2. 内蒙古东达生物科技有限公司, 达拉特 014300
2. Inner Mongolia Dongda Biological Technology Co., Ltd., Dalate 014300, China
无氮饲粮法是研究动物基础氮代谢的经典方法[1],因其具有成本较低、操作简便、方法简单等优点,在单胃动物相关研究中应用广泛。但无氮饲粮法也存在一定的不足,忽略了饲粮在不同化学组成条件下对内源氮损失的影响[2]。此外,动物采食不含蛋白质的饲粮使动物处于一种非正常的生理状态,与正常采食条件下的内源氮损失有一定差异[3]。家兔具有独特的消化生理结构和消化特性,具发达的盲肠,能够很好地利用饲粮中的粗纤维,故酶的消化和微生物消化均是家兔体内重要的消化方式。肠道消化酶的分泌量和活性及微生物区系在消化过程中发挥着重要作用,也是无氮饲粮条件下家兔体内实现氮周转的重要组成部分。肠道消化酶活性及微生物区系均会受到无氮饲粮条件下饲粮化学组成及机体非正常生理状态的影响。侯水生[4]认为低蛋白质饲粮导致胰液的合成原料不足,胰酶活性降低且胰腺的机能下降,间接影响消化酶的活性。Low等[5]报道,摄入无氮饲粮会改变机体的代谢水平,从而影响机体的内源氮代谢。蒋纯卫等[6]报道,无氮饲粮会使肉鸡的盲肠微生物中的优势菌群发生改变。但无氮饲粮对家兔肠道消化酶活性及微生物区系影响的研究报道较少。因此,本试验以不同种类的家兔作为试验动物,通过分别饲喂基础饲粮和无氮饲粮,研究无氮饲粮对不同种类家兔肠道消化酶活性和微生物区系的影响,为采用无氮饲粮法开展家兔基础氮代谢的研究提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料和饲粮爱博素、万利先、棕榈脂肪粉(为黄色颗粒状,含量≥98%)分别为瑞登梅尔纤维公司、奥地利Agromed公司、泰安饲料公司产品,玉米淀粉、蔗糖为市购。基础饲粮参考谷子林[7]推荐的獭兔营养需要进行配制,其组成及营养水平见表 1。无氮饲粮参考NRC(1977)[8]建议的兔营养需要量进行配制,其组成及营养水平见表 2。将饲粮制成约4 mm×10 mm的颗粒饲料。
选取1.5岁、健康状况良好、体重(3 kg左右)相近的成年獭兔、肉兔和毛兔各20只,公母各占1/2。每个种类的家兔按照性别随机分为2组,分别饲喂基础饲粮和无氮饲粮,每组10个重复,每个重复1只。
试验前对使用的兔舍和笼具进行清理和消毒,试验兔采用单笼饲养,常规饲养管理,自然通风和光照,自由饮水和采食。正试期每天分别于08:00和18:00各饲喂1次,预试期和正试期各7 d。
1.3 测定指标和方法 1.3.1 肠道消化酶活性正试期结束后,将家兔全部屠宰,分别取小肠和盲肠食糜于-80 ℃条件下冷冻保存待测。取小肠食糜测定淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶活性,取盲肠食糜测定纤维素酶活性。4种消化酶活性的测定均采用双抗原夹心酶联免疫法,试剂盒购自北京海瑞祥天生物科技有限公司,操作步骤按试剂盒说明书进行。
1.3.2 盲肠微生物多样性取各组家兔盲肠食糜,采用Illumina Hiseq 2500平台(2×250双端测序)由北京百迈客生物科技股份有限公司对样品进行细菌16S rRNA的高通量测序分析。对样品中16S rRNA基因的V3~V4区进行检测,双端Reads拼接、过滤后共产生1 154 266条Clean tags,平均产生64 126条Clean tags。
1.4 数据处理与分析采用Excel 2007和SPSS 20.0统计软件对数据进行处理和分析,采用单因素方差分析(one-way ANOVA)检验组间差异显著性,采用LDS法进行多重比较。P < 0.05为差异显著,P < 0.01为差异极显著,试验结果以平均值±标准差表示。
2 结果与分析 2.1 无氮饲粮对家兔肠道消化酶活性的影响由表 3可知,3种家兔在肠道淀粉酶、胰蛋白酶、脂肪酶以及纤维素酶活性方面无氮饲粮组与基础饲粮组均无显著差异(P>0.05)。无氮饲粮组肠道淀粉酶和纤维素酶活性在数值上高于基础饲粮组,獭兔、肉兔和毛兔淀粉酶活性分别提高了8.00%、4.08%和20.69%,纤维素酶活性分别提高了12.45%、12.19%和9.47%;无氮饲粮组肠道胰蛋白酶和脂肪酶活性在数值上低于基础饲粮组,獭兔、肉兔和毛兔胰蛋白酶活性分别降低了5.47%、8.20%和9.98%,脂肪酶活性分别降低了4.34%、0.96%和8.97%。3种家兔之间相比较,在肠道淀粉酶和纤维素酶活性方面,肉兔受无氮饲粮的影响大于毛兔和獭兔,在肠道胰蛋白酶和脂肪酶活性方面,毛兔受无氮饲粮的影响大于肉兔和獭兔。
Alpha多样性分析是对独立样品的物种多样性进行分析,Chao1和ACE指数用于衡量物种丰富度的高低,数值越高,说明样品的物种越丰富,Shannon指数用于衡量物种多样性的高低,数值越高,表明样品的物种多样性越高。
由表 4可知,基础饲粮组操作分类单元(OTU)数量多于无氮饲粮组,说明饲喂无氮饲粮对獭兔盲肠微生物丰度有一定的降低趋势。Alpha多样性分析显示,基础饲粮组和无氮饲粮组的ACE和Chao1指数分别是777.26、789.67和685.48、686.59,表明基础饲粮组盲肠微生物物种数量多于无氮饲粮组。基础饲粮组的Shannon指数高于无氮饲粮组,也表明采食无氮饲粮后獭兔盲肠菌群的多样性有一定的降低趋势。
由表 5可知,无氮饲粮组肉兔盲肠微生物的物种丰度和物种多样性较基础饲粮组均有所降低,与獭兔的结果相近,说明采食无氮饲粮后肉兔盲肠菌群的多样性有一定的降低趋势。
由表 6可知,无氮饲粮组的OTU数量高于基础饲粮组,说明无氮饲粮组盲肠物种丰度较对照组有提高趋势。Alpha多样性分析显示,基础饲粮组和无氮饲粮组的ACE和Chao1指数分别是622.76、624.93和652.69、659.29,表明无氮饲粮组盲肠微生物物种数量较基础饲粮组有提高趋势。无氮饲粮组的Shannon指数高于基础饲粮组,也表明采食无氮饲粮后毛兔盲肠菌群的多样性有升高趋势。
稀释曲线用于验证测序数据量能否反映样品中物种的多样性,随着测序条数的增加,OTU数量急剧上升,并逐渐趋于平缓,说明测序充分,能够代表物种的多样性。在97%相似水平下对OUT数量做稀释曲线(图 1),由稀释曲线可知,獭兔、肉兔基础饲粮组的OTU数量均高于无氮饲粮组,说明无氮饲粮会影响獭兔、肉兔的盲肠菌群结构,使菌群多样性降低,而毛兔无氮饲粮组与基础饲粮组相比,盲肠菌群OTU数量相近,说明无氮饲粮对毛兔盲肠菌群多样性的影响较小。
检测的所有样品均由厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)等组成,其中前2种菌门是样品中菌群的主要组成部分,占87.33%以上。由图 2可知,2组獭兔的盲肠菌群在属水平上均由拟杆菌属(Bacteroides)、不可培养拟杆菌目S24-7群(uncultured_bacterium_f_Bacteroidales_S24-7_group)、不可培养梭菌目vadinBB60群(uncultured_bacterium_f_Clostridiales_vadinBB60_group)、瘤胃球菌属1(Ruminococcus_1)、瘤胃球菌科NK4A214群(Ruminococcacceae_NK4A214_group)、毛螺菌科NK4A136群(Lachnospiraceae_NK4A136_group)、艾克曼菌属(Akkermansia)等菌属组成,这些菌属相对丰度之和分别占基础饲粮组和无氮饲粮组獭兔盲肠菌群总量的49.89%、45.98%。其中,无氮饲粮组的Bacteroides和Ruminococcacceae_NK4A214_group、Akkermansia的相对丰度分别为14.16%、10.63%、5.96%,较基础饲粮组(分别为7.10%、3.80%、0.88%)增加,而Ruminococcus_1、Lachnospiraceae_NK4A136_group的相对丰度则较基础饲粮组有所降低。
由图 3可知,2组肉兔盲肠菌群在属水平上均由Bacteroides、Ruminococcus_1、Akkermansia、Lachnospiraceae_NK4A136_group、克里斯滕森菌科R-7群(Christensenellaceae_R-7_group)、不可培养紫单胞菌科(uncultured_bacterium_f_Porphyromonadaceae)等菌属组成,这些菌属的相对丰度之和分别占基础饲粮组和无氮饲粮组肉兔盲肠菌群总量的58.81%、49.76%。其中,无氮饲粮组Bacteroides和Akkermansia的相对丰度分别为17.68%、13.37%,高于基础饲粮组(分别为6.28%、1.11%);无氮饲粮组Ruminococcus_1、Lachnospiraceae_NK4A136_group和uncultured_bacterium_f_Porphyromonadaceae的相对丰度分别是1.90%、1.57%、0.96%,低于基础饲粮组(分别为13.08%、12.32%、6.38%)。
由图 4可知,2组毛兔盲肠菌群在属水平上均由Bacteroides、不可培养梭菌目vadinBB60群(uncultured_bacterium_f_Clostridiales_vadinBB60_group)、Akkermansia、Ruminococcus_1、Ruminococcacceae_NK4A214_group、Ruminococcacceae_NK4A214_group、uncultured_bacterium_f_Ruminococcacceae)、毛螺菌科V9D2013群(Lachnospiraceae_V9D2013_group)等菌属组成,这些菌属的相对丰度之和分别占基础饲粮组和无氮饲粮组毛兔盲肠菌群总量的47.72%、52.16%。其中,无氮饲粮组Bacteroides、Akkermansia和Lachnoclostridium(属毛螺菌科)的相对丰度分别为30.19%、8.11%、5.83%,高于基础饲粮组(分别为17.73%、1.56%、0.02%);无氮饲粮组uncultured_bacterium_f_Bacteroidales_S24-7_group、Ruminococcus_1的相对丰度分别为0.79%、0.72%,低于基础饲粮组(分别为7.55%、7.09%)。
由图 5可知,无氮饲粮组和基础饲粮组家兔盲肠群结构有一定差异,其中毛兔差异较大。主坐标分析(PCoA)结果显示家兔采食无氮饲粮后,盲肠菌群结构发生了改变。
无氮饲粮法是研究单胃动物内源氮代谢的经典方法,由Mitchell[1]在1942年建立。无氮饲粮法的假设是饲喂动物无氮饲粮,动物食糜和粪中的氮即为内源氮,并且在不同的饲养管理水平及饲粮组成条件下,内源氮的排出量和氨基酸组成是不变或相近的。而在生产实际中,这种假设条件往往会受到影响,肠道消化酶是家兔内源含氮物质循环体系的重要组成部分[9],无氮饲粮可以对肠道消化酶产生影响继而影响内源氮排放。如崔文典[10]报道,当饲粮蛋白质水平下降时,幼兔肠道蛋白酶活性有降低趋势,淀粉酶活性有增长趋势。郝瑞荣等[11]报道,饲粮蛋白质水平低至18%时,断奶仔猪肠道胰蛋白酶和胃蛋白酶活性显著下降。杨玉芬等[12]研究了纤维水平对猪肠道消化酶活性的影响,发现高纤维水平饲粮使肠道胰蛋白酶活性降低,淀粉酶活性增高。Schneeman等[13]也报道,纤维会降低小鼠小肠蛋白酶、脂肪酶的活性。晁洪雨等[14]报道,随饲粮酸性洗涤纤维水平的提高,2~3月龄肉兔肠道纤维素酶活性显著提高,淀粉酶呈降低趋势。Gidenne等[15]和霍鲜鲜等[16]也报道饲粮纤维能使受试动物肠道纤维素酶活性升高。本试验中,无氮饲粮组3种家兔的肠道淀粉酶、纤维素酶活性较基础饲粮组均有提高趋势,胰蛋白酶和脂肪酶活性较基础组均有降低趋势,这一变化趋势与上述报道在饲粮组成发生变化时消化酶活性发生相应变化的趋势相近。其可能的原因是,无氮饲粮组成与基础饲粮组成有一定的差异,不同的饲粮组成对家兔机体产生了不同的刺激,引起了消化酶的活性发生改变。
另外,3种家兔在无氮饲粮条件下虽然肠道淀粉酶、纤维素酶、胰蛋白酶和脂肪酶活性均未发生显著性的变化,单就活性的数值变化幅度来看,獭兔肠道中这4种消化酶活性变化受无氮饲粮的影响最小。
3.2 无氮饲粮对家兔肠道微生物区系的影响肠道微生物也是内源氮循环的重要组成部分[17],微生物区系也受饲粮组成及动物生理状态的影响。本试验中,饲喂无氮饲粮对3种家兔盲肠微生物多样性均产生了一定的影响,其中獭兔和肉兔盲肠微生物多样性有一定的下降,而毛兔则有一定的上升。其可能的原因是,营养组成及生理状态变化对3种家兔的盲肠微生物均产生了一定的刺激,蛋白质水平的变化影响了獭兔和肉兔盲肠微生物的增殖。而毛兔拟杆菌属在肠道内的比例高于肉兔和獭兔,由于拟杆菌属对纤维和能量的变化比较敏感[18-19],毛兔盲肠微生物多样性的变化可能与纤维和能量水平变化刺激下拟杆菌属的变化有关。
盲肠菌群结构方面,3种家兔均以厚壁菌门、拟杆菌门为主,但不同种类家兔的肠道微生物构成有一定差异,这与杨睿等[20]和白秀娟等[21]的报道一致。3种家兔无氮饲粮组的拟杆菌属和艾克曼菌属的相对丰度高于基础饲粮组,瘤胃球菌属的相对丰度低于基础饲粮组。其可能的原因时拟杆菌属对纤维的变化比较敏感[18-19],艾克曼菌属对蛋白质的变化比较敏感[22],瘤胃球菌属对植物细胞壁多糖的变化比较敏感[23]。该结果与蒋纯卫等[6]研究无氮饲粮对肉鸡盲肠微生物区系影响时得出的结果相近,可能是由于无氮饲粮中粗纤维水平较高,间接促进了拟杆菌属细菌的增殖,以强化纤维素分解。张名爱等[19]报道,高纤维水平饲粮使鹅肠道菌群数量增多。谷子林等[24]试验也表明,饲粮纤维水平使獭兔肠道微生物优势菌群比例发生改变,与本试验结果类似。可见,家兔采食无氮饲粮后,使盲肠菌群多样性和优势菌群的比例发生了改变。
4 结论采食无氮饲粮对家兔肠道消化酶活性和盲肠微生物区系均有一定影响,应用无氮饲粮法研究家兔内源氮代谢时应综合考虑这些影响。
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