体外法研究延胡索酸对瘤胃甲烷、氢气产量和挥发性脂肪酸组成的影响

引用本文

王荣, 文江南, 王敏, 邓近平, 谭支良. 体外法研究延胡索酸对瘤胃甲烷、氢气产量和挥发性脂肪酸组成的影响[J]. 动物营养学报, 2019, 31(3): 1198-1209.

WANG Rong, WEN Jiangnan, WANG Min, DENG Jinping, TAN Zhiliang. Effects of Fumarate on Ruminal Methane, Hydrogen Gas Production and Volatile Fatty Acid Composition Using an in Vitro Method[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2019, 31(3): 1198-1209.

体外法研究延胡索酸对瘤胃甲烷、氢气产量和挥发性脂肪酸组成的影响

王荣^1,2, 文江南^1,2^*, 王敏², 邓近平^1,3, 谭支良²

1. 湖南农业大学动物科学技术学院, 长沙 410128;
2. 中国科学院亚热带农业生态研究所, 长沙 410125;
3. 华南农业大学动物科学技术学院, 广州 510642

收稿日期: 2018-08-17

基金项目: 国家科技计划项目（2018YFD0501800，2016YFD050054）；国家自然科学基金项目（31561143009，31472133）；湖南省重大专项（2017NK1020）；中国科学院青年促进会项目（2016327）；中国科学院特聘研究员项目（2018VBA0031）

作者简介: 王荣(1990-), 男, 河南淮阳人, 博士研究生, 从事反刍动物营养与饲料科学研究。E-mail:wangrongfd@126.com

*同等贡献作者

通信作者: 王敏, 副研究员, E-mail:wing_mail@hotmail.com; 邓近平, 研究员, 博士生导师, E-mail:dengjinping@scau.edu.cn.

摘要: 本试验旨在研究不同添加水平的延胡索酸对体外发酵甲烷、氢气产量、挥发性脂肪酸组成以及微生物数量的影响。选用3只装有永久性瘤胃瘘管的成年湘东黑山羊作为瘤胃液供体。试验采用2×4双因子试验设计，以发酵底物和延胡索酸作为影响因素，其中发酵底物分别是菊苣和玉米粉，延胡索酸设定0、3、6和12 mmol/L 4个添加水平，另外设空白组，即发酵瓶中不添加发酵底物，仅添加0、3、6和12 mmol/L延胡索酸用来矫正数据，每组2个平行，重复测定3次。采用全自动体外模拟瘤胃发酵设备，进行72 h体外模拟瘤胃发酵试验。结果表明：1）玉米粉的72 h产气量、干物质消失率均显著高于菊苣（P < 0.05）。延胡索酸显著增加了72 h产气量（P < 0.05），但对72 h矫正产气量（去除各个添加水平延胡索酸自身的产气量）、干物质消失率无显著影响（P>0.05）。发酵底物和延胡索酸对72 h产气量和干物质消化率不存在显著交互作用（P>0.05）。2）玉米粉的氢气产量和矫正氢气产量只有在12 h显著高于菊苣（P < 0.05），而2种底物在其他时间点的氢气产量和矫正氢气产量无显著差异（P>0.05）；玉米粉不同时间点甲烷产量和矫正甲烷产量均显著高于菊苣（P < 0.05）。延胡索酸对不同时间点甲烷产量、矫正甲烷产量和氢气产量、氢气矫正产量均无显著影响（P>0.05）。延胡索酸和底物对不同时间点的氢气和甲烷产量不存在显著交互作用（P>0.05）。3）延胡索酸显著增加了乙酸、丙酸和总挥发性脂肪酸浓度（P < 0.05），显著降低了乙丙比和pH（P < 0.05）。但是，延胡索酸对矫正总挥发性脂肪酸浓度没有显著影响（P>0.05）。4）延胡索酸对微生物数量均没有显著影响（P>0.05）。结果提示，和菊苣相比，玉米粉富含更多易发酵碳水化合物，这有助于产生更多的气体和挥发性脂肪酸。延胡索酸可以增加体外产气量和挥发性脂肪酸浓度主要因为延胡索酸在发酵过程中自身可以代谢产生额外的气体和挥发性脂肪酸，这会使产气量和挥发性脂肪酸浓度增加，而对于发酵底物自身的降解和微生物数量没有显著影响。

关键词: 延胡索酸体外模拟瘤胃发酵发酵类型氢气产量挥发性脂肪酸

Effects of Fumarate on Ruminal Methane, Hydrogen Gas Production and Volatile Fatty Acid Composition Using an in Vitro Method

WANG Rong^1,2, WEN Jiangnan^1,2^*, WANG Min², DENG Jinping^1,3, TAN Zhiliang²

1. College of Animal Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China;
2. Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China;
3. College of Animal Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China

Corresponding author: WANG Min, associate professor, E-mail:wing_mail@hotmail.com; DENG Jinping, professor, E-mail:dengjinping@scau.edu.cn.

*Contributed equally

Abstract: This study was conducted to investigate the effects of different supplemental levels of fumarate on methane and hydrogen gas production, volatile fatty acids composition and microbial population through in vitro fermentation. Rumen fluid was collected from three adult Xiangdong black goats fitted with permanent rumen cannulation. Using a 2×4 two-factor experimental design, corn flour and chicory were selected as substrates, fumarate had four (0, 3, 6 and 12 mmol/L) final concentrations, and blank groups were set for correcting the results, which were contained no substrate, just contained fumarate at concentrations of 0, 3, 6 or 12 mmol/L, respectively. Each group had 2 replicates, and were replicated 3 times. The 72 h in vitro ruminal incubation was performed using automatic fermentation incubation system. The results showed as follows:1) the 72 h gas production and dry matter degradation of corn flour were significantly higher than those of chicory (P < 0.05). Fumarate supplementation had greater 72 h gas production (P < 0.05); however, fumarate supplementation did not alter corrected 72 h gas production and dry matter degradation (P>0.05). There is no interaction between substrates and fumarate on 72 h gas production and dry matter degradation (P>0.05). 2) Hydrogen production and corrected hydrogen production of corn flour at 12 h were significantly higher than those of chicory (P < 0.05), those at other time points did not have significant differences (P>0.05); methane production and corrected methane production of corn flour at each time points were significantly higher than those of chicory (P < 0.05). Fumarate had no significant effect on methane production, corrected methane production, hydrogen production and corrected hydrogen production at each time points (P>0.05). There is no interaction between substrates and fumarate on hydrogen production and methane production (P>0.05). 3) Fumarate supplementation significantly increaed acetate, propionate and total volatile fatty acids concentrations (P < 0.05), and significantly decreased pH and acetate to propionate ratio (P < 0.05). But fumarate supplementation had no significant effect on corrected total volatile fatty acids concentrations(P>0.05). 4) Fumarate supplementation did not significantly affect microbial population (P>0.05). This study indicates that corn flour contains more fermentable carbohydrates than chicory, which help produce more gas and volatile fatty acids. Fumarate supplementation causes an increase in gas production and total volatile fatty acids concentration, which is mainly due to produce more gas and total volatile fatty acids during fumarate fermentation process, but has no significant effect on substrate self-degradation and microbial population.

Key words: fumarate in vitro simulated rumen fermentation fermentation pattern hydrogen production volatile fatty acids

延胡索酸是三羧酸循环中重要的中间代谢产物^[1-4]，在瘤胃中首先被还原成琥珀酸，经过脱羧基作用转变成丙酸，同时伴随着氢的消耗[C₄H₄O₄+2H→C₃H₆O₂+CO₂]^{[2, 5-6]}。当氢被用于还原延胡索酸时，甲烷菌可利用氢将减少。因此，延胡索酸可以作为电子受体，通过琥珀酸-丙酸代谢通路和增加延胡索酸利用菌的数量与甲烷菌竞争氢，减少甲烷产生^{[3, 7-8]}。另外，延胡索酸进入瘤胃后还能代谢产生乙酸^[5]。当1 mol延胡索酸被代谢成乙酸时，会伴随着4 mol还原当量的产生[C₄H₄O₄+2H₂O→C₂H₄O₂+2CO₂+4H]^[5]。这2种不同的延胡索酸代谢通路可能导致瘤胃氢气、甲烷和挥发性脂肪酸不同的生成模式。

许多研究结果表明，延胡索酸可以增加丙酸和总挥发性脂肪酸浓度^[9-12]。但是，延胡索酸是通过自身代谢额外增加挥发性脂肪酸，还是通过改变底物发酵模式，目前还不是很清楚。本试验通过研究延胡索酸的代谢产物(氢气、甲烷和挥发性脂肪酸等)，揭示不同添加水平延胡索酸对瘤胃氢气、甲烷和挥发性脂肪酸生成模式的影响机制。

1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 体外发酵底物

本试验选择营养水平差异较大的玉米粉和菊苣分别作为不同类型的发酵底物，这2种饲料原料均来自于中国科学院环江喀斯特农业生态系统观测研究站。玉米采用“按比例分层抽样法”取样300 g带回实验室，在鼓风干燥烘箱内65 ℃烘24 h，然后用微型植物粉碎机粉碎后过1.0 mm筛。菊苣采用“齐地面刈割法”取样300 g带回实验室，在鼓风干燥烘箱内95 ℃杀青0.5 h，然后65 ℃烘24 h，粉碎后过1.0 mm筛。

按照饲料常规养分测定的方法，对饲料样品中的干物质(DM)、粗蛋白质(CP)、粗灰分(Ash)、粗脂肪(EE)、无氮浸出物(NFE)、中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量进行测定^[13]，测定结果见表 1。

表 1 饲料原料的营养水平(干物质基础) Table 1 Nutrient levels of feedstuffs (DM basis)

1.1.2 人工瘤胃培养液

选择3只装有永久性瘤胃瘘管的湘东黑山羊作为瘤胃液供体动物。试验山羊每天饲喂稻草400 g和精料600 g，每天08:00和18:00分2次等量饲喂，自由饮水。试验当天，在晨饲前1 h，随机从2只瘘管羊取得新鲜瘤胃液，迅速装入保温瓶带回实验室。人工瘤胃营养液的配制参照Menke等^[14]的方法。将采集的瘤胃液用6层脱脂纱布过滤，量取600 mL的瘤胃液迅速加入到准备好的2 400 mL人工瘤胃营养液中(瘤胃液与人工瘤胃营养液体积比为1 : 4)，制成混合人工瘤胃培养液，整个过程的温度保持在39.5 ℃，通入纯二氧化碳以保持厌氧环境(以刃天青变成无色来判断)。磁力搅拌器搅拌人工瘤胃培养液，以保持瘤胃液与营养液混合均匀。

1.1.3 延胡索酸

本试验使用的延胡索酸从Sigma-Aldrich公司购买，纯度≥99.0%。

1.1.4 全自动体外模拟发酵设备

本研究采用的全自动体外瘤胃发酵设备，包括厌氧瓶、三通电磁阀、培养箱、压力传感器、计算机和气相色谱仪^[15]。培养箱设定：振荡频率50 r/min和培养温度39.5 ℃。厌氧瓶通过导管与三通电磁阀和压力传感器连接。压力传感器与计算机连接，每分钟测定并记录瓶中压力，通过压力与气体体积间关系计算气体生成量。三通电磁阀受计算机控制，当厌氧瓶中压力超过9 kPa，电磁阀自动打开，厌氧瓶气体释放，并通过导管进入气相色谱仪(安捷伦7890A，美国)测定排出气体中的氢气和甲烷含量。氢气(甲烷)产量根据厌氧瓶顶部空间大小、压力与气体体积的转化系数进行计算^[16]。

1.2 试验方法 1.2.1 试验设计

试验采用2×4双因子试验设计，以发酵底物和延胡索酸作为影响因素，其中发酵底物分别是菊苣和玉米粉，延胡索酸设定0、3、6和12 mmol/L 4个添加水平，另外设空白组，即发酵瓶中不添加发酵底物，仅添加0、3、6和12 mmol/L延胡索酸用于矫正数据，每组2个平行，重复测定3次。

1.2.2 体外瘤胃发酵试验操作

将所有发酵瓶置于振荡频率50 r/min和温度39.5 ℃的培养箱中预热。取出发酵瓶，通入二氧化碳以保证发酵瓶中为厌氧环境，用瓶口分液器向每个发酵瓶中加入60 mL人工瘤胃培养液，并将发酵瓶放入体外瘤胃发酵设备中进行发酵，72 h后终止发酵。

1.2.3 样品采集和分析

首先用pH计(Starter 300，上海奥豪斯仪器有限公司)对每个发酵瓶中的发酵液进行pH测定。然后取2 mL发酵液，15 000 r/min和4 ℃条件下离心10 min，取1.5 mL上清液，加入0.15 mL 25%偏磷酸固定，静置15 min后，-20 ℃保存。样品在常温条件下解冻，15 000 r/min和4 ℃条件下离心10 min，取0.6 mL装于测定瓶中，采用气相色谱仪测定发酵液样品中挥发性脂肪酸组分^[17]。

然后取2 mL发酵液，放入液氮中速冻，最后置于-80 ℃冰箱保存，用于微生物数量分析。试验采用Qiagen公司的QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒，按照试剂盒的说明书对微生物DNA进行提取。提取的DNA首先用微量紫外分光光度计ND-1000测定其核酸浓度(ng/μL)及纯度(OD_{260 nm}/OD_{280 nm})，最后用0.8%凝胶电泳检测其完整性，剩余的DNA置于-80 ℃保存。实时荧光定量PCR试验用于对总细菌、甲烷菌、真菌、原虫及一些功能细菌(产琥珀酸丝状杆菌、反刍月星单胞菌)进行定量分析，使用的引物序列见表 2。然后用1.8%凝胶电泳检测PCR产物，数据结果以lg copies/mL表示^[18]。最后剩余的发酵液用300目的尼龙纱布进行过滤，然后置于105 ℃烘箱中烘至恒重。根据底物重量和烘干之后的发酵底物重量，计算干物质消失率。

表 2 微生物的引物序列 Table 2 Primer sequences for microbes

1.3 数据计算和统计

甲烷和氢气在不同时间点的产量可以按照下面的公式进行计算：

式中：y代表的是甲烷和氢气在12、24或36 h的产量(mL/g)；t代表的是不同时间点(12、24和36 h)；t₁和t₂分别代表与t时间点相邻，且分别低于和高于t时间点；y₁和y₂分别代表氢气或甲烷在t₁和t₂时的产量。

采用SPSS 21.0软件对数据进行一般线性模型(GLM)单因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏多重比较。统计模型中包括底物、延胡索酸、底物×延胡索酸，统计学显著水平为P < 0.05。

2 结果与分析 2.1 延胡索酸对体外模拟瘤胃72 h产气量和干物质消失率的影响

由表 3可知，玉米粉的干物质消失率、72 h产气量均显著高于菊苣(P < 0.05)；延胡索酸对干物质消失率、矫正产气量无显著影响(P>0.05)，显著增加72 h产气量(P < 0.05)；延胡索酸和底物对干物质消失率、72 h产气量和矫正产气量均不存在显著交互作用(P>0.05)。

表 3 不同添加水平的延胡索酸对体外模拟瘤胃72 h产气量和干物质消失率的影响 Table 3 Effects of different supplemental levels of fumarate on 72 h gas production and DM degradation in vitro simulated rumen

项目Items		干物质消失率DMD/%	产气量Gas production/(mL/g)	矫正产气量Corrected gas production/(mL/g)
底物Substrate	延胡索酸Fumarate/(mmol/L)
菊苣Chicory	0	70.0	213^a	213
	3	70.0	220^b	214
	6	70.7	227^c	214
	12	70.8	247^d	212
玉米粉Corn flour	0	86.8	384^a	386
	3	87.1	403^b	386
	6	87.5	421^c	386
	12	88.0	448^d	388
SEM		0.552	2.809	3.432
主效应Main effects
延胡索酸Fumarate/(mmol/L)	0	78.2	298^a	299
	3	78.5	312^b	299
	6	79.1	324^c	300
	12	79.3	348^d	301
底物Substrate	菊苣Chicory	70.2^a	414^a	387^b
底物Substrate	玉米粉Corn flour	87.4^b	226^b	213^a
P值P-value	底物Substrate	<0.05	<0.05	<0.05
	延胡索酸Fumarate	0.47	<0.05	0.94
	底物×延胡索酸Substrate×fumarate	0.99	0.53	0.99
	同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。矫正产气量是发酵瓶中总的产气量减去对应添加水平的延胡索酸自身产气量。下表同。 In the same column, values with different small letter superscripts mean significant difference (P < 0.05). Corrected gas production was the difference between the total gas production in the bottle and gas production by corresponding level fumarate. The same as below.

2.2 延胡索酸对体外模拟瘤胃不同时间点氢气和甲烷产量的影响

由表 4和表 5可知，玉米粉的氢气产量和矫正氢气产量只有在12 h显著高于菊苣(P < 0.05)，而2种底物在其他时间点的氢气产量和矫正氢气产量无显著差异(P>0.05)；玉米粉的甲烷产量和矫正甲烷产量显著高于菊苣(P < 0.05)；延胡索酸对不同时间点甲烷产量、矫正甲烷产量和氢气产量、氢气矫正产量均无显著影响(P>0.05)；延胡索酸和底物对不同时间点的氢气和甲烷产量不存在显著交互作用(P>0.05)。

表 4 不同添加水平延胡索酸对不同时间点体外模拟瘤胃氢气产量的影响 Table 4 Effects of different supplemental levels of fumarate on hydrogen production in vitro simulated rumen

mL/g
项目Items		氢气产量H₂ production				矫正氢气产量Corrected H₂ production
项目Items		12 h	24 h	36 h	72 h	12 h	24 h	36 h	72 h
底物Substrate	延胡索酸Fumarate/(mmol/L)
菊苣Chicory	0	0.06	0.25	0.32	0.20	0.06	0.25	0.32	0.20
	3	0.06	0.29	0.33	0.25	0.05	0.28	0.33	0.26
	6	0.06	0.20	0.40	0.28	0.06	0.19	0.38	0.28
	12	0.07	0.17	0.34	0.30	0.04	0.14	0.33	0.29
玉米粉Corn flour	0	0.27	0.40	0.34	0.31	0.27	0.40	0.34	0.31
	3	0.25	0.36	0.31	0.29	0.24	0.35	0.31	0.29
	6	0.25	0.29	0.27	0.25	0.24	0.28	0.25	0.25
	12	0.17	0.23	0.23	0.19	0.15	0.20	0.21	0.19
SEM		0.037	0.079	0.066	0.049	0.038	0.079	0.067	0.051
主效应Main effects
延胡索酸Fumarate/(mmol/L)	0	0.16	0.33	0.33	0.25	0.16	0.33	0.33	0.25
	3	0.16	0.33	0.32	0.27	0.15	0.32	0.32	0.27
	6	0.16	0.24	0.33	0.27	0.15	0.23	0.32	0.27
	12	0.12	0.20	0.29	0.25	0.09	0.17	0.27	0.24
底物Substrate	菊苣Chicory	0.04^a	0.23	0.35	0.26	0.04^a	0.22	0.34	0.26
底物Substrate	玉米粉Corn flour	0.23^b	0.32	0.29	0.26	0.22^b	0.31	0.28	0.26
P值P-value	底物Substrate	< 0.05	0.26	0.38	0.93	< 0.05	0.26	0.39	0.93
	延胡索酸Fumarate	0.85	0.60	0.95	0.98	0.69	0.84	0.93	0.97
	底物×延胡索酸Substrate×fumarate	0.75	0.97	0.82	0.49	0.76	0.97	0.83	0.52

表 5 不同水平延胡索酸对不同时间点体外模拟瘤胃甲烷产量的影响 Table 5 Effects of different supplemental levels of fumarate on methane production in vitro simulated rumen

mL/g
项目Items		甲烷产量CH₄ production				矫正甲烷产量Corrected CH₄ production
项目Items		12 h	24 h	36 h	72 h	12 h	24 h	36 h	72 h
底物Substrate	延胡索酸Fumarate/(mmol/L)
菊苣Chicory	0	2.24	9.19	14.71	18.94	2.24	9.19	14.71	18.92
	3	2.18	9.44	14.62	23.81	1.92	9.08	14.32	22.53
	6	2.58	8.52	13.61	22.41	2.37	8.19	13.23	21.11
	12	2.85	8.05	12.64	21.92	2.55	7.29	12.01	20.92
玉米粉Corn flour	0	23.21	34.64	42.25	47.13	23.22	34.62	42.22	47.14
	3	22.72	35.03	43.42	50.54	22.43	34.74	43.03	49.71
	6	23.31	35.31	43.63	53.11	23.11	34.91	43.24	52.43
	12	23.22	34.24	42.09	50.62	22.92	33.43	41.31	49.61
SEM		0.931	1.966	3.079	4.433	0.930	1.978	3.108	4.547
主效应Main effects
延胡索酸Fumarate/(mmol/L)	0	12.71	21.92	28.41	34.02	12.72	21.91	28.42	34.03
	3	12.42	22.21	29.04	34.23	12.24	21.92	28.71	37.01
	6	12.93	21.93	28.62	34.91	12.72	21.63	28.23	37.62
	12	13.04	21.12	27.33	34.84	12.71	20.31	26.62	36.84
底物Substrate	菊苣Chicory	2.52^a	8.83^a	13.92^a	21.92^a	2.33^a	8.42^a	13.54^a	20.01^a
底物Substrate	玉米粉Corn flour	23.12^b	34.83^b	42.81^b	50.33^b	22.92^b	34.43^b	42.42^b	48.52^b
P值P-value	底物Substrate	< 0.05	< 0.05	< 0.05	< 0.05	< 0.05	< 0.05	< 0.05	< 0.05
	延胡索酸Fumarate	0.97	0.98	0.98	0.99	0.97	0.94	0.97	0.89
	底物×延胡索酸Substrate×fumarate	0.92	0.91	0.94	0.90	0.89	0.97	0.86	0.96

表 5 不同水平延胡索酸对不同时间点体外模拟瘤胃甲烷产量的影响 Table 5 Effects of different supplemental levels of fumarate on methane production in vitro simulated rumen

2.3 延胡索酸对体外模拟瘤胃挥发性脂肪酸组成的影响

由表 6和表 7可知，玉米粉的乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、总挥发性脂肪酸浓度均显著高于菊苣(P < 0.05)，玉米粉的乙丙比、pH显著低于菊苣(P < 0.05)；延胡索酸显著升高了乙酸、丙酸和总挥发性脂肪酸浓度(P < 0.05)，显著降低了乙丙比(P < 0.05)，对乙酸、丙酸和总挥发性脂肪酸浓度均无显著影响(P>0.05)；延胡索酸和底物对挥发性脂肪酸浓度不存在显著交互作用(P>0.05)。

表 6 不同添加水平延胡索酸对挥发性脂肪酸组分的影响 Table 6 Effects of different supplemental levels of fumarate on VFA composition in vitro simulated rumen

项目Items		总挥发性脂肪酸TVFA/(mmol/L)	乙酸Acetate/(mmol/L)	丙酸Propionate/(mmol/L)	丁酸Butyrate/(mmol/L)	异丁酸Isobutyrate/(mmol/L)	戊酸Valerate/(mmol/L)	异戊酸Isovalerate/(mmol/L)	乙丙比Acetate/propionate	pH
底物Substrate	延胡索酸Fumarate/(mmol/L)
菊苣Chicory	0	53.48^a	37.52^a	9.34^a	3.65	1.15	0.69	1.11	4.06^c	6.91^c
	3	60.04^b	41.90^b	11.34^b	3.79	1.16	0.70	1.15	3.69^bc	6.80^bc
	6	65.96^c	45.43^c	13.89^c	3.62	1.16	0.71	1.16	3.28^ab	6.73^ab
	12	80.65^d	54.63^d	19.20^d	3.81	1.17	0.70	1.14	2.85^a	6.59^a
玉米粉Corn flour	0	84.20^a	47.88^a	17.46^a	13.12	1.54	2.29	1.91	2.74^b	6.71^c
	3	88.62^a	50.10^ab	19.39^b	13.38	1.60	2.27	1.89	2.58^b	6.57^b
	6	96.60^b	54.38^b	22.35^c	13.95	1.73	2.21	1.98	2.44^b	6.48^ab
	12	107.87^c	59.31^c	29.16^d	13.32	1.89	2.21	1.98	2.04^a	6.40^a
SEM	1.139		0.819	0.336	0.426	0.079	0.072	0.074	0.097	0.034
主效应Main effects
延胡索酸Fumarate/(mmol/L)	0	68.84^a	42.70^a	13.40^a	8.38	1.35	1.49	1.51	3.40^c	6.81^d
	3	74.33^b	46.00^b	15.37^b	8.58	1.38	1.49	1.52	3.14^bc	6.68^c
	6	81.28^c	49.91^c	18.12^c	8.79	1.45	1.46	1.57	2.86^b	6.61^b
	12	93.26^d	56.97^d	24.18^d	8.57	1.53	1.45	1.56	2.44^a	6.49^a
底物Substrate	菊苣Chicory	65.03^a	44.87^a	13.44^a	3.72^a	1.16^a	0.70^a	1.14^a	3.47^b	6.76^b
底物Substrate	玉米粉Corn flour	94.32^b	52.92^b	22.09^b	13.44^b	1.69^b	2.24^b	1.94^b	2.45^a	6.54^a
P值P-value	底物Substrate	< 0.05	< 0.05	< 0.05	< 0.05	< 0.05	< 0.05	< 0.05	< 0.05	< 0.05
	延胡索酸Fumarate	< 0.05	< 0.05	< 0.05	0.93	0.40	0.98	0.93	< 0.05	< 0.05
	底物×延胡索酸Substrate×fumarate	0.65	0.13	0.19	0.87	0.48	0.96	0.96	0.25	0.98

表 6 不同添加水平延胡索酸对挥发性脂肪酸组分的影响 Table 6 Effects of different supplemental levels of fumarate on VFA composition in vitro simulated rumen

表 7 不同水平延胡索酸对体外模拟瘤胃矫正挥发性脂肪酸组分的影响 Table 7 Effects of different supplemental levels of fumarate on corrected VFA composition in vitro simulated rumen

项目Items		总挥发性脂肪酸TVFA/(mmol/L)	乙酸Acetate/(mmol/L)	丙酸Propionate/(mmol/L)	丁酸Butyrate/(mmol/L)	异丁酸Isobutyrate/(mmol/L)	戊酸Valerate/(mmol/L)	异戊酸Isovalerate/(mmol/L)	乙丙比Acetate/propionate
底物Substrate	延胡索酸Fumarate/(mmol/L)
菊苣Chicory	0	52.82	38.19	8.68	3.65	0.65	0.56	0.89	4.40
	3	50.87	37.22	8.59	3.01	0.66	0.55	0.84	4.36
	6	51.32	37.89	8.44	3.04	0.64	0.53	0.79	4.49
	12	53.71	39.42	8.59	3.64	0.64	0.59	0.84	4.60
玉米粉Corn flour	0	82.03	46.88	17.46	13.12	1.21	2.02	1.34	2.69
	3	77.14	44.30	16.26	12.02	1.18	2.02	1.36	2.72
	6	79.28	44.71	17.53	12.33	1.22	2.13	1.37	2.55
	12	80.53	45.60	17.72	12.65	1.22	2.05	1.29	2.59
SEM		1.956	1.173	0.471	0.333	0.093	0.030	0.051	0.088
主效应Main effects
延胡索酸Fumarate(mmol/L)	0	67.42	42.54	13.07	8.38	0.93	1.29	1.22	3.54
	3	64.00	40.76	12.43	7.52	0.92	1.28	1.10	3.54
	6	65.30	41.30	12.98	7.68	0.93	1.33	1.08	3.52
	12	67.12	42.51	13.15	8.14	0.93	1.32	1.06	3.59
底物Substrate	菊苣Chicory	52.18^a	38.18^a	8.57^a	3.34^a	0.65^a	0.56^a	0.89^a	4.46^b
底物Substrate	玉米粉Corn flour	79.74^b	45.37^b	17.24^b	12.53^b	1.21^b	2.05^b	1.34^b	2.64^a
P值P-value	底物Substrate	< 0.05	< 0.05	< 0.05	< 0.05	< 0.05	< 0.05	< 0.05	< 0.05
	延胡索酸Fumarate	0.58	0.64	0.70	0.26	0.98	0.61	0.17	0.95
	底物×延胡索酸Substrate×fumarate	0.95	0.89	0.67	0.95	0.99	0.35	0.16	0.40
	矫正挥发性脂肪酸浓度是延胡索酸组发酵瓶中挥发性脂肪酸浓度与对应空白发酵瓶中挥发性脂肪酸浓度的差值。 Corrected VFA concentration was the difference between the VFA concentration in the fermentation bottle and individual VFA concentration by corresponding level fumarate.

2.4 延胡索酸对体外模拟瘤胃微生物数量的影响

由表 8可知，玉米粉的原虫数量显著高于菊苣(P < 0.05)；延胡索酸对总细菌、原虫、真菌、产琥珀酸丝状杆菌、反刍月星单胞菌和甲烷菌数量均无显著影响(P>0.05)；延胡索酸和底物对微生物数量不存在显著交互作用(P>0.05)。

表 8 不同添加水平延胡索酸对体外模拟瘤胃微生物数量的影响 Table 8 Effects of different supplemental levels of fumarate on microbial population in vitro simulated rumen

lg copies/mL
项目Items		总细菌Total bacteria	原虫Protozoa	真菌Fungi	甲烷菌Methanogen	产琥珀酸丝状杆菌Fibrobacter succinogenes	反刍月星单胞菌Selenomonas ruminantium
底物Substrate	延胡索酸Fumarate/(mmol/L)
菊苣Chicory	0	10.95	6.01	5.31	8.46	7.79	8.52
	3	10.92	5.90	5.31	8.45	7.75	8.53
	6	10.94	6.00	4.98	8.39	7.95	8.49
	12	11.09	6.53	5.24	8.46	7.90	8.55
玉米粉Corn flour	0	11.11	6.72	5.22	8.49	7.14	8.50
	3	11.04	6.56	5.42	8.51	7.00	8.58
	6	11.12	6.75	5.21	8.43	7.33	8.59
	12	11.21	7.13	5.19	8.48	7.71	8.56
SEM		0.167	0.314	0.172	0.137	0.393	0.111
主效应Main effects
延胡索酸Fumarate/(mmol/L)	0	11.01	6.36	5.27	8.47	7.46	8.51
	3	11.03	6.23	5.37	8.48	7.37	8.55
	6	11.01	6.38	5.10	8.41	7.64	8.54
	12	11.12	6.83	5.22	8.47	7.80	8.56
底物Substrate	菊苣Chicory	11.03	6.11^a	5.21	8.44	7.85	8.52
底物Substrate	玉米粉Corn flour	11.12	6.79^b	5.26	8.48	7.29	8.56
P值P-value	底物Substrate	0.54	0.04	0.77	0.78	0.18	0.75
	延胡索酸Fumarate	0.93	0.56	0.74	0.98	0.87	0.99
	底物×延胡索酸Substrate×fumarate	0.99	0.99	0.91	0.98	0.96	0.98

表 8 不同添加水平延胡索酸对体外模拟瘤胃微生物数量的影响 Table 8 Effects of different supplemental levels of fumarate on microbial population in vitro simulated rumen

3 讨论 3.1 延胡索酸对玉米粉和菊苣体外模拟瘤胃产气量和干物质消失率的影响

饲料经瘤胃微生物发酵后的产气量是衡量饲料可发酵程度的重要指标，产气量通常与干物质消失率呈正相关^[23]。富含易发酵碳水化合物的玉米粉更容易被微生物利用，产生更多的气体^[24]。而菊苣中更多的中性和酸性洗涤纤维不适合微生物附着和生长，影响其发酵速率和程度。研究结果表明，延胡索酸可以显著增加总产气量^[25-26]。但是，在本试验结果中，延胡索酸对干物质消失率无显著影响，这可能与延胡索酸在瘤胃中自身降解可以代谢产生二氧化碳密切相关。Demeyer等^[27]报道，延胡索酸通过琥珀酸-丙酸代谢途径，最终会产生二氧化碳，导致产气量升高。延胡索酸对矫正产气量没有显著影响，这与干物质消失率没有发生变化相一致。

3.2 延胡索酸对玉米粉和菊苣体外模拟瘤胃甲烷和氢气产气量的影响

本试验中，玉米粉的甲烷产量高于菊苣，这可能是因为玉米粉有助于甲烷菌生长，可以产生更多的甲烷。但是，在本试验结果中，2种底物的甲烷菌数量没有显著差异，这可能是因为甲烷产量除了与甲烷菌数量有关，还与甲烷菌活性有关^[28]。氢是伴随着挥发性脂肪酸产生的中间产物，在12 h时，玉米粉的氢气产量显著高于菊苣，之后无显著差异，这可能是因为氢产量的增加会刺激甲烷菌对氢的利用，从而使氢分压维持平衡^[29]。延胡索酸利用氢气还原生成琥珀酸的过程中所需要的自由能为-128.8 J/mol，而甲烷菌利用氢气和二氧化碳合成甲烷所需要的自由能为-16.9 J/mol。与甲烷合成相比，延胡索酸还原成琥珀酸的过程所需要的氢分压更低，释放的能量能多。这说明延胡索酸可以作为氢池参与消耗氢的反应。Castro-montoya等^[30]研究结果表明，在体外条件下，2.33 g/L的延胡索酸可以降低35%甲烷的生成。Bayaru等^[31]研究结果表明，在奶牛饲粮中添加2%的延胡索酸可以减少23%的甲烷排放。但是，Beauchemin等^[32]研究结果表明，在肉牛饲粮中添加10 g/kg的延胡索酸对甲烷排放并没有显著影响。在本研究结果中，延胡索酸对不同时间点的氢气和甲烷产量均无显著影响。Ungerfeld等^[5]报道，1 mol延胡索酸通过琥珀酸被还原成丙酸的过程中会消耗2 mol的氢[C₄H₄O₄+2H→C₃H₆O₂+CO₂]，即还原1 mol的延胡索酸可以降低0.25 mol甲烷产生。但是，1 mol延胡索酸通过苹果酸-丙酮酸转变成乙酸的过程中会产生4 mol的氢[C₄H₄O₄+2H₂O→C₂H₄O₂+2CO₂+4H]，即1 mol的延胡索酸可以增加0.5 mol甲烷产生。延胡索酸对甲烷和氢气产量没有影响，说明在延胡索酸被还原成琥珀酸的过程中，被消耗的氢几乎抵消了延胡索酸代谢产生乙酸所释放的氢。

3.3 延胡索酸对玉米粉和菊苣体外模拟瘤胃pH和挥发性脂肪酸组成的影响

和菊苣相比，玉米粉富含非结构性碳水化合物，很容易被微生物降解产生更多的挥发性脂肪酸，从而使pH降低^[26]。延胡索酸是一种有机酸，具有一定的酸性^[33]。Remling等^[34]报道，添加延胡索酸后，瘤胃液pH由6.08降低到5.93，这与本研究结果相一致。但是，有些研究结果表明，添加延胡索酸会升高瘤胃pH^[8]，这可能与微生物增加了对延胡索酸的利用有关^[35]。

挥发性脂肪酸浓度和组成是衡量瘤胃发酵模式的重要指标。延胡索酸在体外发酵过程中，一方面在黄素腺嘌呤二核苷酸递氢体(FADH₂)作用下生成琥珀酸，然后与辅酶A的巯基形成硫脂键，在变位酶维生素B₁₂催化下，将生成的琥珀酰辅酶A转变成甲基丙二酸单酰辅酶A，在丙酰辅酶羧化酶和生物素的催化下，转变成丙酰辅酶A，最后在丙酰辅酶A转移酶的作用下生成丙酸，最终导致丙酸浓度增加^[5]；另一方面，在延胡索酸酶的作用下，与水反应生成苹果酸，在苹果酸脱氢酶的作用下生成草酰乙酸，在磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶催化下，形成磷酸烯醇式丙酮酸，在丙酮酸激酶催化下形成丙酮酸，在丙酮酸脱氢酶复合体的作用下生成乙酰辅酶A，然后在磷酸作用下生成乙酰磷酸，最终在酸性条件下分解产生乙酸，最终导致乙酸浓度增加^[5]。在本试验中，延胡索酸增加了乙酸、丙酸和总挥发性脂肪酸浓度，但矫正乙酸、丙酸和总挥发性脂肪酸浓度无显著变化。这表明延胡索酸对挥发性脂肪酸浓度及组成的改变主要与自身代谢有关，对底物本身的发酵模式没有影响。

3.4 延胡索酸对玉米粉和菊苣体外模拟瘤胃微生物数量的影响

在本试验中，玉米粉更有助于提高原虫数量，这可能与原虫更多的降解淀粉有密切关系^[36]。有研究结果表明，延胡索酸有助于促进产琥珀酸丝状杆菌、琥珀酸放线菌和产琥珀酸沃廉菌的增殖，从而促进和甲烷菌同时竞争氢的利用^[26]。在本研究中，延胡索酸对总细菌、原虫、真菌、甲烷菌、反刍月星单胞菌和产琥珀酸丝状杆菌数量均没有显著影响。这可能与发酵底物、延胡索酸的添加水平、发酵时间和试验条件(连续发酵培养或单批体外发酵)有关。

4 结论

① 玉米粉富含更多容易降解的淀粉，这会有助于其瘤胃发酵产生更多的气体和挥发性脂肪酸。

② 在体外模拟瘤胃发酵条件下，延胡索酸(≤12 mmol/L)对不同类型发酵底物的干物质消失率、不同时间点的甲烷和氢气产量、微生物数量无显著影响。

③ 延胡索酸显著增加了体外产气量、乙酸、丙酸和总挥发性脂肪酸浓度，降低了乙丙比，这与延胡索酸通过自身代谢产生额外的二氧化碳、乙酸、丙酸密切相关。

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