,对照组拟杆菌纲的丰度与第0天相比极显著降低(P < 0.01);DON组、AFB1组以及DON+AFB1组拟杆菌纲的丰度与对照组相比均极显著降低(P < 0.01)。对照组梭菌纲的丰度与第0天相比极显著升高(P < 0.01);DON组、AFB1组以及DON+AFB1组梭菌纲的丰度与对照组相比均极显著升高(P < 0.01)。对照组δ-变形菌的丰度与第0天相比极显著升高(P < 0.01);DON组和AFB1组δ-变形菌的丰度与对照组相比极显著降低(P < 0.01),DON+AFB1组δ-变形菌的丰度则较对照组极显著升高(P < 0.01)。DON组、AFB1组以及DON+AFB1组脱铁杆菌纲和柔膜菌纲的丰度与对照组相比均极显著降低(P < 0.01)。
物种热图是以颜色梯度来代表数据矩阵中数值的大小并能根据物种或样本丰度相似性进行聚类的一种图形展示方式,可以直观观察到相同处理或相似环境样本的聚类情况,并直接反映样本群落组成的相似性和差异性。
由图 6可知,在目水平上,纵向聚类显示对照组与DON组、AFB1组与DON+AFB1组距离较近,枝长较短,表明对照组与DON组、AFB1组与DON+AFB1组的物种组成及丰度均相似。横向聚类显示丰度较高的拟杆菌目(Bacteroidales)、梭菌目(Clostridiales)、ε-变形菌纲中的弯曲菌目(Campylobacterales)、δ-变形菌纲中的脱硫弧菌目(Desulfovibrionales)、脱铁杆菌目(Deferribacterales)距离较近,枝长较短,表明它们在小鼠肠道中组成相似。
由图 7可知,在科水平上,纵向聚类显示对照组与DON组、AFB1组与DON+AFB1组距离较近,枝长较短,表明对照组与DON组、AFB1组与DON+AFB1组的物种组成及丰度均相似。横向聚类显示丰度较高的拟杆菌科(Bacteroidaceae)、Paraprevotellaceae、普氏菌科(Prevotellaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、S24-7、毛螺旋菌科(Lachno-spiraceae)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、螺杆菌科(Helicobacteraceae)距离较近,枝长较短,表明它们在小鼠肠道中组成相似。丰度次高的石斑科(Porphyromonadaceae)、Odoribacteraceae、德氏杆菌科(Deferribacteraceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)距离较近,枝长较短,表明它们在小鼠肠道中组成相似。
系统进化树是表示物种间发育关系的树状图,枝长的长短表示进化距离的差异。系统关系越近的物种,在进化树中距离越近。前面已经对样品中的物种以及丰度进行了分析。通过构建物种的进化树,可以更深一步了解小鼠肠道菌群中物种的进化关系。
图 8是在属的水平上,选取丰度最高的1条作为代表序列,构建物种系统进化树。由图可知,三大优势菌门拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门在进化树中的进化关系十分清晰,差异较明显。其中,脱铁杆菌门与变形菌门、疣微菌门(Verrucomicrobia)和软壁菌门与厚壁菌门、螺旋体门(Spirochaetes)与放线菌门(Actinobacteria)关系较近。
肠道菌群作为与胃肠环境相互作用的活性“器官”起作用,向生物体提供营养素和维生素并转导激素信息,并最终影响主要代谢途径[16-17]。在动物生理功能的发育以及疾病防治等方面也发挥着重要作用。
肠道菌群的特征通常在于其物种丰富性(肠道微生物的定性分类)及其物种“均匀性”(每种物种的定量评估)。在生态学上,物种丰富度和均匀度的综合表现为肠道微生物群落多样性[18]。对于观察到的物种数,与第0天相比,对照组、DON组、AFB1组以及DON+AFB1组均显著升高,但与对照组相比,DON组、AFB1组以及DON+AFB1组没有显著变化,说明饲养环境的变化以及小鼠个体的增长对小鼠肠道内菌群结构的影响较大。
肠道菌群功能变异可能是由于特定微生物群体的引入或灭绝或群体结构的变化[19-20]。肠道微生物包括细菌、古菌和真核微生物,其中细菌有1 000~1 150种,占大多数且绝大部分是厌氧细菌[21]。动物肠道内的有益菌为厌氧菌,当氧气含量升高时,会引起需氧菌和兼性厌氧菌的大量繁殖,导致微生态平衡失调。
随着微生态学的发展,占成年个体肠道菌群1/4以上的拟杆菌逐渐被人们认识到是人和动物体内大量存在的正常菌群,其与其他菌群以及宿主之间存在复杂而微妙的关系,对机体的健康起着重要作用。同时,拟杆菌也是条件致病菌,当其正常的微生态平衡被打破时可引发内源性感染。拟杆菌可防止大肠杆菌引起的结肠炎,提示这些细菌的作用之间存在拮抗关系[22]。拟杆菌还有益生作用,如可以降解食物利于宿主吸收营养[23-24],可以调控脂肪的积累[25],可以平衡消化道菌群结构。杨俊花等[26]研究表明,DON能显著抑制肠道菌群丰度,诱导肠道炎症,引发肠道损伤。Wang等[27]研究表明,给大鼠灌胃AFB1能显著抑制肠道中拟杆菌门相关菌群的丰度,在肠道炎症或溃疡时拟杆菌门的物种丰度也显著降低[28]。
在本研究中,DON组、AFB1组以及DON+AFB1组拟杆菌门和拟杆菌纲的丰度均极显著低于对照组,这与上述研究成果一致。DON+AFB1组与DON组和AFB1组相比,拟杆菌纲的丰度亦是极显著降低的,这表明DON与AFB1联合染毒对小鼠肠道内拟杆菌纲丰度的影响大于DON与AFB1单一染毒。厚壁菌能够促进纤维分解,是摄食纤维饲料动物胃肠道中的主要菌群,能从纤维饲料中获取更多能量满足动物生长需要。厚壁菌门中的乳杆菌属在脂肪肝形成中具有抗炎症等保护作用[29-30]。但有研究表明,梭菌可产生外毒素,对人和动物都有较强的毒害作用[31]。在本研究中,DON组、AFB1组以及DON+AFB1组梭菌纲的丰度极显著高于第0天和对照组,说明毒素促使肠道中梭菌纲的丰度上升,可能对肠道产生损伤。在肠道中拟杆菌与厚壁菌的比例随着年龄的增长而变化[32],本试验中拟杆菌门和厚壁菌门的丰度变化符合这一变化规律。软壁菌以出芽繁殖、断裂繁殖或二分裂方式繁殖,对营养要求较为苛刻。本试验中DON组、AFB1组以及DON+AFB1组软壁菌门的丰度均极显著低于对照组。这表明毒素显著抑制了肠道内软壁菌的生长。脱铁杆菌门是一类通过专性或兼性厌氧代谢获得能量的细菌。DON组、AFB1组以及DON+AFB1组脱铁杆菌门的丰度与对照组相比均极显著降低,表明毒素抑制了肠道内脱铁杆菌的生长。螺旋体广泛分布在自然界和动物体内,其中有的是致病菌,有的不致病。本试验中,DON组和DON+AFB1组的螺旋体门的丰度较其他组显著升高,说明DON可能产生了致病螺旋体损害小鼠肠道。
4 结论DON与AFB1单一及联合染毒均会改变肠道内菌群的丰度,极显著降低拟杆菌、脱铁杆菌等有益菌的丰度,极显著提高梭菌、螺旋体等有害菌的丰度,并且DON和AFB1表现出明显的互作性,具有协同效应。
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