动物营养学报    2019, Vol. 31 Issue (2): 922-929    PDF    
一种基于酶标仪检测天然植物复方多糖中多糖含量的方法
高倩, 刘凤华, 史雅然, 李建东, 邹闻书, 金娜, 陈长增     
北京农学院动物科技学院, 北京 102206
摘要: 本试验旨在探讨全波长酶标仪代替紫外分光光度计测定多糖含量的可行性,并对其测定结果的可靠性进行验证。首先,分别用紫外分光光度计和全波长酶标仪检测葡萄糖标准溶液葡萄糖含量,确认全波长酶标仪可替代紫外分光光度计进行多糖含量检测;随后,考察全波长酶标仪检测多糖含量的可靠性并对测定条件进行优化;最后,使用该方法对天然植物复方粗提取物的多糖含量进行检测。结果表明:全波长酶标仪可代替紫外分光光度计测定多糖含量,该方法精密度相对标准偏差(RSD)值为0.41%,样品重复性RSD值为1.06%,标准品重复性RSD值为0.84%,回收率100.02%,样品稳定性RSD值为1.25%,标准品稳定性RSD值为1.34%。对主要影响因素稀释倍数、检测波长、硫酸添加量和水浴温度进行筛选,最终确定全波长酶标仪-苯酚-硫酸法测定天然植物复方多糖中多糖含量的测定条件为:天然植物复方多糖样品经处理制成母液后稀释200倍、硫酸添加量5 mL、水浴温度30℃、检测波长490 nm。经测定,天然植物复方多糖中多糖含量为114.70 mg/g。
关键词: 全波长酶标仪     紫外分光光度计     苯酚-硫酸法     天然植物复方多糖    
Determination Method of Polysaccharide Content in Natural Plant Polysaccharide Compound Based on Microplate Reader
GAO Qian, LIU Fenghua, SHI Yaran, LI Jiandong, ZOU Wenshu, JIN Na, CHEN Changzeng     
College of Animal Science and Technology, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China
Abstract: This study aims to investigate the feasibility of measuring the polysaccharide content by a full-wavelength microplate reader instead of the ultraviolet spectrophotometer, and to verify the reliability of the results. First, the glucose content of the glucose standard solution was detected by ultraviolet spectrophotometer and full-wavelength microplate reader, respectively, to confirm the feasibility of measuring the polysaccharide content by a full-wavelength microplate reader instead of the ultraviolet spectrophotometer. Then, the reliability of the full-wavelength microplate reader for detecting polysaccharide content was investigated and the measurement conditions were optimized. Finally, using this method to detect the polysaccharide content of natural plant polysaccharide compound. The results showed that the full-wavelength microplate reader could replace the ultraviolet spectrophotometer to determine the polysaccharide content. For full-wavelength microplate reader method, the relative standard deviation (RSD) value of precision was 0.41%, the RSD value of sample repeatability was 1.06%, the RSD value of standard repeatability was 0.84%, the recovery rate was 100.02%, the RSD value of sample stability was 1.25%, and the RSD value of standard stability was 1.34%. The main influencing factors including dilution multiple, detection wavelength, sulfuric acid addition and water bath temperature were screened. The determination conditions of polysaccharide content in compound polysaccharides of natural plant polysaccharide compound by full-wavelength microplate reader-phenol-sulfuric acid method were as follows:sample was treated and diluted 200 times into a testing solution, determined as 5 mL of sulfuric acid, 30℃ water bath temperature, and 490 nm detection wavelength. Through measuring, the polysaccharide content in the natural plant polysaccharide compound is 114.70 mg/g.
Key words: full-wavelength microplate reader     ultraviolet spectrophotometer     phenol-sulfuric acid method     natural plant polysaccharide compound    

中药复方多糖是一种天然大分子化合物,由糖苷键连接而成,常有超过10个聚合度的聚糖[1]。现代研究表明,相比单一多糖,中药复方多糖的生物活性更强、更广泛,具有调节免疫、抗病毒、抗氧化、降血糖、抑菌等生理作用,且毒副作用小、耐药性低、几乎无残留,同时来源广泛[2-4]。随着115种药食同源中药列入饲料原料目录,畜牧生产中以多糖为主要成分的天然植物多糖饲料添加剂在免疫调节中应用前景日益广阔。

测定多糖含量常用的方法有比色法、滴定法、色谱法[5]。其中比色法操作便捷且费用较少,应用最广泛。在比色法中,最常见的检测方法是苯酚-硫酸法[6],检测设备多推荐紫外分光光度计[7]。但比色法中采用全波长酶标仪检测优势更突出,96孔板检测一次样品测定量近百,操作更加便捷,避免多次检测引起的误差,同时每个样品测定量仅需200 μL左右,检测中既节约了样品资源又节约了时间,值得推荐。

目前,全波长酶标仪检测单一药材的试验研究工作较为常见[8-11],而有关复方多糖的相关研究工作未见报道。本试验拟探讨全波长酶标仪代替紫外分光光度计测定中药复方多糖的可行性,同时改进复方多糖待测溶液制备方法,优化苯酚-硫酸法测定复方多糖含量,为天然植物多糖组分的研制开发探索可行的检测方法。

1 材料与方法 1.1 试剂

天然植物复方多糖粗提液、天然植物复方多糖(实验室自制);葡萄糖标准品(中国食品药品检定研究所,分析纯);苯酚(西陇化工股份有限公司,分析纯);硫酸(北京化工厂,分析纯)。

1.2 溶液的配制 1.2.1 葡萄糖标准溶液的制备

分析天平称取葡萄糖标准品20 mg,精密称定后置于100 mL容量瓶中,加适量水溶解,稀释至刻度,摇匀,即得。

1.2.2 苯酚溶液制备

分析天平称取苯酚5 g,精密称定后置于100 mL棕色容量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,即得苯酚溶液(于4 ℃贮存备用)。

1.2.3 样品溶液制备

精密量取天然植物复方多糖粗提液0.5 mL,加水稀释至100 mL,摇匀,即得样品溶液。

1.2.4 不同梯度葡萄糖标准溶液制备

精密量取葡萄糖标准溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,依次编号为1~7,分别置于具塞试管中,并分别加水补至2 mL。各试管精密加入5%苯酚溶液1.0 mL,涡旋混匀,迅速精密加入硫酸5.0 mL,涡旋混匀,放置10 min,置40 ℃水浴中保温15 min,取出,迅速冷却至室温。以不加葡萄糖的相应试剂为空白。

1.3 标准曲线

紫外分光光度计标准曲线:以空白作参比,于490 nm的波长下,采用紫外分光光度计(新世纪T6)测定编号为1~7的葡萄糖标准溶液的吸光度,以吸光度为纵坐标,葡萄糖含量为横坐标,绘制标准曲线。

全波长酶标仪标准曲线:以空白作参比,精密吸取编号为1~7的葡萄糖标准溶液各100 μL,分别置于96孔单条可拆酶标板中,采用全波长酶标仪(美国伯腾SynergyHT)在490 nm波长下测定OD值,以OD值为纵坐标,葡萄糖含量为横坐标,绘制标准曲线。

1.4 全波长酶标仪代替紫外分光光度计测定多糖含量的可行性

精密量取制备的1.2.3样品溶液1.0 mL,置于具塞试管中,精密加水1.0 mL,涡旋混匀,然后进行显色操作(精密加入5%苯酚溶液1.0 mL,涡旋混匀,迅速精密加入硫酸5.0 mL,涡旋混匀,放置10 min,置40 ℃水浴中保温15 min,取出,迅速冷却至室温)。于490 nm波长下,分别采用全波长酶标仪进行OD值测定,紫外分光光度计进行吸光度测定,重复测定6次,根据各自的标准曲线计算样品多糖含量。

1.5 全波长酶标仪法评价试验 1.5.1 确定最佳波长试验

精密量取葡萄糖标准溶液1.0 mL,精密加水1.0 mL,涡旋混匀,然后按1.4进行显色操作。利用全波长酶标仪在400~700 nm波长范围内进行扫描,以确定最佳波长。

1.5.2 精密度试验

取“标准曲线”中编号为5的葡萄糖标准溶液,精密吸取100 μL于可拆酶标板中,测定其OD值,重复测定6次。

1.5.3 加标回收率试验

将0.2 mg/mL的葡萄糖标准溶液稀释成含量分别为0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL的葡萄糖标准储备液。取6个具塞试管,分别加入1.2.3中制备的样品溶液0.5 mL,然后分别加入纯水及5个梯度的葡萄糖标准储备液各0.5 mL, 按照1.4进行显色操作和OD值测定。

1.5.4 重复性试验

分别精密吸取1.2.3中制备的样品溶液和0.12 mg/mL的标准储备液(作为标准品溶液)各6份,每份1 mL,然后按照1.4进行显色操作和OD值测定,记录并分析数据。

1.5.5 稳定性试验

取1.5.4中显色的样品溶液和标准品溶液各1份,分别精密吸取100 μL,于0~120 min内每隔20 min测定其OD值,记录并分析数据。

1.6 全波长酶标仪法检测天然植物复方多糖中多糖含量 1.6.1 天然植物复方多糖样品溶液制备中稀释倍数筛选试验

取天然植物复方多糖10 g,溶于10 mL热水中,加无水乙醇至乙醇浓度为80%,静置24 h,离心,沉淀物挥发至无味,然后用少量无水乙醇、丙酮、乙醚分别洗涤2次,然后沉淀物挥发至无味,最终加热水溶解至10 mL,作为母溶液。分别精密量取母溶液1.0 mL,用水稀释至50、400、3 200倍,测定各自的多糖含量;根据试验结果,再精密量取母溶液1.0 mL,分别稀释至50、100、200和400倍,测定各自的多糖含量。

1.6.2 硫酸添加量的筛选

精密量取1.6.1中稀释倍数为200倍样品溶液1.0 mL,置于3个具塞试管中,精密加水1.0 mL、5%苯酚溶液1.0 mL,涡旋混匀,分别加入硫酸2.5、5.0、10.0 mL,混匀,然后按照1.4进行显色操作和OD值测定,每个硫酸添加量设定3个重复,记录并分析数据。

1.6.3 水浴温度的筛选

精密量取1.6.1中稀释倍数为200倍的样品溶液1.0 mL,置于3个具塞试管中,精密加水1.0 mL,加入5%苯酚溶液1 mL,涡旋混匀,迅速精密加入硫酸5.0 mL,涡旋混匀,放置10 min,分别置于30、40、50 ℃水浴中保温15 min,取出,迅速冷却至室温,测定其OD值,每个水浴温度设定3个重复,记录并分析数据。

1.7 统计分析

采用SPSS 16.0统计软件的t检验对数据进行差异显著性比较,试验结果以P < 0.05表示差异显著,P>0.05表示差异不显著。

2 结果 2.1 全波长酶标仪与紫外分光光度计测定多糖含量标准曲线建立与检测结果

图 1可知,紫外分光光度计测定结果的线性方程是y=11.851x+0.048 1(R2=0.999 1),说明当葡萄糖含量在0~0.2 mg/mL范围内,紫外分光光度计测定结果线性关系良好;全波长酶标仪测定结果的线性方程是y=2.886 6x+0.07(R2=0.999 2),说明当葡萄糖含量在0~0.2 mg/mL范围内,全波长酶标仪测定结果线性关系良好。

A:全波长酶标仪测定结果;B:紫外分光光度计测定结果。 A: the measured result of full-wavelength microplate reader; B: the measured result of ultraviolet spectrophotometer. 图 1 葡萄糖标准溶液的标准曲线 Fig. 1 Standard curve of glucose standard solution

使用全波长酶标仪测定样品溶液的OD值,使用紫外分光光度计测定样品溶液的吸光度值,并计算出多糖含量,结果见表 1。从表中数据可以看出,利用2种仪器测得的样品溶液的多糖含量相差不大,无显著差异(P>0.05)。

表 1 2种仪器测得的样品溶液中多糖含量 Table 1 Polysaccharide content in sample solution measured by two instruments
2.2 全波长酶标仪法评价试验结果 2.2.1 确定最佳波长试验结果

根据全波长酶标仪在400~700 nm波长范围内的扫描结果,做出波长-OD值曲线图,结果见图 2-A,可以看出,最佳吸收波长为490 nm。在490 nm波长下,全波长酶标仪测定结果的线性方程是y=2.403 9x+0.060 6(R2=0.999 1),检测限为0.04 mg/mL,表明葡萄糖含量在0.04~0.20 mg/mL范围内线性关系良好(图 2-B)。

图 2 确定最佳波长试验结果 Fig. 2 Results of identifying optimum wavelength test
2.2.2 精密度试验结果

根据测定的OD值,计算葡萄糖标准溶液中葡萄糖的含量,结果见表 2。从表中数据可以看出,6次测定结果很接近,且相对标准偏差(RSD)值仅为0.41%,说明全波长酶标仪测定的结果精密度良好。

表 2 精密度试验结果 Table 2 Results of precision test
2.2.3 加标回收率试验结果

根据6组测定的OD值,计算各组的含糖量,并进一步计算各自的回收率,结果见表 3。6组试验的回收率均在(100±5)%范围内,且RSD值为0.38%,表明全波长酶标仪测定的结果回收率良好,准确度较高。

表 3 加标回收率试验结果 Table 3 Results of adding standard recovery rate test
2.2.4 重复性试验结果

根据测定的OD值,计算样品溶液和葡萄糖标准溶液的含糖量,结果见表 4。从表中数据可以看出,样品和标准品6个重复下的试验结果都很接近,且RSD值均小于5%,表明全波长酶标仪测定的结果重复性良好。

表 4 重复性试验结果 Table 4 Results of repeatability test
2.2.5 稳定性试验结果

根据测定的OD值,样品溶液和葡萄糖标准溶液的含糖量,结果见表 5。从表中数据可以看出,在2 h内,样品和标准品的含糖量检测结果相差不大,且RSD值均小于5%,表明在2 h内全波长酶标仪测定的结果稳定性良好。

表 5 稳定性试验结果 Table 5 Results of stability test
2.3 全波长酶标仪法检测天然植物复方多糖中多糖含量的检测结果 2.3.1 天然植物复方多糖样品稀释倍数的筛选

表 6可以看出,当稀释倍数在50~400倍区间时,测得的多糖含量较高,此区间范围较大,在此基础上需进一步确定稀释倍数。

表 6 样品稀释倍数筛选试验(一) Table 6 Screening test for dilution multiple of sample (Ⅰ)

表 7可以看出,当稀释倍数为200倍时,测得的多糖含量最高,故稀释倍数选取200倍。

表 7 样品稀释倍数筛选试验(二) Table 7 Screening test for dilution multiple of sample (Ⅱ)
2.3.2 硫酸添加量的筛选

表 8试验结果可以看出,当硫酸添加量为5.0 mL时,测得的多糖含量最多,故硫酸添加量取5.0 mL。

表 8 硫酸添加量对多糖含量的影响 Table 8 Effects of sulfuric acid addition on polysaccharide content
2.3.3 水浴温度的筛选

表 9试验结果可以看出,当水浴温度为30 ℃时,测得的多糖含量最多,但与40和50 ℃时测得的多糖含量相差不大。秉着节约资源的原则,选择水浴温度为30 ℃。

表 9 水浴温度对多糖含量的影响 Table 9 Effects of bathing temperature on polysaccharide content
2.3.4 天然植物复方多糖中多糖含量测定

在待测样品中加入硫酸5 mL,经30 ℃水浴显色后,在全波长酶标仪上用490 nm波长测定样品OD值,并重复操作测定6次,经计算得出天然植物复方多糖中多糖含量为114.70 mg/g。

3 讨论

多糖作为药物进行研究始于20世纪40年代,并于20世纪50年代末发现了真菌多糖的抗癌作用,促使人们对多糖开展了更加系统深入地研究。多糖类化合物广泛存在于天然植物、真菌和细菌中,具有来源广泛、毒副作用低、无致癌作用、安全性高、免疫增强功能广泛等优点,近年来,随着国内外对抗生素的禁止,天然植物多糖作为饲料及饲料添加剂,愈来愈多的应用于养殖生产。伴随着多糖产品的研发,建立复方多糖的质量标准就成为必要的研究内容。

表 10 天然植物复方多糖中多糖含量 Table 10 Polysaccharide content in natural plant polysaccharides compound

对于多糖的检测目前尚无一个统一的方法,其检测方法一般可分为两大类:一类是直接测定多糖本身,如高效液相色谱法和酶法;另一类是间接测定,如杨酸法、斐林法、苯酚-硫酸法、硫酸+蒽酮法等。前者需昂贵的仪器、多糖纯品和特定的酶,操作步骤繁琐,在应用中受到限制。后者方法简单、快速,无需多糖纯品和高级仪器,因而被广泛采用。苯酚-硫酸法检测原理是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖,并迅速脱水生成糖醛衍生物,然后与苯酚生成橙黄色化合物,再以比色法测定。

通常,全波长酶标仪和紫外分光光度计均可用于复方多糖中多糖含量测定。与紫外分光光度计相比,全波长酶标仪测定时只需200 μL溶液,大大的减少了样品用量,节约了样品资源;与紫外分光光度计每次测定需重复更换及冲洗比色皿相比,全波长酶标仪使用96孔板,一次最多可同时测定96个样品,而且每次测定只需数秒,极大地节省了测定时间,提高了测定速度,也避免了操作时间长而可能造成的误差,因此可实现大批量样品检测。

本试验参考了农业部《兽用中药、天然药物质量标准分析方法验证指导原则》关于质量标准方法验证指南的要求,对全波长酶标仪检测方法进行了相关试验。本研究通过对天然植物复方多糖进行简单前处理,在苯酚-硫酸法的基础上利用全波长酶标仪测定其多糖含量,并用葡萄糖作为标准品。试验结果表明,全波长酶标仪测定多糖含量时,其线性关系良好;精密度、回收率、重复性均在规定的误差范围内,说明方法稳定、可重复。

在对本实验室自行开发的天然植物复方多糖中多糖含量进行测定时,参考单一植物全波长酶标仪的检测方法,对主要影响因素检测波长、硫酸添加量和水浴温度进行了筛选,最终确定全波长酶标仪-苯酚-硫酸法测定天然植物复方多糖中多糖含量的测定条件为:硫酸添加量5 mL、水浴温度30 ℃、检测波长490 nm。上述结果为今后开发复方多糖饲料添加剂产品奠定了基础。

4 结论

① 本试验建立的全波长酶标仪法可代替紫外分光光度计法进行天然植物复方多糖中多糖含量的测定。该方法线性关系良好,精密度RSD值为0.41%,样品重复性RSD值为1.06%, 标准品重复性RSD值为0.84%,回收率为100.02%,样品稳定性RSD值为1.25%, 标准品稳定性RSD值为1.34%,精密度、回收率、重复性均在规定的误差范围内,说明方法稳定、可重复。

② 采用全波长酶标仪-苯酚-硫酸法测定本实验室自行开发的天然植物复方多糖中多糖含量时,测定条件确定为:天然植物复方多糖经处理制成母液后稀释200倍、硫酸添加量5 mL、水浴温度30 ℃、检测波长490 nm。经测定,1 g天然植物复方多糖中多糖含量为114.70 mg。

参考文献
[1]
林俊, 李萍, 陈靠山. 近5年多糖抗肿瘤活性研究进展[J]. 中国中药杂志, 2013, 38(8): 1116-1125.
[2]
杨丹, 任谓明, 王艳红, 等. 复合多糖药理活性研究进展[J]. 上海中医药杂志, 2016, 50(3): 94-97.
[3]
郭浩杰, 杨严格, 安乐, 等. 中药多糖的分子修饰及其药理活性研究进展[J]. 中草药, 2015, 46(7): 1074-1080.
[4]
DONG Q Q, LIN X, SHEN L, et al. The protective effect of herbal polysaccharides on ischemia-reperfusion injury[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2016, 92: 431-440. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2016.07.052
[5]
陈慧娟, 唐芳瑞, 陈燕, 等. 中药复方多糖提取工艺研究进展[J]. 安徽医药, 2018, 22(2): 201-203. DOI:10.3969/j.issn.1009-6469.2018.02.002
[6]
赵艳, 毕荣宇, 牟德华. 利用酶标仪测定6种食用菌中多糖含量[J]. 食用菌, 2013(1): 59-61. DOI:10.3969/j.issn.1000-8357.2013.01.032
[7]
张锦文. 紫外分光光度法测定枸杞中多糖含量[J]. 亚太传统医药, 2008, 4(1): 30-32.
[8]
苏颖, 周选围. 改进苯酚-硫酸法快速测定虫草多糖含量[J]. 食品研究与开发, 2008, 29(3): 118-121. DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2008.03.039
[9]
魏聪.黄秋葵花种子及果皮营养成分与活性成分研究[D].硕士学位论文.乌鲁木齐: 新疆农业大学, 2015. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10758-1015646042.htm
[10]
房芳, 柳春燕, 陈靠山, 等. 苹果链格孢菌胞外多糖及分光光度法改用酶标仪法的稳定性[J]. 黑龙江八一农垦大学学报, 2017, 29(4): 72-77. DOI:10.3969/j.issn.1002-2090.2017.04.016
[11]
李垄清.重离子诱变技术选育高产β-葡聚糖酵母菌株的研究[D].硕士学位论文.兰州: 中国科学院大学, 2017. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-80017-1017720061.htm