动物营养学报    2019, Vol. 31 Issue (3): 1072-1080    PDF    
植物蛋白质对海水养殖鱼类肠道健康的研究进展
郑晶, 欧伟豪, 麦康森, 张彦娇     
中国海洋大学, 农业部水产动物营养与饲料重点实验室, 海水养殖教育部重点实验室, 青岛 266003
摘要: 我国是世界最大的海水养殖生产国家,植物蛋白质在海水鱼类饲料中的使用愈发普遍,由此引发的海水鱼类肠道损伤问题也逐渐引起了人们的重视。植物蛋白质在海水鱼类饲料中的大量使用会诱发肠道炎症反应。肠道黏膜屏障的功能完整性和肠道菌群的动态平衡是肠道健康的首要前提和重要保障。本文综述了以豆粕为主的植物蛋白质对海水养殖鱼类的肠道黏膜屏障以及肠道菌群的研究进展,为今后由饲料中植物蛋白质引起的海水鱼类肠道健康问题的深入研究指明了方向。
关键词: 植物蛋白质     海水养殖鱼类     肠道健康     肠道黏膜屏障     肠道菌群    
Research Progress of Plant Protein on Intestinal Health of Mariculture Fish
ZHENG Jing, OU Weihao, MAI Kangsen, ZHANG Yanjiao     
Key Laboratory of Aquaculture Nutrition and Feeds, Ministry of Agriculture, Key Laboratory of Mariculture Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China
Abstract: China has the largest mariculture production all over the world, the use of plant protein in marine fish diet growing popularity, and the resulting intestinal damage of marine fish has gradually been considered by more and more people. The use of a lot of plant protein in diet for marine fish can induce the intestinal inflammatory reaction. Intestinal mucosal barrier function integrity and intestinal microflora dynamic balance are the primary prerequisite and important guarantee for intestinal health. This review presents the research progress of intestinal mucosal barriers and intestinal microbiota in marine fish fed plant protein, such as soybean meal. The review will be helpful for comprehending the current research of intestinal health in marine fish and provide references for further research and exploitation in this field.
Key words: plant protein     mariculture fish     intestinal health     intestinal mucosal barrier     intestinal microflora    

我国是世界最大的海水养殖生产国家,具有养殖规模大、密度大、产量高、品种全的特点。随着养殖产量的逐年上升,海水养殖的诸多问题也愈发凸显:一方面,养殖鱼类排泄的粪便会污染水质;另一方面,目前在海水养殖中冰鲜鱼的使用仍十分普遍,而冰鲜鱼的利用率低,大部分未被利用的冰鲜鱼沉入水底加剧了水体的恶化,这不仅污染环境、浪费资源,而且也不利于绿色健康海水养殖的发展和持续。所以,水产人工配合饲料的推广和普及是海水养殖业中势在必行的关键保障。同样,近年来受鱼粉资源和价格的限制,植物蛋白质替代鱼粉蛋白质在水产饲料中的应用已经十分广泛,在海水养殖鱼类中植物蛋白质的使用比例也有较大提高,如1993年大西洋鲑(Salmo salar)中植物蛋白质的添加量为0,近年来大部分大西洋鲑中植物蛋白质的添加量可以达到30.00%[1],最多可以达到36.50%[2]。但因为绝大部分的海水养殖鱼类为肉食性鱼类,所以其对饲料中植物蛋白质的添加较为敏感,通常会发生植物蛋白质诱导型肠炎,进而威胁养殖鱼类的健康和生长,可见我国的海水鱼类养殖虽然取得了一定的成就,但仍然任重道远。

鱼类肠道不仅负责从外界获取营养物质和能量,还活跃地参与体内的免疫反应、新陈代谢和多种应激反应,对鱼体的生长和健康具有不容忽视的作用。大量研究已经证实,肠道黏膜屏障的功能良好和肠道菌群结构的平衡是肠道健康的首要前提和重要保障。肠道黏膜屏障的受损会增加肠道通透性,导致肠道中的病原菌、抗原和毒素等进入机体,诱发机体产生一系列炎症反应[3]。与此同时,肠道菌群的紊乱使致病菌占据主导地位,致病菌释放的胞外酶和毒素会恶化肠道黏膜屏障损伤,进一步危害肠道健康。因此,了解海水鱼类肠道黏膜屏障和肠道菌群的结构、功能和调控对我们将来更好地开展绿色健康的海水养殖具有重大意义。

1 肠道黏膜屏障

肠道黏膜屏障包括肠道机械屏障[肠上皮细胞及其紧密连接(tight junction,TJ)等]和免疫屏障(肠相关淋巴组织、弥散免疫细胞以及细胞因子等)。结构完整、功能健全的肠道机械屏障能够有效的抵御肠腔内病原和有害菌的入侵,保障肠道通透性和肠道内稳态;当肠道机械屏障受损时,抗原、细菌、毒素等的入侵触发机体免疫应答,肠道免疫屏障通过调节细胞因子的分泌应对肠道的炎症反应。各屏障均具有不同的结构、功能及分子调控机制,同时又可通过各自的信号通路有机地整合在一起,共同抵御外来物质对机体的侵袭。

1.1 肠道机械屏障

肠道机械屏障既是肠道黏膜抵御外界环境抗原、病原菌及有害物质等侵入肠腔的关键,也是维持肠道上皮选择通透性及其屏障功能的结构基础。肠道机械屏障主要由上皮细胞以及细胞之间的相互连接构成,其连接方式包括紧密连接、间隙连接(gap junction,GJ)、黏合连接(adherens junction,AJ)和桥粒(desmosomes,DE)。其中,围绕在肠道黏膜上皮顶端的紧密连接在维持肠道黏膜屏障结构与功能的稳定性中发挥着至关重要的作用。许多研究已经证实,肠道紧密连接结构完整性的破坏是大菱鲆(Scophthalmus maximus)[3]、大西洋鲑[4]等海水鱼类肠道通透性升高的主要原因,肠道通透性的升高增加了肠腔内有害微生物入侵机体的可能性,极大地危害鱼体肠道健康和机体健康。

鱼类肠道紧密连接的功能是由多种紧密连接蛋白[闭锁蛋白(occludin)、闭合蛋白(claudins)、闭合小环蛋白-1(ZO-1)、连接黏附分子(junction adherence molecular, JAM)等]共同完成的,任何一种蛋白质结构功能的改变,均可导致紧密连接结构的破坏。饲料中使用不同植物蛋白质源或不同剂量的植物蛋白质均能够改变鱼类肠道紧密连接蛋白的结构与分布,即显著影响海水鱼类肠道紧密连接蛋白的基因表达。当大菱鲆饲料中40%的鱼粉被豆粕替代后,其后肠紧密连接蛋白claudin-3、claudin-4、occludin、ZO-1、JAM、Tricellulin蛋白(TRIC)的基因表达量显著降低[5],这与胡海滨[3]在大菱鲆饲料中添加55%豆粕时的研究结果一致。但在大西洋鲑饲料中使用20%的豆粕替代鱼粉,肠道紧密连接蛋白claudin-14、claudin-18的基因的表达量显著降低[4]。由此可见,不同种海水鱼类对同种植物蛋白质的耐受程度是存在差异的。此外,不同植物蛋白质源对海水养殖鱼类肠道紧密连接蛋白的影响也有相似的结果,Hu等[6]在大西洋鲑饲料中分别使用30%的大豆粕和30%的瓜尔佳豆粕(Guar meal)替代鱼粉,结果均显示,其后肠紧密连接蛋白claudin-25的基因表达量显著降低。可见,海水养殖鱼类对饲料中植物蛋白质的利用能力受鱼的种类和添加剂量的限制,在海水养殖鱼类饲料中添加其耐受范围内的较低剂量的植物蛋白质不会引起肠道紧密连接蛋白的较大变化,但当添加剂量超过一定水平后通常会显著改变肠道紧密连接的结构,增大肠道的通透性,提高肠炎发生的概率。同时,有关不同植物蛋白质源或同种植物蛋白质使用不同的加工工艺影响海水鱼类的肠道紧密连接结构的研究还相对较少,海水鱼类是否会针对不同植物蛋白质源做出不同的肠道紧密连接蛋白结构和分布的改变还有待考证。

通常,肠道紧密连接蛋白表达的变化是通过多条信号通路的调控来完成的,其中肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)、丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)及其家族中的c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)在调节肠道紧密连接蛋白表达的过程中发挥着重要的作用,可通过调控紧密连接蛋白的组装、分解及磷酸化等过程调控其结构和分布,进而影响肠道机械屏障的结构和功能[7-9]。MLCK是通过磷酸化肌球蛋白轻链(myosin light-chain,MLC)的丝氨酸和苏氨酸位点来激活肌球蛋白ATP酶,通过稳定肌动蛋白-肌球蛋白的相互作用,促进细胞骨架收缩,增加黏膜通透性[7]。而MAPK能够通过调节紧密连接蛋白(如occludin)以及MLCK的磷酸化从而影响紧密连接蛋白的装配和拆卸,进而改变肠道黏膜上皮的通透性,调节肠道机械屏障功能[8]。还有研究表明,JNK可以通过激活紧密连接蛋白claudin-2的启动子促进其基因转录和蛋白质合成,从而增强肠道机械屏障功能[9]。在海水鱼中关于肠道紧密连接蛋白的调控机制的研究较少,但在大菱鲆的研究中发现,在摄入高剂量豆粕后大菱鲆肠道中紧密连接蛋白的变化与MLCK密切相关[5],具体的调控机制还有待于进一步研究。

1.2 肠道免疫屏障

肠道免疫屏障是不同于系统性免疫的功能发达的局部免疫系统,根据功能和分布,可分为肠相关淋巴组织(gut-associated lymphoid tissue,GALT)、弥散免疫细胞、免疫效应因子和细胞因子。当机体受到外界环境中的抗原和有害菌入侵时,肠道免疫效应细胞被激活从而分泌多种细胞因子,包括促炎细胞因子[肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、干扰素-γ(IFN-γ)等]和抑炎细胞因子[转化生长因子-β(TGF-β)、IL-4、IL-10等]。在肠道炎症反应的过程中,肠道免疫屏障发挥正常功能的关键在于促炎细胞因子和抑炎细胞因子的分泌平衡,当外界抗原物质进入肠道时,促炎细胞因子的大量分泌会导致肠道黏膜上皮结构完整性遭到破坏,肠道通透性升高,病原以及致病菌的入侵会严重危害鱼体的肠道健康以及机体健康[10-11],这在海水鱼类肠道炎症反应的研究中也得到了证实[12]

近年来的研究发现,在鱼类饲料中添加高剂量豆粕会引起肠道促炎细胞因子如TNF-α、IL-1βIFN-γIL-8基因表达量显著上升,以及抗炎细胞因子TGF-βIL-10基因表达量显著下降,这在大菱鲆[2, 13]、大西洋鳕鱼(Gadus morhua)[14]、大西洋鲑[15]等的研究中都得到了证实。在大菱鲆饲料中添加40%、55%的豆粕,结果均显示肠道促炎细胞因子TNF-αIL-1β基因表达量显著上升以及抑炎细胞因子TGF-β基因表达量显著下降[3, 5]。同时,在日本海鲈(Lateolabrax japonicus)[12]和斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)[16]上的研究也表明,随着饲料中豆粕添加剂量的升高,其肠道促炎细胞因子TNF-α、IL-1βIL-8和IL-16基因表达量显著上升,抑炎细胞因子IL-4、IL-10基因表达量显著降低。在植物蛋白质源中的抗营养因子如大豆抗原蛋白(β-伴大豆球蛋白)的研究中也发现,当饲料中β-伴大豆球蛋白的添加量达到4%及以上时,大菱鲆肠道促炎细胞因子TNF-α和IL-1β基因表达量显著升高[17]。显而易见,豆粕对海水鱼类肠道免疫屏障的影响受豆粕添加剂量的调控且变化十分显著。然而,也有研究表明,并非所有植物蛋白质都会显著影响海水鱼类的肠道免疫屏障。当在大西洋鲑饲料中分别使用25.2%玉米麸、30.2%向日葵粕、22.1%菜籽粕、26.3%蚕豆粕和33.5%豌豆浓缩蛋白替代鱼粉,并在所有试验组饲料中添加0.2%的抗营养因子大豆皂甙,结果显示,除了豌豆浓缩蛋白,其余植物蛋白质源均未对大西洋鲑肠道免疫屏障产生显著影响,只有豌豆浓缩蛋白组后肠促炎细胞因子IL-22和TNF-α诱导受体的基因表达量显著高于鱼粉组[18]

肠道中炎性细胞因子的表达也是受多条信号通路调控的,并且炎性细胞因子的异常表达也会激活/抑制信号通路的级联反应。如核转录因子-κB(NF-κB)信号通路的激活会导致肠道中TNF-α和IL-1β基因表达量上升,而TNF-α和IL-1β在基因表达量上升后还能够激活NF-κB和磷脂酰肌醇3-激酶(P13K)/蛋白激酶B(Akt)串联通路[7]。在大菱鲆饲料中添加40%的豆粕,结果显示肠道促炎细胞因子TNF-α、IL-1βIFN-γ基因表达量均显著高于对照组,且NF-κBp65基因表达量也显著升高[5]。在大西洋鲑中,NF-κB已经作为肠道免疫屏障受损的标志[15]。哺乳动物的研究表明,肠道免疫屏障与机械屏障之间存在一定的交互影响,如促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IFN-γ能够激活MLCK信号通路,下调紧密连接蛋白occludin和ZO-1的基因表达量,影响紧密连接蛋白的合成、定位、装配和功能发挥,从而破坏肠道黏膜屏障[7, 19]。在鱼类上,虽有研究表明其有可能通过MLCK、NF-κB等信号通路调节肠道紧密连接蛋白表达和炎性细胞因子的分泌,但是相关具体的调控机制研究还是空白。

2 肠道菌群

肠道菌群是动物在长期的历史进化中形成的复杂且动态变化的微生物生态系统,它们在动物的生长过程中,与母体微生物、环境微生物以及食物微生物等相互影响、相互作用、共同形成。肠道黏膜层是肠道菌群与外界抗原和宿主相互作用的主要结合位点,正常的肠道菌群附着于黏膜层构成一道生物屏障,能够通过抵抗病原微生物的侵袭,提高宿主的抗病能力。鱼类肠道菌群的研究起步较晚,但是随着现代分子生物学技术的发展和普及,近年来鱼类肠道菌群发展迅速,在多种海水、淡水养殖鱼类上已经进行了一系列的研究。在无菌斑马鱼模型上的研究表明,肠道微生物能够影响肠道对营养物质的吸收利用、促进肠道上皮细胞的增殖以及强化鱼体的先天免疫作用[20],并且这与无菌小鼠上的研究结果具有相似性。然而,由于缺乏海水鱼类的无菌动物模型,有关海水鱼类肠道菌群的结构、功能以及相应的调控机制还缺乏系统深入的研究。

鱼类的肠道菌群主要由细菌组成,包括各种需氧菌、兼性厌氧菌和专性厌氧菌。此外,古菌和真菌,如Mestchnikowia zobelii、皮毛孢子菌(Trichosporon cutaneum)和热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)也是某些鱼类肠道菌群的优势菌[21]。Bai等[22]、Li等[17]和Yang等[23]在大菱鲆上的研究都已证实,变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)是养殖大菱鲆肠道中的优势菌群。此结果与之前对其他海水鱼类如珊瑚鱼[24][白斑鹦哥鱼(Chlorurus sordidus)、灰额刺尾鱼(Acanthurus nigricans)、白斑笛鲷(Lutjanus bohar)]和大黄鱼(Pseudosciaena crocea)[25]的肠道菌群的研究结果相一致。在属水平上,气单胞菌属(Aeromonas)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、交替单胞菌属(Alteromonas)、食杆菌属(Carnobacterium)、弧菌属(Vlibrio)等在海水鱼类肠道中占据主要地位[26]。鱼类肠道菌群的组成和结构受多种条件的影响,包括宿主条件(物种、性别、体重等)、环境因素(水体、饲料)和细菌自身(黏附力、酶活性及代谢力)等因素[27]。其中,食物是影响鱼类肠道微生物菌群结构变化的主要因素之一。鱼类肠道微生物对食物变化高度敏感,饲料的组成在鱼类肠道菌群的组成和功能变化过程中发挥主要作用[28]

已有研究表明,植物蛋白质的添加会对大西洋鳕鱼[29]、大西洋鲑[30]、大菱鲆[3, 17, 23]等海水养殖鱼类肠道菌群中不同分类水平微生物的物种多样性和相对丰度产生影响。不同比例、不同种类植物蛋白质源的添加均会导致海水养殖鱼类肠道菌群的微生物多样性产生显著变化。在大西洋鲑的研究中,De Santis等[31]使用23.6%的大豆浓缩蛋白替代鱼粉,又在此基础上使用7%和14%的蚕豆浓缩蛋白进行替代,结果显示各组间大西洋鲑后肠菌群α多样性没有显著差异,但蚕豆浓缩蛋白的替代显著改变了大西洋鲑后肠菌群的β多样性。Reveco等[32]使用含有20%豆粕的饲料饲喂大西洋鲑,发现豆粕显著降低了其后肠菌群多样性指数如Shannon-Weaver指数。而Booman等[33]的研究发现,在饲料中添加20%的豆粕对大鳞大麻哈鱼(Oncorhynchus tshawytscha)和细鳞大麻哈鱼(Oncorhynchus gorbuscha)的肠道微生物的多样性和组成均没有显著影响。由此可以推断,不同鱼类对相同剂量的植物蛋白质添加未必会产生相同的肠道菌群变化,即便是同种鱼类在不同植物蛋白质源的饲喂条件下肠道菌群的变化也是不尽相同的。究其原因,每种植物蛋白质源都具有其独特的营养组成和抗营养因子(如大豆球蛋白、皂甙、棉酚),这些物质可以被肠道中的多种微生物所利用,而不同植物蛋白质源在肠道中营造出的不同的营养环境也促使着微生物种群的大量繁殖从而打破了肠道中原有的菌群动态平衡,改变了肠道中的菌群组成。

近年来的研究表明,植物蛋白质源对不同鱼类肠道微生物在不同分类水平上的相对丰度具有显著影响。何娇娇等[25]在大黄鱼饲料中随着玉米蛋白粉替代鱼粉的比例不断增加,其后肠链球菌属(Streptococcus)的物种丰度逐渐增加。Parma等[34]研究发现,随着饲料中豆粕添加剂量的不断增加,金头鲷(Sparus aurata)后肠内容物中蓝藻细菌(Cyanobacteria)和乳杆菌科(Lactobacillaceae)的丰度也逐渐增加。Hartviksen等[35]使用含有20%大豆浓缩蛋白的饲喂大西洋鲑,发现植物蛋白质显著增加了其肠道肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、弧菌科(Vibrionaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)和链球菌科(Streptococcaceae)的相对丰度。胡海滨[3]在大菱鲆饲料中添加55%的豆粕显著增加了厚壁菌门、拟杆菌门(Bacteroidetes)和乳杆菌属(Lactobacillus)等的相对丰度。究其原因,可能是由于厚壁菌门、拟杆菌门和乳杆菌属能够利用豆粕中不能被鱼类肠道吸收的寡糖、非淀粉多糖、植物雌激素等为作为自身能量来源,促进其在肠道中的增殖。如Yang等[23]在大菱鲆幼鱼的研究中发现,饲料中添加1.25%或5.00%的水苏糖能显著提高肠道中纤维素降解菌的相对丰度。Gu等[13]的研究也发现,在含40%豆粕的饲料中添加精氨酸显著增加了大菱鲆幼鱼肠道中乳杆菌属和芽孢杆菌属(Bacillus)的相对丰度。在大西洋鲑[36]、孔雀鲷(Aulonocara stuartgranti)[37]饲料中添加能被肠道菌群所利用的物质(低聚糖、合生元)也得出了一致的结果。与此同时,饲料中高剂量的植物蛋白质添加也会导致海水养殖鱼类肠道中致病菌的增多,如弧菌属、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)和大肠杆菌(Escherichia coli)等。弧菌属是海水鱼类的主要菌群,其中的许多属被认为是条件致病菌,如哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)和副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)能够引起鱼、虾等水产养殖物种以及人类致病及死亡[38-39]。而脆弱拟杆菌和大肠杆菌在人类和哺乳动物的研究中均表现出了诱导肠炎、腹泻等肠道疾病的作用。可见,肠道微生物与鱼体肠道健康及其生理反应密切相关。近年来,肠道微生物的重要作用在哺乳动物上已经深入研究并获得重要进展。但是,因为与哺乳动物在分类地位、生活环境等方面的巨大差异,尤其是在缺乏无菌海水养殖动物的现状下,有关海水鱼类肠道微生物的功能研究还非常有限,海水养殖鱼类对肠道微生物的认知和反应的机制几乎空白。

3 小结

目前,我国海水养殖鱼类主要包括鲈鱼、鲆鲽类、大黄鱼等,关于它们的基本营养需求已经进行了大量全面且深入的研究,但仍然存在着高剂量的植物蛋白质的使用导致肠炎发生的问题。文章总结了不同海水鱼类对不同植物蛋白质源的耐受范围及过量添加的肠道损伤表型,见表 1。然而,关于海水养殖鱼类因摄入不同植物蛋白质源引发肠炎过程中的肠道黏膜屏障的响应机制、肠道菌群的结构和功能变化,以及肠道菌群的代谢产物的介导情况均没有系统深入的研究,同样也缺乏肠道菌群与肠道黏膜屏障功能之间的作用关系研究。而改善肠道健康、提高海水养殖鱼类对植物蛋白质的高效利用、促进绿色海水养殖具有重要价值和意义。

表 1 不同海水鱼类对不同植物蛋白质源的耐受范围及过量添加的肠道损伤表型 Table 1 Tolerance range of different marine fish fed different plant protein sources and intestinal damage phenotype added in excess plant protein
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