2. 中国科学院 亚热带农业生态研究所, 中国科学院亚热带农业生态过程重点实验室, 湖南省动物营养生理与代谢过程湖南省重点实验室, 长沙 410125
2. Observation and Experiment Station of Animal Nutrition and Feed Science in South-Central China, Ministry of Agriculture, Hunan Provincial Engineering Research Center for Healthy Livestock and Poultry Production, Key Laboratory of Agro-Ecological Processes in Subtropical Region, Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China
线粒体是细胞中产生能量的主要细胞器,是真核生物进行有氧代谢的重要部位,是糖类、脂肪和氨基酸最终氧化释放能量的场所[1]。研究表明氨基酸在能量代谢中具有着重要的作用,其中精氨酸(Arg)被认为是非必需或条件性氨基酸,参与了很多重要的生理反应,对仔猪小肠的生长发育起着重要的作用[2-4]。前期研究表明Arg能促进线粒体生物合成,缓解脂多糖处理对上皮细胞的毒害作用[5]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是细胞营养感应和生长的中心调控子,通过调控相关基因mRNA的翻译调节很多生理过程,包括自噬作用、核糖体生物合成、细胞骨架重组和代谢相关基因表达等[6-7]。近年来的研究表明,mTOR也是细胞能量感应分子,能够感知能量状态,并调控其下游的信号通路,从而调节细胞的新陈代谢以及细胞周期进程和细胞生长,因此成为肥胖和2型糖尿病等代谢性疾病治疗的新靶点[8]。mTOR是细胞内重要的信号调控分子,能整合氨基酸和能量感应通路,进而调控细胞存活与代谢。本课题组前期研究证实,Arg激活肠上皮细胞mTOR信号通路,促进细胞增殖和损伤修复[9]。然而,mTOR信号通路在肠上皮细胞中对Arg的利用及其在损伤修复过程中的能量感应机制尚不清晰。因此,本试验拟研究mTOR信号通路介导Arg调控猪肠上皮细胞能量代谢的作用及其机制,旨在阐明仔猪肠道氨基酸营养感应机制,为肠道生长发育调控提供重要的理论基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料猪肠道上皮细胞IPEC-J2购自广州吉妮欧生物科技有限公司;Arg缺失的DMEM-H培养基为实验室自制,其具体组分如表 1所示;胎牛血清(FBS)、双抗、Arg、雷帕霉素(RAP)、磷酸盐缓冲液(PBS)和胰蛋白酶购自美国Sigma公司;cDNA第1链合成试剂盒、Trizol和反转录PCR(RT-PCR)试剂盒购自日本TaKaRa公司;细胞呼吸代谢检测试剂盒购自美国Seahorse Biosciences公司;活性氧(ROS)试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司;其他相关试剂均为国产分析纯。
将生长状态良好的IPEC-J2细胞按1×105个细胞/孔接种于6孔培养板中或按5×105个细胞/皿接种于10 mm培养皿中,用含10% FBS和含1%双抗的DMEM-H完全培养基于37 ℃、5%CO2培养箱中培养过夜,贴壁后换成Arg缺失的DMEM-H培养基饥饿6 h;然后分别用含100 μmol/L Arg、100 μmol/L Arg+10 nmol/L RAP、350 μmol/L Arg和350 μmol/L Arg+10 nmol/L RAP的DMEM-H完全培养基处理,每2 d换1次培养基。处理至72 h后,收集细胞用于RNA提取、ROS百分含量检测和代谢组学检测。
1.2.2 细胞呼吸代谢将生长良好的IPEC-J2细胞消化后,按5×103个细胞/孔接种于24孔细胞呼吸代谢板中。细胞贴壁过夜后,分别换成含100 μmol/L Arg、100 μmol/L Arg+10 nmol/L RAP、350 μmol/L Arg和350 μmol/L Arg+10 nmol/L RAP的DMEM-H完全培养基,处理72 h后上机检测,操作步骤参照Tan等[5]。上机检测前1天探针板每孔添加1 mL校正缓冲液,水化过夜激活探针。检测时取出细胞板,吸走液体后,添加1 mL/孔分析检测液DMEM,之后吸弃,反复2次后添加500 μL分析检测液DMEM。放入无CO2、37 ℃培养箱孵育1 h。同时,探针板不同的加药孔依次加入0.5 μmol/L寡霉素(oligomycin)、4 μmol/L羰基-氰-对-三氟甲氧基本腙(FCCP)和1 μmol/L鱼藤酮+抑制剂A(ROT-AA)各75 μL。加药后,按设定程序上机检测。结果采用Seahorse XF Analyzers的XFe Analyzer 2.1和Report Generator处理原始数据,Graph Prime 5生成数据图。
1.2.3 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测采用Trizol法提取细胞的总RNA,并用Nanodrop 2000分光光度计(Nano-drop Technologies)测定总RNA浓度以及在260和280 nm处的吸光度值。所有样品的RNA浓度用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水调至1 000 ng/μL左右。采用TaKaRa cDNA第1链合成试剂盒反转录,得到cDNA模板。用ABI 7900HT荧光定量PCR仪和TaKaRa荧光定量试剂盒进行PCR。反应体系及反应条件参照荧光定量试剂盒设计。以β-肌动蛋白(β-actin)作为内参基因,采用2-△△Ct法计算目的基因的mRNA相对表达量。所用引物由上海生工生物有限公司合成,引物序列见表 2。
细胞收集后装载探针:按照1 : 1 000的比例用无血清培养液稀释2′, 7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA),终浓度为10 μmol/L。细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中,细胞浓度为1×106~2×107个/mL,37 ℃细胞培养箱内孵育20 min。每隔3~5 min颠倒混匀一下,使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞3次,以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。通常ROS阳性对照在刺激细胞20~30 min后可以显著提高ROS含量。仅在阳性对照孔中加入ROS阳性对照剂ROSup,其余孔不加入ROSup。采用流式细胞仪在488 nm激发波长、525 nm发射波长条件下检测刺激前后荧光强度的强弱。
1.2.5 核磁共振氢谱(1H NMR)检测各组细胞经PBS洗3遍后,用细胞刮刀收集,然后放入液氮中5 min,加入100%甲醇制备细胞提取液。取200 μL细胞提取液与400 μL重水配制的0.9%生理盐水充分混匀(重水用于锁场),4 ℃下12 000 r/min离心10 min,取560 μL加入核磁管(Norell,ST500-7)中,在Bruker Avance DRX-600高分辨核磁共振谱仪(Bruker Biospin, Rheinstetten,德国)上进行核磁共振(NMR)检测,1H频率为600.11 MHz,配备三共振高分辨探头。采样温度为25 ℃,采样次数为32次,谱宽20 ppm。每个样品采样前控温至少5 min,每个样品的90°脉冲宽度调整为10 μs左右,等待时间(recycle delay,RD)为2 s(期间进行预饱和压水)。每个样品分别进行如下2个试验:1)预饱和压水峰的NOESYPR1D(RD-90°-t1-90°-tm-90°-ACQ)试验,其中脉冲延迟时间(t1)为3 μs,混合时间(tm)为100 ms,在(tm)和弛豫延迟期间进行预饱和压水。2)预饱和压水峰的弛豫时间编辑[Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)][RD-90°-(-180°-)n-ACQ]试验,总的自旋-自旋回波时间(2nτ)为200 ms,在弛豫延迟期间进行预饱和压水。
所有的自由感应衰减(FID)在傅立叶变换前均加1 Hz指数函数的增宽,用TopSpin 2.0软件进行数据处理,手动校正基线和相位。血浆代谢物化学位移以α-葡萄糖的异头质子峰δ 5.23定标。采用Amix软件对压水的1H CPMG谱进行自动积分,0.5~8.5区域的积分值用来做主成分分析(principal component analysis,PCA)。为了消除残余水峰对分析造成的影响,将水峰所在的4.55~5.13区间的积分值去掉,积分间隔0.002 ppm,共有3 663个区间。对所有的积分数据进行归一化处理(每个区间的积分值与总积分值的比值),归一化处理后的数据直接用做下一步数据分析。代谢物的相对含量由其代表性谱峰的积分数据(归一化后)计算得到,进一步的统计分析方法与普通的数据分析方法一致。
1.3 数据统计与分析试验数据用Excel 2007初步整理后,用SPSS 19.0软件对样本进行单因素方差分析和Turkey法检验,使用Graph Prime 5生成数据图。P < 0.05为差异显著,P < 0.01为差异极显著,结果用平均值±标准误表示。
2 结果与分析 2.1 抑制mTOR信号通路降低细胞呼吸代谢细胞呼吸代谢检测结果显示,与仅含100 μmol/L Arg的培养基相比,添加10 nmol/L RAP至含100或350 μmol/L Arg的培养基中后,细胞内的耗氧率下降(图 1),具体表现为细胞内基础呼吸、质子渗漏、最大呼吸、储备呼吸率和ATP生成的耗氧率均极显著降低(P < 0.01);此外,添加10 nmol/L RAP至含350 μmol/L Arg的培养基中后,非线粒体呼吸耗氧率极显著降低(P < 0.01)。不同浓度的Arg之间比较发现,培养基中Arg浓度由100 μmol/L增加到350 μmol/L以后除了ATP生成耗氧率极显著增加(P < 0.01)以外,其他呼吸代谢指标无显著差异(P>0.05)(图 2)。上述结果表明抑制mTOR信号通路显著降低了细胞线粒体的呼吸代谢作用,提高Arg浓度不能缓解因抑制mTOR信号通路而对线粒体呼吸代谢所产生的抑制作用。
如图 3所示,与仅含100 μmol/L Arg的培养基相比,在含100或350 μmol/L Arg的培养基中添加10 nmol/L RAP极显著降低了糖酵解过程中相关酶的mRNA相对表达量,包括己糖激酶、丙酮酸脱氢酶、磷酸烯醇式丙酮酸激酶、柠檬酸合酶和异柠檬酸脱氢酶(P < 0.01)。如图 4所示,与仅含100 μmol/L Arg的培养基相比,在含100或350 μmol/L Arg的培养基中添加10 nmol/L RAP极显著降低了脂肪酸代谢过程中脂肪酸合成酶和肉碱棕榈酰转移酶的mRNA相对表达量(P < 0.01)。不同浓度Arg之间上述指标没有显著差异(P>0.05)。上述结果表明抑制mTOR信号通路后细胞内的能量代谢显著降低。
抑制mTOR信号通路对ROS生成的影响如图 5所示,与仅含100 μmol/L Arg的培养基相比,在含100或350 μmol/L Arg的培养基中添加10 nmol/L RAP极显著降低了细胞内ROS的百分含量(P < 0.01),而不同浓度Arg之间则没有显著变化(P>0.05)。
根据2D 1H-1H COSY、TOCSY和J分解谱和参考文献[16],共指认出29种代谢物(图 6中1~29),具体如下:1.异亮氨酸;2.亮氨酸;3.缬氨酸;4.赖氨酸;5.丙氨酸;6.精氨酸;7.谷氨酸;8.谷氨酰胺;9.脯氨酸;10.苏氨酸;11.甘氨酸;12.酪氨酸;13.苯丙氨酸;14.羟基异丁酸;15.乳酸;16.柠檬酸;17.丙酮酸;18.琥珀酸;19.延胡索酸;20.β-葡萄糖;21.α-葡萄糖;22.醋酸;23.甲酸;24.肌醇;25.胆碱;26.糖蛋白;27.脂质;28.低密度脂蛋白;29.组氨酸。
如图 7所示,两两比较可见,100 μmol/L Arg浓度下添加与不添加RAP处理的代谢产物可以分得很开,说明可以明显区分出细胞提取物中二者的代谢产物。
表 3中所示的代谢物为一些对细胞提取物分类代谢较大的代谢物(部分数据未列出),与仅含100 μmol/L Arg的培养基相比,在含100 μmol/L Arg的培养基中添加10 nmol/L RAP极显著降低了细胞提取物中丙氨酸、柠檬酸、胆碱和肌醇的相对含量(P < 0.01),显著降低了细胞提取物中琥珀酸和苏氨酸的相对含量(P < .05),极显著增加了细胞提取物中亮氨酸、β-羟基异丁酸、Arg、醋酸、糖蛋白和甲酸的相对含量(P < 0.01),显著增加了细胞提取物中赖氨酸的相对含量(P < 0.05)。
细胞呼吸是将营养物质转化成ATP等生物能量,然后释放出代谢产物的一系列代谢反应过程。真核细胞中,线粒体是细胞呼吸中重要的细胞器,参与的主要是有氧呼吸过程。氨基酸作为蛋白质的最小基本单位,又是三羧酸循环中间底物的主要来源,对呼吸代谢有着重要作用。近年来越来越多的证据表明,氨基酸在线粒体生物发生中具有功能性作用。饲喂支链氨基酸混合物能提高中年小鼠的线粒体生物发生作用,并促进其存活[10]。同样,在对C2C12肌管的研究中发现亮氨酸能通沉默信息调节因子1(SIRT1)-腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信号通路显著增加线粒体含量和线粒体生物发生相关基因的表达[11]。本课题组前期研究也发现,Arg影响细胞呼吸代谢,缺失Arg降低了线粒体呼吸代谢,同时减少了线粒体内膜和基质蛋白含量,破坏线粒体氧化磷酸化和ATP的产生过程[5, 12]。然而,本试验中提高Arg添加量使其在培养基中的浓度由100 μmol/L提高到350 μmol/L后线粒体的呼吸代谢并没有发生显著变化。
氨基酸能激活mTOR信号通路[13],对线粒体能量代谢有着重要的调控作用。本课题组前期研究发现提高Arg浓度改善了脂多糖(LPS)处理下猪肠上皮细胞的线粒体损伤[5]。研究表明,胞质内的Arg通过结合哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体1(mTORC1)通路的细胞内Arg传感器(CASTOR1)-GATOR-原癌基因Ras调节的三磷酸鸟苷绑定蛋白(Rag)信号通路激活mTOR[8]。而mTOR作为能量代谢的调控因子已在很多文献中被证实[8, 14-15]。mTOR能通过调控真核翻译起始因子4e结合蛋白1(4EBP1)来调控RNA翻译,从而控制线粒体活性和生物合成[14]。添加RAP抑制mTOR信号通路后发现mTORC1、转录因子yin-yang 1(YY1)与过氧化物酶体增殖物激活受体γ-辅助激活因子-1α(PGC-1α)复合体被破坏,从而抑制了YY1与PGC-1α的相互作用,降低了线粒体氧化作用相关的基因的表达量[15]。因此,本试验设想是否Arg是通过mTOR信号通路调控线粒体能量代谢。在本试验中,以猪肠上皮细胞IPEC-J2为研究对象,不同浓度Arg处理下添加RAP抑制mTOR信号通路后发现线粒体呼吸代谢中相关指标均显著降低,如细胞内耗氧率降低,与之相关的基础呼吸、质子渗漏、最大呼吸、储备呼吸率、非线粒体呼吸和ATP生成耗氧率等指标也均极显著降低,说明抑制mTOR信号通路后IPEC-J2细胞的线粒体呼吸代谢被抑制。进一步检测相应通路酶的表达后发现,抑制mTOR信号通路后,细胞中的三羧酸(TCA)循环和糖酵解途径相关酶的mRNA相对表达量也极显著降低,然而提高Arg的浓度并不能缓解抑制mTOR信号通路对呼吸代谢的影响,因此Arg调控线粒体能量代谢的主要通路可能是mTOR信号通路。
由于提高Arg浓度并没有有效改善抑制mTOR信号通路后对能量代谢的抑制,因此在进一步的试验中,我们只研究了正常Arg浓度100 μmol/L下添加与不添加RAP的代谢组学变化,考察mTOR信号通路对其的影响机制。代谢组学检测结果表明抑制mTOR信号通路后,琥珀酸、柠檬酸的相对含量显著或极显著降低,说明TCA循环被抑制,线粒体功能被破坏,与呼吸代谢结果一致。而抑制mTOR信号通路后糖蛋白的相对含量极显著上升,与之前本课题组研究发现呕吐毒素能够抑制mTOR信号通路促进肠道糖蛋白表达的结果[16]一致,具体的机制需要进一步研究。同时,抑制mTOR信号通路后β-羟基异丁酸的相对含量上升,可能造成草酰乙酸含量增多使呼吸被完全抑制。呼吸代谢结果和代谢物的数据表明抑制mTOR信号通路后猪肠上皮细胞的呼吸被抑制。mTOR信号通路调节蛋白质合成,因此抑制mTOR信号通路后,蛋白质合成降低,相应的蛋白质降解增加,本试验数据表明抑制mTOR信号通路后细胞内的亮氨酸、Arg、赖氨酸的相对含量显著或极显著上升,蛋白质降解反应增加。细胞内Arg浓度的上升可能与碱性氨基酸转运载体2(CAT2)的表达量上升有关[17],具体的分子机制有待进一步验证。
抑制mTOR信号通路使得线粒体的功能被破坏,由于线粒体是ROS的中心来源地,线粒体遭到损伤时,细胞内的ROS的含量会显著增加。已有研究表明,托林(torin)抑制mTOR信号通路后细胞内ROS的表达量会急剧上升,添加RAP后抑制细胞内ROS的生成[18-19]。本试验中添加RAP后,ROS的生成量显著下降,与上述研究结果相符。RAP有抗癌症、抗衰老的作用,在细胞培养中能延迟细胞衰老,同时可以延长动物的寿命,改善心血管健康[20]。研究发现,长时间添加RAP能抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体2(mTORC2),延迟衰老,同时可能激活PI3K-Akt,降低ROS的生成,使线粒体相关凋亡蛋白的表达量显著下降,且细胞增殖降低,抑制自发性凋亡,从而抑制细胞凋亡,延长寿命[21-22]。在猪肠上皮细胞中,RAP可能对mTOR被抑制后产生的细胞损伤进行反馈调节,从而使得细胞进行自我修复。
4 结论① 抑制mTOR信号通路抑制了猪肠上皮细胞线粒体呼吸代谢。
② 抑制mTOR信号通路降低了糖酵解过程中相关激酶的相对表达量。
③ 抑制mTOR信号通路降低了细胞内ROS的生成,可能通过抑制细胞凋亡进行自我修复。
[1] |
SRINIVASULA S M, HEGDE R, SALEH A, et al. A conserved XIAP-interaction motif in caspase-9 and Smac/DIABLO regulates caspase activity and apoptosis[J]. Nature, 2001, 410(6824): 112-116. DOI:10.1038/35065125 |
[2] |
BAN H, SHIGEMITSU K, YAMATSUJI T, et al. Arginine and leucine regulate p70 S6 kinase and 4E-BP1 in intestinal epithelial cells[J]. International Journal of Molecular Medicine, 2004, 13(4): 537-543. |
[3] |
RHOADS J M, NIU X M, ODLE J, et al. Role of mtor signaling in intestinal cell migration[J]. American Journal of Physiology, Gastrointestinal and Liver Physiology, 2006, 291(3): G510-G517. DOI:10.1152/ajpgi.00189.2005 |
[4] |
YAO K, YIN Y L, CHU W Y, et al. Dietary arginine supplementation increases mTOR signaling activity in skeletal muscle of neonatal pigs[J]. The Journal of Nutrition, 2008, 138(5): 867-872. DOI:10.1093/jn/138.5.867 |
[5] |
TAN B E, XIAO H, XIONG X, et al. L-arginine improves DNA synthesis in LPS-challenged enterocytes[J]. Frontiers in Bioscience, 2015, 20(6): 989-1003. DOI:10.2741/4352 |
[6] |
SCHMELZLE T, HALL M N. TOR, a central controller of cell growth[J]. Cell, 2000, 103(2): 253-262. DOI:10.1016/S0092-8674(00)00117-3 |
[7] |
SARBASSOV D D, ALI S M, SABATINI D M. Growing roles for the mTOR pathway[J]. Current Opinion in Cell Biology, 2005, 17(6): 596-603. DOI:10.1016/j.ceb.2005.09.009 |
[8] |
SAXTON R A, SABATINI D M. mTOR signaling in growth, metabolism, and disease[J]. Cell, 2017, 168(6): 960-976. DOI:10.1016/j.cell.2017.02.004 |
[9] |
TAN B, YIN Y L, KONG X F, et al. L-arginine stimulates proliferation and prevents endotoxin-induced death of intestinal cells[J]. Amino Acids, 2010, 38(4): 1227-1235. DOI:10.1007/s00726-009-0334-8 |
[10] |
D'ANTONA G, RAGNI M, CARDILE A, et al. Branched-chain amino acid supplementation promotes survival and supports cardiac and skeletal muscle mitochondrial biogenesis in middle-aged mice[J]. Cell Metabolism, 2010, 12(4): 362-372. DOI:10.1016/j.cmet.2010.08.016 |
[11] |
LIANG C Z, CURRY B J, BROWN P L, et al. Leucine modulates mitochondrial biogenesis and SIRT1-AMPK signaling in C2C12 myotubes[J]. Journal of Nutrition and Metabolism, 2014, 2014: 239750. |
[12] |
QIU F M, CHEN Y R, LIU X Y, et al. Arginine starvation impairs mitochondrial respiratory function in ASS1-deficient breast cancer cells[J]. Science Signaling, 2014, 7(319): ra31. DOI:10.1126/scisignal.2004761 |
[13] |
MMEIGER A J, DUBBELHUIS P F. Amino acid signalling and the integration of metabolism[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2004, 313(2): 397-403. DOI:10.1016/j.bbrc.2003.07.012 |
[14] |
MORITA M, GRAVEL S P, CHÉNARD V, et al. mTORC1 controls mitochondrial activity and biogenesis through 4E-BP-dependent translational regulation[J]. Cell Metabolism, 2013, 18(5): 698-711. DOI:10.1016/j.cmet.2013.10.001 |
[15] |
RAMANATHAN A, SCHREIBER S L. Direct control of mitochondrial function by mTOR[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2009, 106(52): 22229-22232. DOI:10.1073/pnas.0912074106 |
[16] |
XIAO H, WU M M, SHAO F Y, et al. Metabolic profiles in the response to supplementation with composite antimicrobial peptides in piglets challenged with deoxynivalenol[J]. Journal of Animal Science, 2015, 93(3): 1114-1123. DOI:10.2527/jas.2014-8229 |
[17] |
VISIGALLI R, BARILLI A, BUSSOLATI O, et al. Rapamycin stimulates arginine influx through CAT2 transporters in human endothelial cells[J]. Biochimica et Biophysica Acta:Biomembranes, 2007, 1768(6): 1479-1487. DOI:10.1016/j.bbamem.2007.02.016 |
[18] |
TUÑÓN M J, SÁNCHEZ-CAMPOS S, GUTIÉRREZ B, et al. Effects of FK506 and rapamycin on generation of reactive oxygen species, nitric oxide production and nuclear factor kappa B activation in rat hepatocytes[J]. Biochemical Pharmacology, 2003, 66(3): 439-445. DOI:10.1016/S0006-2952(03)00288-0 |
[19] |
HABIB S L. Mechanism of activation of AMPK and upregulation of OGG1 by rapamycin in cancer cells[J]. Oncotarget, 2011, 2(12): 958-959. |
[20] |
WALTERS H E, COX L S. mTORC inhibitors as broad-spectrum therapeutics for age-related diseases[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2018, 19(8): 2325. DOI:10.3390/ijms19082325 |
[21] |
SARBASSOV D D, ALI S M, SENGUPTA S, et al. Prolonged rapamycin treatment inhibits mTORC2 assembly and Akt/PKB[J]. Molecular Cell, 2006, 22(2): 159-168. DOI:10.1016/j.molcel.2006.03.029 |
[22] |
WILKINSON J E, BURMEISTER L, BROOKS S V, et al. Rapamycin slows aging in mice[J]. Aging Cell, 2012, 11(4): 675-682. DOI:10.1111/acel.2012.11.issue-4 |