动物营养学报    2019, Vol. 31 Issue (2): 912-921    PDF    
脱氧雪腐镰刀菌烯醇与黄曲霉毒素B1单一及联合染毒对小鼠神经递质分泌和钙稳态的影响
刘秦, 储小燕, 刘锦芳, 张娅菲, 朱雷, 张咪, 冯士彬, 李玉, 吴金节, 王希春     
安徽农业大学动物科技学院, 合肥 230036
摘要: 本试验旨在研究脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)与黄曲霉毒素B1(AFB1)单一及联合染毒对小鼠神经递质分泌和钙稳态的影响。选取96只18日龄昆明系雄性小鼠,随机分成4组,每组24只,每天分别进行灌胃染毒,对照组灌服生理盐水,DON组灌服500 μg/kg DON,AFB1组灌服200 μg/kg AFB1,DON+AFB1组灌服200 μg/kg AFB1+500 μg/kg DON。试验期45 d。分别于试验第0天(试验开始前)、第15天、第30天、第45天每组选取6只小鼠进行剖杀,取脑组织,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒检测神经递质、钙离子(Ca2+)和钙调蛋白(CaM)含量,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测CaM mRNA的表达量,Western blotting法检测钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaMKⅡ)蛋白表达量。结果显示:在各时间点与对照组相比,DON+AFB1组小鼠脑组织中5-羟色胺(5-HT)、谷氨酸(Glu)、乙酰胆碱(ACH)含量显著或极显著上升(P < 0.05或P < 0.01),多巴胺(DA)、Ca2+、CaM含量极显著下降(P < 0.01),CaM mRNA表达量(第45天除外)极显著下降(P < 0.01),磷酸化钙调蛋白依赖性蛋白激酶(p-CaMKⅡ)蛋白表达量/CaMKⅡ蛋白表达量极显著升高(P < 0.01);DON组和AFB1组小鼠脑组织中5-HT、ACH含量显著或极显著上升(P < 0.05或P < 0.01),Ca2+含量极显著下降(P < 0.01),CaM mRNA表达量(第45天除外)显著或极显著下降(P < 0.05或P < 0.01),p-CaMKⅡ蛋白表达量/CaMKⅡ蛋白表达量极显著升高(P < 0.01)。试验结果表明,DON与AFB1单一及联合染毒均可造成小鼠脑组织中神经递质分泌紊乱和钙稳态失衡,DON和AFB1的联合毒性大于单一毒性,两者具有协同效应。
关键词: 脱氧雪腐镰刀菌烯醇     黄曲霉毒素B1     神经递质     钙调蛋白     小鼠    
Effects of Single and Combined Exposure of Deoxynivalenol and Aflatoxin B1 on Neurotransmitter Secretion and Calcium Homeostasis in Mice
LIU Qin, CHU Xiaoyan, LIU Jinfang, ZHANG Yafei, ZHU Lei, ZHANG Mi, FENG Shibin, LI Yu, WU Jinjie, WANG Xichun     
College of Animal Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China
Abstract: The aim of this experiment was to study the effects of single and combined exposure of deoxynivalenol (DON) and aflatoxin B1 (AFB1) on neurotransmitter secretion and calcium homeostasis in mice. Ninety-six Kunming male mice were randomly divided into 4 groups (24 mice each group). Each group was administered by gavage. Mice in control group were given physiological saline, mice in DON group were given 500 μg/kg DON, mice in AFB1 group were given 200 μg/kg AFB1 and mice in DON+AFB1 group were given 200 μg/kg AFB1+500 μg/kg DON. The trial was conducted for 45 days. On days 0 (before the trial), 15, 30 and 45, six mice were selected from each group and slaughtered, brain tissues were removed and the contents of neurotransmitters, calcium ion (Ca2+) and calmodulin (CaM) were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits. The content of CaM mRNA expression level was detected by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and the protein expression level of calmodulin-dependent protein kinase (CaMKⅡ) was detected by Western blotting. The results showed that compared with the control group on the each time point, the contents of 5-hydroxytryptamine (5-HT), glutamic acid (Glu), acetylcholine (ACH) were significantly increased (P < 0.05 or P < 0.01), while the contents of dopamine (DA), Ca2+ and CaM in DON+AFB1 group were significantly decreased (P < 0.01), as well as the CaM mRNA expression level (expect day 45) was significantly reduced (P < 0.01). Meanwhile, the phosphorylated-CaMKⅡ (p-CaMKⅡ) protein expression level/CaMKⅡ protein expression level in DON+AFB1 group was significantly higher than that in control group (P < 0.01). Compared with the control group on the each time point, the contents of 5-HT and ACH in DON group and AFB1 group were significantly increased (P < 0.05 or P < 0.01), while the content of Ca2+ was significantly decreased (P < 0.01), and the CaM mRNA expression level (expect day 45) was significantly reduced (P < 0.05 or P < 0.01). However, the of p-CaMKⅡ protein expression level/CaMKⅡ protein expression level in DON group and AFB1 group was significantly higher than that in control group (P < 0.01). These results indicate that single and combined exposure of DON and AFB1 all can cause disturbance of neurotransmitter secretion and imbalance of calcium homeostasis. The combined neurotoxic effect of DON and AFB1 is greater than any of single exposure and they have synergistic effect.
Key words: deoxynivalenol     aflatoxin B1     neurotransmitter     calmodulin     mice    

霉菌毒素是由各种霉菌在特定环境下产生的一类天然致癌物质[1],主要存在于农产品及饲料中,在造成经济损失的同时,也严重危害人畜的健康[2]。据报道,脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和黄曲霉毒素B1(AFB1)是饲粮及其原料中污染率和污染水平较高的2种霉菌毒素[3]。DON属于B型单端孢霉烯族类毒素[4],能抑制蛋白质、DNA和RNA合成,增加肠上皮层的渗透性,损伤脑组织,有很强的细胞毒性、胃肠毒性和神经毒性[5]。AFB1是目前毒性最大的霉菌毒素[6],对动物机体有致癌、致突变和致畸作用,并且具有遗传毒性、神经毒性和免疫抑制的特性,并会引起畜禽急慢性中毒[7]。研究发现,霉菌毒素能够通过血脑屏障到达脑部,导致脑组织异常,使动物出现厌食、反应迟钝等现象,严重时出现脑组织出血和水肿[8]。Gaigé等[9]试验证明脑区是霉菌毒素敏感区域,也是激活神经元的区域。神经元影响神经递质的分泌,钙离子(Ca2+)参与调节神经元细胞损伤、修复和神经元兴奋性[10],神经递质的分泌和钙稳态反映了霉菌毒素的神经毒性。

目前,国内外对霉菌毒素的毒性研究大多局限于单一毒素,而对多种霉菌毒素的联合毒性问题少见报道。国内外学者对AFB1或DON对动物的毒性进行了一些研究,何成华等[11]在研究AFB1和DON对锦鲤原代肝细胞的作用时发现,AFB1(饲料中含量为0.05 mg/kg)和DON(饲料中含量为5 mg/kg)联合组对细胞的毒性作用高于单独组,说明这2种毒素具有协同作用。李斌等[12]探讨了AFB1和DON对DNA损伤修复的影响,结果表明AFB1(0.1 μg/mL)和DON(1.0 μg/mL)均可诱导细胞分化的S期DNA的合成,并且两者间存在交互作用。目前,DON和AFB1联合染毒对动物神经的毒性作用还未见相关报道,因此本试验以昆明系雄性小鼠为试验模型,在DON为500 μg/kg和AFB1为200 μg/kg的染毒剂量下探讨AFB1与DON单一及联合染毒对小鼠神经递质分泌及钙稳态的影响,为霉菌毒素单一及联合染毒对神经毒性作用方面的研究提供试验依据。

1 材料与方法 1.1 试验动物

18日龄昆明系雄性小鼠96只,体重(14±1) g,购于爱尔麦特科技有限公司。

1.2 试验材料和仪器

DON标准品(含量≥99%)和AFB1标准品(含量≥99%)购自美国Sigma公司。Ca2+测定试剂盒购自北京利德曼生化股份有限公司;钙调蛋白(CaM)、5-羟色胺(5-HT)、谷氨酸(Glu)、乙酰胆碱(ACH)与多巴胺(DA)测定试剂盒均购自上海源叶生物科技有限公司。Multiskan Mk3酶标仪和Arktik多功能PCR仪为美国Thermo公司产品。

1.3 试验动物分组

将96只18日龄、体重接近的昆明系雄性小鼠随机分为DON组、AFB1组、DON+AFB1组和对照组,每组24只。DON组、AFB1组、DON+AFB1组分别按500 μg/kg DON、200 μg/kg AFB1、500 μg/kg DON+200 μg/kg AFB1的染毒剂量灌胃,对照组灌服与染毒组相同剂量(1 mL)的生理盐水。

1.4 标准品试剂的配制

用1 mL棕色瓶将1 mg DON标准品溶于1 mL甲醇中,配成1 mg/mL的DON标准储备液备用。AFB1标准储备液按照同样的方法配制。

1.5 试验动物饲养管理

试验期间小鼠自由采食市售商品鼠粮(其营养水平见表 1),自由饮水,每3 d更换1次垫料,保持温度在20~25 ℃,及时打扫,注重环境卫生。小鼠在自由采食和饮水的情况下预饲1周,然后每天09:00—11:00对小鼠进行灌胃染毒。每隔24 h染毒1次,共染毒45 d。

表 1 市售商品鼠粮营养水平(风干基础) Table 1 Nutrient levels of the commercial diet for mice (air-dry basis)
1.6 样品采集与处理

分别于试验第0天(试验开始前)、第15天、第30天、第45天进行样品采集。样品采集时,每组随机选取6只小鼠,采用颈椎脱臼法处死后进行剖检,迅速取出整个脑组织,一部分保存于液氮,一部分加入组织裂解液进行快速匀浆,将匀浆液以3 000 r/min离心10 min,取上清液置于-80 ℃冰箱内保存,待测。

1.7 脑组织中神经递质含量的测定

将保存于-80 ℃冰箱内的脑组织匀浆液的上清液恢复至常温,用于检测5-HT、Glu、DA和ACH含量,检测方法按照试剂盒说明书步骤进行操作,利用酶标仪于450 nm处读取光密度(OD)值,计算脑组织中各神经递质含量。

1.8 脑组织中Ca2+和CaM含量的测定

按照检测试剂盒说明书步骤进行操作,利用酶标仪于450 nm处读取OD值,计算出脑组织中Ca2+和CaM含量。

1.9 脑组织中CaM mRNA表达量的测定

根据GenBank中发布的小鼠CaM和18S rRNA(内参基因)的全基因序列,运用Prime 5.0软件设计特异性的上、下游引物,并利用GenBank BIAST进行同源性检索,之后由通用生物系统(安徽)有限公司合成。引物序列及参数见表 2

表 2 目的基因CaM和内参基因18S rRNA引物参数 Table 2 Primer parameters of target gene CaM and reference gene 18S rRNA

取100 mg脑组织在液氮中研细,然后加入1 mL Trizol和200 μL三氯甲烷,上下摇晃20次,静置2 min;4 ℃、12 000×g离心15 min,取500 μL上清液转移至1.5 mL无RNase离心管中,加入500 μL异丙醇,充分混匀,于-20 ℃静置10 min;4 ℃、12 000×g离心10 min,白色沉淀即为RNA,弃去上清液,加入500 μL 80%乙醇;4 ℃、7 500×g离心5 min,弃去上清液,置于超净台上风干;加入20 μL无RNase水溶解RNA。

采用StarScript Ⅱ First-Strand cDNA Synthesis Mix试剂盒进行反转录,反应体系见表 3

表 3 反转录反应体系 Table 3 Reaction system of reverse transcription

表 3的步骤将反转录试剂依次加入无菌且无RNase的0.2 mL PCR管中;65 ℃孵育5 min后,立即冰浴2 min;轻轻混匀,短暂离心,42 ℃孵育30 min;85 ℃加热5 min使StarScript Ⅱ RT Mix失活;置于冰上等待进行下一步试验。

根据BIOMIGA SYBR qPCR Mix试剂盒操作说明,按表 4调配PCR反应液。

表 4 PCR反应体系 Table 4 Reaction system of PCR

将反应液放于8联管中,用超净管盖封闭,应用StepOneTM Real-Time PCR System进行荧光定量PCR(qRT-PCR),采用三步法PCR扩增反应程序:1)预变性(95 ℃ 2 min); 2)PCR反应(95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s), 40个循环;3)熔解曲线(55 ℃ 1 min,55~98 ℃、0.05 ℃/s,20 ℃ 10 s)。

试验组的目的基因CaM和内参基因18S rRNA均在同一参数下进行3个重复试验。采用2-ΔΔCt法计算各染毒组脑组织中CaM mRNA的相对表达量,其中Ct的计算公式为:

1.10 Western blotting法检测脑组织中钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaMKⅡ)蛋白表达量

取提取的脑组织蛋白裂解液,按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书进行操作,用酶标仪检测OD值,并根据标准曲线算出蛋白浓度。准备上样蛋白,制备分离胶和浓缩胶,上样,电泳,转膜,封闭,一抗孵育,二抗孵育,显影。

1.11 数据统计与分析

试验数据均以平均值±标准差(mean±SD)表示,利用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析。运用GraphPad Prism 5.0数据软件进行柱状图和折线图的绘制。Western blotting结果采用Image Lab软件进行灰度值分析。

2 结果 2.1 DON和AFB1单一及联合染毒对小鼠神经递质分泌的影响 2.1.1 对小鼠脑组织5-HT含量的影响

表 5可知,第15天时,DON+AFB1组脑组织中5-HT含量极显著高于对照组(P < 0.01),DON组和AFB1组脑组织中5-HT含量显著高于对照组(P < 0.05);第30天时,DON+AFB1组脑组织中5-HT含量极显著高于对照组(P < 0.01),DON组脑组织中5-HT含量显著高于对照组(P < 0.05);第45天时,各染毒组脑组织中5-HT含量极显著高于对照组(P < 0.01),DON+AFB1组脑组织中5-HT含量显著高于DON组(P < 0.05)。

表 5 各组小鼠脑组织中5-HT含量的比较 Table 5 Comparison of brain 5-HT content of mice in different groups
2.1.2 对小鼠脑组织中Glu含量的影响

表 6可知,第15天、第30天和第45天时,与对照组相比,DON+AFB1组脑组织中Glu含量均显著升高(P < 0.05),而DON组和AFB1组脑组织中Glu含量无显著变化(P>0.05)。

表 6 各组小鼠脑组织中Glu含量的比较 Table 6 Comparison of brain Glu content of mice in different groups
2.1.3 对小鼠脑组织中DA含量的影响

表 7可知,第15天时,DON+AFB1组脑组织中DA含量显著低于对照组(P < 0.05);第30天时,DON+AFB1组脑组织中DA含量极显著低于对照组(P < 0.01);第45天时,DON+AFB1组脑组织中DA含量极显著低于对照组和DON组(P < 0.01)。

表 7 各组小鼠脑组织中DA含量的比较 Table 7 Comparison of brain DA content of mice in different groups
2.1.4 对小鼠脑组织中ACH含量的影响

表 8可知,第15天时,AFB1组和DON+AFB1组脑组织中ACH含量极显著高于对照组和DON组(P < 0.01);第30天时,AFB1组和DON+AFB1组脑组织中ACH含量极显著高于对照组(P < 0.01),AFB1组脑组织中ACH含量极显著高于DON组(P < 0.01);第45天时,AFB1组和DON+AFB1组脑组织中ACH含量极显著高于对照组(P < 0.01),DON组脑组织中ACH含量显著高于对照组(P < 0.05),AFB1组和DON+AFB1组脑组织中ACH含量显著高于DON组(P < 0.05)。

表 8 各组小鼠脑组织中ACH含量的比较 Table 8 Comparison of brain ACH content of mice in different groups
2.2 DON与AFB1单一及联合染毒对小鼠脑组织钙稳态的影响 2.2.1 对小鼠脑组织中Ca2+含量的影响

表 9可知,在第15天、第30天和第45天时,各染毒组脑组织中Ca2+含量均极显著低于对照组(P < 0.01)。

表 9 各组小鼠脑组织中Ca2+含量的比较 Table 9 Comparison of brain Ca2+ content of mice in different groups
2.2.2 对小鼠脑组织中CaM含量的影响

表 10可知,第15天时,各染毒组脑组织中CaM含量均极显著低于对照组(P < 0.01);第30天时,DON组和DON+AFB1组脑组织中CaM含量极显著低于对照组(P < 0.01),AFB1组脑组织中CaM含量显著低于对照组(P < 0.05);第45天时,DON+AFB1组脑组织中CaM含量极显著低于对照组(P < 0.01)。

表 10 各组小鼠脑组织中CaM含量的比较 Table 10 Comparison of brain CaM content of mice in different groups
2.2.3 对小鼠脑组织中CaM mRNA表达量的影响

图 1可知,第15天时,AFB1组与DON组脑组织中CaM mRNA表达量极显著低于对照组(P < 0.01),DON+AFB1组脑组织中CaM mRNA表达量显著低于对照组(P < 0.05);第30天时,各染毒组脑组织中CaM mRNA表达量极显著低于对照组(P < 0.01),DON组脑组织中CaM mRNA表达量显著低于AFB1组(P < 0.05);第45天时,AFB1组与DON+AFB1组脑组织中CaM mRNA表达量极显著高于对照组(P < 0.01),DON组脑组织中CaM mRNA表达量显著高于对照组(P < 0.05),AFB1组脑组织中CaM mRNA表达量显著高于DON组和DON+AFB1组(P < 0.05)。

图Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分别为第15天、第30天和第45天不同组间脑组织中CaM mRNA表达量的比较。
数据柱形标注无字母或相同小写字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P < 0.05),不同大写字母表示差异极显著(P < 0.01)。图 3同。
Figures Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ indicated the comparison of brain CaM mRNA expression level in different groups on days 15, 30 and 45.
Value columns with no letter or the same small letter superscripts mean no significant difference (P > 0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P < 0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P < 0.01). The same as Fig. 3.
图 1 各组小鼠脑组织中CaM mRNA表达量的比较 Fig. 1 Comparison of brain CaM mRNA expression level of mice in different groups
图Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ表示分别为第15天、30天和45天不同组间脑组织中p-CaMKⅡ蛋白表达量/CaMKⅡ蛋白表达量(p-CaMKⅡ/CaMKⅡ)的比较。 Figures Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ indicated the comparison of brain p-CaMKⅡ protein expression level/CaMKⅡ protein expression level (p-CaMKⅡ/CaMKⅡ) in different groups on days 15, 30 and 45. 图 3 各组小鼠脑组织p-CaMKⅡ蛋白表达量/CaMKⅡ蛋白表达量的比较 Fig. 3 Comparison of brain p-CaMKⅡ protein expression level/CaMKⅡ protein expression level of mice in different groups
2.2.4 对小鼠脑组织中CaMKⅡ蛋白表达量的影响

图 2所示,按照对照组、AFB1组、DON组和DON+AFB1组的顺序,磷酸化CaMKⅡ(p-CaMKⅡ)蛋白表达量呈现逐渐升高的趋势,未磷酸化CaMKⅡ蛋白表达量呈现逐渐降低的趋势。如图 3所示,在第15天、第30天和第45天时,各染毒组的p-CaMKⅡ蛋白表达量/CaMKⅡ蛋白表达量均极显著高于对照组(P < 0.01),DON组和DON+AFB1组的p-CaMKⅡ蛋白表达量/CaMKⅡ蛋白表达量均极显著高于AFB1组(P < 0.01),DON+AFB1组的p-CaMKⅡ蛋白表达量/CaMKⅡ蛋白表达量均极显著高于DON组(P < 0.01)。

图Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ表示分别为第15天、30天和45天不同组间脑组织中p-CaMKⅡ和CaMKⅡ蛋白表达量的比较。
CaMKⅡ:钙调蛋白依赖性蛋白激酶calmodulin-dependent protein kinase;p-CaMKⅡ:磷酸化钙调蛋白依赖性蛋白激酶phosphorylated-calmodulin-dependent protein kinase;β-肌动蛋白:β-actin。
Figures Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ indicated the comparison of brain p-CaMKⅡ and CaMKⅡ protein expression levels in different groups on days 15, 30 and 45, respectively. 图 2 各组小鼠脑组织p-CaMKⅡ和CaMKⅡ蛋白表达量的比较 Fig. 2 Comparison of brain p-CaMKⅡ and CaMKⅡ protein expression levels of mice in different groups
3 讨论 3.1 DON与AFB1单一及联合染毒对小鼠神经递质分泌的影响

DON与AFB1的神经毒性作用一直是国内外学者研究的热点之一。DON和AFB1都可影响大脑神经递质的分泌,最常见的是引起脑部5-HT含量上升[13]。5-HT是一种大量存在于大脑皮层质及神经突触内的抑制性神经递质,会影响到情绪表达、记忆力等大脑活动。5-HT能系统似乎在调解喂食行为和催吐反应方面发挥作用。喂食低至中等剂量DON的动物能够从最初的体重减轻中恢复,而较高剂量是喂食引起行为更长期的变化[14]。Girish等[13]发现在食用受到霉菌毒素污染的谷物后,火鸡脑桥5-HT含量升高。他们得出的结论是,食用受到镰刀菌毒素污染的谷物损害了火鸡的脑桥5-HT能系统。本次试验中,各染毒组小鼠脑组织中5-HT含量均高于对照组,与上述结果一致。第30天和第45天时,DON组和AFB1组小鼠脑组织中5-HT含量有小幅降低,说明小鼠耐受力增强。大脑5-HT含量升高能导致猪发生行为上的变化,包括采食量降低、肌肉协调性变差、呕吐以及嗜睡等[15]。本试验研究结果表明,在DON为500 μg/kg和AFB1为200 μg/kg的染毒剂量下,DON和AFB1均能够促进小鼠脑组织内5-HT含量的升高,联合染毒时作用更加显著。DON和AFB1还可导致脑部其他神经递质含量发生变化,Glu和DA是脑部的重要神经递质,参与包括学习、记忆等一系列脑部高级神经活动过程[16-17]。Glu对于中枢神经系统的功能正常是必需的,但如果允许积累到异常高水平,则可引发兴奋性中毒神经元损伤[18]。Zhao等[19]采用放射免疫性鉴定和氨基酸分析法研究缺氧复合梭曼中毒后脑组织中Glu含量,结果表明梭曼中毒缺氧复合组大鼠脑组织中Glu含量显著高于单纯梭曼中毒组和单纯缺氧组。本次试验中,各染毒组小鼠脑组织中Glu含量均高于对照组,但DON组和AFB1组脑组织中Glu含量与对照组相比并不显著,DON+AFB1组脑组织中Glu含量则显著高于对照组,这与Zhao等[19]的试验结果相似。试验第45天时,DON+AFB1组脑组织中DA含量极显著低于对照组和DON组,可能是联合染毒组毒性大于单一染毒组。耿芳芳等[20]研究发现DON(12.21 mg/kg)可引起雏鸡脑组织中DA含量下降。ACH神经元大多数系短轴而分散的小细胞,起中间神经元作用,广泛存在大脑纹状体、海马及皮质中,与感觉和运动功能有密切关系,并且在学习与记忆方面中有重要作用[21]。本试验中,在DON为500 μg/kg和AFB1为200 μg/kg的染毒剂量下,各染毒组小鼠脑组织中ACH含量均大于对照组,并且随试验时间的延长,含量越来越高,存在时间依赖性。上述结果说明DON与AFB1单一及联合染毒均造成了小鼠神经递质分泌的紊乱。

3.2 DON与AFB1单一及联合染毒对小鼠钙稳态的影响

钙信号通过影响线粒体相关过程(如能量产生和细胞凋亡)在细胞存活中起重要作用[22]。钙离子参与调节神经元细胞损伤、修复和神经元兴奋性,并且还与神经元代谢活性有关[23]。细胞内钙稳态失衡可能会改变神经元的结构,破坏细胞膜的完整性,使DNA被降解、细胞凋亡、能量代谢紊乱,并可导致记忆障碍等[24-25]。钙移位酶存在于内质网和质膜上,它是Ca2+主动转运的一种类型,CaM能活化质膜上的钙移位酶,对细胞内钙稳态的调节有着重要影响[26]。彭双清等[27]将分离的大鼠心肌细胞放入培养基培养,并加入1.0 mg/mL DON,发现心肌细胞的三型Ca2+通道受到了明显的阻滞,通道的开放时间大大缩小,得出DON能抑制大鼠心肌细胞的Ca2+通道。本次试验中,各时间点,各染毒组小鼠脑组织中Ca2+、CaM含量均极显著低于对照组和初始(第0天)的含量,且第15天和第30天脑组织中CaM mRNA的表达量下降。这可能是因为DON和AFB1都能抑制神经细胞内Ca2+通道和CaM的合成,从而降低CaM mRNA的表达量。本试验中染毒组小鼠脑组织中p-CaMKⅡ蛋白表达量/CaMKⅡ蛋白表达量上升,应该是突触前突触蛋白Ⅰ的磷酸化和兴奋性神经递质谷氨酸的释放激活了CaMKⅡ,从而使钙稳态失衡。

4 结论

在DON为500 μg/kg和AFB1为200 μg/kg的染毒剂量下,DON与AFB1单一及联合染毒均能造成小鼠脑组织中神经递质分泌紊乱及钙稳态失衡,DON和AFB1的联合毒性大于单一毒性,两者具有协同效应。

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