2. 邓州市职业技术学校, 邓州 474150
, ZHAO Yumin1,2, CHEN Zhengyuan1, WANG Bijun1, LUO Xia1, WANG Qing1, HE Guolin1, XIONG Tianqin1, SANG Chuanlan1
2. Dengzhou Vocational and Technical College, Dengzhou 474150, China
肠道黏膜屏障、肠道菌群及其代谢产物等共同组成肠道微生态，它们之间相互作用形成一种动态平衡。在这种动态平衡中，肠道黏膜屏障起着重要的作用[1]，肠黏膜屏障主要包括机械屏障、免疫屏障、生物屏障和化学屏障等，它不仅能够保持肠道的稳态，而且能有效防止致病物质的入侵和菌群内毒素的位移[2-4]。与肠黏膜屏障密切相关的肠道菌群对肠黏膜屏障的正常运行起着重要的作用。在肠道定植的微生物中99%以上为细菌，这些细菌按一定的比例存在于肠道内维持着肠道微生态的动态平衡[5]。当肠道菌群失调时会打破这种动态平衡，从而引发一系列疾病。目前研究认为肥胖、心血管疾病、老年性痴呆、非酒精性脂肪肝等多种疾病与肠道菌群失调相关[6-10]，也正因为如此，肠道菌群成为近年来国内外肠道稳态研究中的热点。头孢曲松钠是常用的肠道菌群失调模型的造模剂，动物试验表明头孢曲松钠重复多次灌胃会使得小鼠肠道菌群中变形菌门和拟杆菌门的数量显著下降，厚壁菌门的数量增加，出现真菌的局部感染，大剂量头孢曲松处理会导致小鼠肠道菌群发生重度紊乱[11-13]。但是头孢曲松钠处理过程中肠道菌群的动态变化过程，以及相应状态下肠黏膜屏障和肝脏功能改变目前还未见报道。因此，本试验利用头孢曲松钠模拟肠道菌群失调的动态过程，探究此过程中肠道菌群的具体变化及肠黏膜屏障和肝脏功能的改变，以期为肠道菌群失调相关疾病提供一个治疗方向。
1 材料与方法 1.1 试验材料6~8周龄无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级近交系BALB/c小鼠60只，雌雄各占1/2，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司(动物合格证编号：NO.37009200010112)，饲养于广州中医药大学实验动物中心SPF级动物室。头孢曲松钠购自湖南科伦制药有限公司，水合氯醛购自天津市大茂化学试剂厂，白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶联免疫吸附测定试验(ELISA)检测试剂盒购自eBioscience公司，谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，伊红、苏木素购自广州维格斯生物科技有限公司，闭锁小带蛋白-1(zonula occluden-1，ZO-1)抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，免疫组织化学试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。
1.2 试验方法 1.2.1 小鼠肠道菌群失调模型建立60只BALB/c小鼠适应性喂养3 d后，随机分为正常组(30只)、模型组(30只)。模型组灌胃给予0.02 mL/g BW的头孢曲松钠溶液(头孢曲松钠浓度为0.6 g/mL)，正常组灌胃给予同等体积的蒸馏水，分别于造模第3天、第6天、第10天时，每组取10只小鼠进行相应指标检测。
1.2.2 一般情况观察将盲肠结扎后剪下称重，然后于超净工作台中取盲肠内容物放于无菌的1.5 mL EP管中液氮速冻，再将盲肠称重，通过2次称重差值计算盲肠内容物重量。
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取回肠1 cm，漂洗干净后固定于4%多聚甲醛中24 h，按照常规的方法制备成石蜡块后，切4 μm薄片后HE染色，光学显微镜下观察肠道组织病理变化。
1.2.4 小鼠回肠组织ZO-1阳性表达观察取1.2.3制备的石蜡块切4 μm薄片，常规脱蜡水化、微波法抗原修复3次，按照免疫组织化学试剂盒步骤进行封闭和ZO-1抗体孵育，封片后于光学显微镜下观察各组小鼠回肠组织ZO-1阳性表达情况。
1.2.5 小鼠回肠组织超微结构观察取回肠末端分割成1 mm3，放入配制好的电镜缓冲液中固定4 h(4 ℃)，然后于1%的锇酸-0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.4)中室温(20 ℃)固定2 h。0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.4)漂洗3次，每次15 min；梯度乙醇和丙酮逐级脱水，然后丙酮: 812包埋剂=1 : 1渗透2~4 h，丙酮: 812包埋剂=2 : 1渗透过夜，纯812包埋5~8 h，37 ℃烤箱过夜，60 ℃烤箱聚合48 h；超薄切片机切80 nm超薄切片，铀铅双染色(2%醋酸铀饱和酒精溶液、枸橼酸铅，各染色15 min)，切片室温干燥过夜；置HT7700透射电子显微镜下观察，采集图像分析。
1.2.6 小鼠肠组织匀浆中细胞因子含量检测取肠组织0.1 g加入生理盐水0.9 mL在冰上充分匀浆，4 ℃下3 500 r/min离心15 min，取上清液用双抗体夹心ELISA法检测肠组织匀浆中TNF-α、IL-1β含量的变化，具体操作严格按照试剂盒说明书进行。
1.2.7 小鼠肠道微生物16S rDNA高通量序列测定取0.2 g小鼠盲肠内容物，提取出总细菌DNA，由深圳华大基因公司进行16S rDNA基因测定，通过MiSeq平台进行Paired-end测序，根据结果分析不同组别肠道菌属的变化情况。
1.2.8 小鼠肝脏功能指标检测肝脏称重后，取肝左叶1 cm3左右放于4%多聚甲醛中固定24 h，HE染色检测肝脏组织病理变化。取肝组织0.1 g加入生理盐水0.9 mL在冰上充分匀浆，4 ℃下3 500 r/min离心15 min，取上清液采用酶标仪法检测肝组织匀浆中ALT、AST的活性。
1.3 统计分析数据用平均值±标准差表示，采用SPSS 20.0统计软件进行分析，以P＜0.05为差异显著标准，以P＜0.01为差异极显著标准。
2 结果与分析 2.1 不同程度菌群失调对小鼠体重及脏器指数的影响与正常组相比，头孢曲松钠处理不同时间内模型组小鼠体重未见显著性的变化(P > 0.05)，但总体来看小鼠体重随造模时间的延长呈上升的趋势(图 1-A)；盲肠指数和盲肠内容物指数结果(图 1-B和图 1-C)显示，头孢曲松钠处理3、6或10 d时模型组盲肠指数和盲肠内容物指数均较正常组极显著上升(P < 0.01)；随着造模时间的延长，盲肠内容物指数上升，头孢曲松钠处理3 d时极显著高于头孢曲松钠处理6和10 d时(P < 0.01)。通过观察盲肠形态(图 1-D)发现，头孢曲松钠处理不同时间时模型组的盲肠均较正常组胀大。
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A：体重指数；B：盲肠指数；C：盲肠内容物指数；D：盲肠形态观察。与正常组相比，模型组数据点标注*表示表示差异显著(P＜0.05)，* *表示差异显著(P＜0.01)；与头孢曲松钠处理3 d时相比，模型组数据点标注#表示差异显著(P＜0.05)，##表示差异显著(P＜0.01)。下图同。 A: body weight index; B: cecum index; C: cecal contents index; D observation of cecum morphology. Compared with normal group, date points of model group with * means significant difference (P < 0.05), and with * * means significant difference (P < 0.01); compared with administration of ceftriaxone sodium for 3 days, date points of model group with # means significant difference (P < 0.05), and with ## means significant difference (P < 0.01). The same as below. 图 1 小鼠体重及脏器指数的变化 Fig. 1 Body weight and organ indexes changes in mice (n=10) |
不同程度菌群失调小鼠肠道菌群门水平分析结果如表 1所示。正常组和模型组小鼠肠道菌群中以拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)为相对优势菌门，所占比例较大，变形菌门(Proteobacteria)也占有一定的比例。头孢曲松钠处理3 d时模型组小鼠肠道菌群中拟杆菌门、厚壁菌门仍然作为优势菌门存在，但随着造模时间的延长，拟杆菌门所占比例大幅下降，优势菌门转变为变形菌门和厚壁菌门，同时蓝藻细菌门(Cyanobacteria)和脱铁杆菌门(Deferribacteres)的相对丰度有所上升，且随着造模时间的延长，脱铁杆菌门的相对丰度逐渐上升。
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表 1 小鼠肠道菌群门水平相对丰度分析 Table 1 Relative abundance analysis of intestinal flora at phylum level in mice (n=3) |
小鼠肠道菌群属水平分析结果如表 2所示。正常组小鼠肠道菌群中乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、普氏菌属(Prevotella)为相对优势菌属，所占比例较大。与正常组相比，头孢曲松钠处理后乳杆菌属(处理3 d时，P < 0.05；处理6和10 d时，P > 0.05)、双歧杆菌属(处理3和10 d时，P < 0.05；处理6 d时，P < 0.01)和普氏菌属(处理3、6和10 d时，P > 0.05)的相对丰度不同程度下降，不动杆菌属(Acinetobacter)转为相对优势菌属，且随着造模时间延长，其优势地位愈加明显。值得注意的是，随着头孢曲松钠处理时间的延长，金黄杆菌属(Chryseobacterium)、普氏菌属、假单胞菌属(Pseudomonas)的相对丰度逐渐升高，而芽孢杆菌属(Bacillus)、Lotus、葡萄球菌属(Staphylococcus)相对丰度逐渐降低，趋向正常组小鼠肠道菌群结构，这体现了机体的自我调节过程。
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表 2 小鼠肠道菌群属水平相对丰度分析 Table 2 Relative abundance analysis of intestinal flora at genus level in mice (n=3) |
Beta多样性通过QIIME(v1.80)进行分析，由于不同样品的测序深度不一样，需要对每个样品的序列数进行统一。每个样品按所有样品中序列数最少的样品的序列数随机抽取序列，生成新的OTU table biom文件，并用该文件计算Beta多样性距离，距离越大则表明样品间的差异性越大。
图 2-A为样品的聚类分析图，图中相同颜色的样品表示属于同一个组。样品越靠近，枝长越短，说明2个样品的物种组成越相似。结果发现，在头孢曲松钠处理3 d时，正常组和模型组菌群聚类存在交集，随着头孢曲松钠处理时间的延长，同组样品聚集在一起，而不同组间菌群结构不再聚集，说明正常组和模型组的菌群结构相似性差。图 2-B为样品的Bray-Curtis距离，值在0~1之间，值越大则表示样品间的差异越大，热图中还对样本间做了聚类分析，通过聚类树也可以看出样本间的距离关系，从图可知，颜色最蓝的部分分别是样品和自身对应，而正常组和模型组各样品之间对应的颜色在第3天时相对于第6天、第10天时更淡，这也说明随着头孢曲松钠处理时间的延长肠道菌群失调程度加深。这一结果与样品的聚类分析图相对应。
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A: UPGMA系统进化树；B：Beta多样性热图。C表示正常组；M表示模型组。 A: UPGMA phylogenetic tree; B: the heatmap of Beta diversity. C expresses as control group; M expresses as model group. 图 2 小鼠肠道菌群Beta多样性分析 Fig. 2 Beta diversity analysis of intestinal flora in mice (n=3) |
与正常组相比，头孢曲松钠处理3、6 d时模型组小鼠肠组织匀浆中TNF-α、IL-1β含量未见显著变化(P > 0.05)，继续灌胃头孢曲松钠到第10天时，模型组小鼠肠组织匀浆中TNF-α、IL-1β的含量极显著上升(P < 0.01，图 3-A和图 3-B)。
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A: TNF-α含量变化趋势图; B: IL-1β含量变化趋势图。 A: figure of the change trend of TNF-α content; B: figure of the change trend of IL-1β content. 图 3 小鼠肠组织匀浆中炎症因子含量的变化趋势 Fig. 3 Change trends of proinflammatory cytokine contents in intestinal homogenate of mice (n=8) |
回肠HE染色切片观察发现，正常组肠黏膜结构完整，未见溃疡、坏死，绒毛排列整齐、致密；与之相比，模型组组均出现肠黏膜上皮水肿、绒毛倒伏或脱落，肠间隙变大的现象(图 4-A)。
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A：回肠组织HE染色切片(200×)；B：免疫组织化学法显示回肠组织中ZO-1的阳性表达(400×)；C：透射电子显微镜观察回肠黏膜上皮细胞的超微结构(5 000×)。 A: HE staining sections of ileum tissue (200×); B: The positive expression of ZO-1 in ileum tissue by IHC method (400×); C: ultrastructural features of ileum mucosal enterocytes by TEM (5 000×). 图 4 小鼠肠黏膜上皮屏障的变化 Fig. 4 Change of intestinal mucosal barrier in mice |
ZO-1表达于肠道线毛上皮细胞胞浆内，免疫组织化学结果显示，正常组中绒毛顶端胞质及绒毛周边部颜色棕色较深，说明ZO-1阳性表达较多(图 4-B)，而模型组ZO-1阳性表达降低，尤以头孢曲松钠处理10 d后的变化最为明显。
正常组肠黏膜上皮细胞间的紧密连接结构完整，可见桥粒结构(图 4-C中红色箭头标识)，微绒毛排列紧密整齐(图 4-C中黑色箭头标识)；模型组肠黏膜上皮细胞紧密连接结构破坏(图 4-C中黄色箭头标识)，桥粒结构缺失，微绒毛排列紊乱，外观极不平整，且随着头孢曲松钠处理时间的延长，更容易观察到上述现象。
2.5 不同程度菌群失调对小鼠肝脏功能的影响肝脏HE染色切片显示，正常组肝脏中肝小叶结构完整，围绕中央静脉呈放射状排列，无肝细胞坏死及纤维组织增生现象。模型组组可见肝细胞增大，胞浆淡染，细胞膜清晰，肝细胞类似气球样肿胀的现象(图 5-A，红色箭头标识)。
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A：肝组织HE染色切片(200×)；B：肝组织匀浆中ALT活性的变化趋势；C：肝组织匀浆中AST活性的变化趋势。 A: HE staining sections of liver tissue (200×); B: change trend of ALT activity in liver homogenate; C: change trend of AST in liver homogenate. 图 5 小鼠肝脏功能指标的变化 Fig. 5 Changes of liver function indexes in mice (n=8) |
肝组织匀浆中ALT、AST活性检测结果显示，与正常组相比，头孢曲松钠处理3、6 d时模型组ALT活性极显著上升(P < 0.01)，头孢曲松钠处理3、6、10 d时模型组AST活性极显著上升(P < 0.01)；随着头孢曲松钠处理时间的延长，ALT的活性呈一定的上升趋势，但不具有统计学差异(图 5-B)(P＞0.05)。
3 讨论头孢曲松钠是一种β-内酰胺类抗生素，能通过阻碍细胞壁黏肽合成，抑制形成细胞壁，使得细菌膨胀裂解，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌及肠道其他菌群都具有较强的抗菌作用。它能影响肠道优势菌群，导致优势菌群的数量发生变化或移位，从而引起菌群失调。与其他抗生素相比，头孢曲松钠的细胞外膜和组织的穿透力更强、消除半衰期更长，能够更广泛地抑制肠道菌群，且口服后不被吸收，在血浆中检测不到[14]，重复多次口服给药后可引起肠道菌群失调，目前国内外多篇报道表明头孢曲松钠复制菌群失调模型具有稳定性和重复性[11, 15-16]，是目前较为成熟的肠道菌群失调模型的造模剂。但头孢曲松钠不同造模时间段内肠道菌群、肠黏膜上皮屏障、肠道内炎症因子以及肝脏的变化情况未见研究报道，故本试验利用头孢曲松钠来模拟肠道菌群失调的动态过程，观察在菌群失调过程中肠黏膜屏障及肝脏功能的改变。
抗生素诱导的肠道菌群失调模型中肠道菌群的变化表现为变形菌门和拟杆菌门的相对丰度显著下降，厚壁菌门的相对丰度增加，真菌的局部感染出现[11-13]。本研究结合16S rDNA技术，对肠道菌群在门和属水平的变化进行了更具体的分析，结果发现，随着造模时间的延长，菌群失调程度逐渐加深，门水平中优势菌门由原来的拟杆菌门和厚壁菌门转变为变形菌门和厚壁菌门，属水平中金黄杆菌属、假单胞菌属、嗜冷杆菌属相对丰度逐渐升高；Beta多样性的结果也表明正常组和模型组之间菌群结构相似度逐步降低。
肠道菌群和肠黏膜屏障结构与功能密切相关[17]，肠道菌群失调时，肠道通透性增加，肠腔内细菌发生移位，促使肠源性感染的发生，同时内毒素被吸收入血，激活体内炎症反应，释放一系列炎症因子，最终引起多脏器功能衰竭[18-20]。本研究中回肠HE染色结果显示，肠道菌群失调初期肠黏膜上皮水肿、绒毛倒伏或脱落，肠间隙变大，且这一现象在整个菌群失调过程中持续存在；肠道中TNF-α和IL-1β含量在菌群失调初期未见显著变化，随着肠道菌群失调程度的加重，肠道中TNF-α、IL-1β的含量极显著上升。炎症因子的升高可使得肠黏膜过氧化和结构发生变化，表现为紧密连接(TJs)结构的改变[21]。通过肠道透射电镜结合免疫组织化学法观察肠道紧密连接的变化，结果发现紧密连接蛋白ZO-1的阳性表达逐渐降低，肠道紧密连接结构破坏，桥粒结构缺失，微绒毛排列紊乱，外观极不平整，且随着造模时间的延长，更容易观察到上述现象。
由于肠-肝轴的联系，肝脏直接暴露于肠道微生物及其产物中，当肠道菌群失调时，肠壁的通透性和完整性受到影响，大量的细菌产物能够进入肝脏，会导致肝脏功能受损[22-23]。因此，本研究也对肝脏功能指标进行了检测，结果发现，模型组肝脏经HE染色后可见肝细胞增大，胞浆淡染，肝细胞出现类似气球样肿胀的现象。肝脏中ALT和AST的活性是反映肝脏损伤常用的指示性指标，本研究对肝脏中两者活性的变化进行了检测，结果显示，模型组肝组织匀浆中ALT(处理3 d时除外)、AST活性均较正常组极显著上升，随着头孢曲松钠处理时间的延长，ALT的活性呈上升趋势。ALT在肝实质细胞胞浆内合成，其活性的升高提示肝细胞膜破坏和细胞膜通透性增加；AST在肝实质线粒体内合成，其活性升高表示肝细胞线粒体损伤。以上结果提示，肠道菌群失调过程中会逐步破坏肝细胞的细胞膜，但对线粒体的损伤较小。值得注意的是，在肝组织匀浆中ALT活性逐渐升高的过程中，肠道菌群中厚壁菌门、金黄杆菌属、普氏菌属、假单胞菌属的相对丰度也表现出逐渐增加的趋势，这一结果提示，上述菌门或菌属相对丰度的改变可能起到影响肝脏功能的作用，对这些菌门或菌属的表达进行调节，有望为肝脏损伤疾病提供一个治疗方向。
4 结论综上所述，肠道菌群失调增加了肠壁的通透性，破坏了肠上皮的完整性，进而影响肝脏功能，且肝脏损伤程度随着菌群失调的延长而加重。
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