2. 河北省牛羊胚胎工程技术研究中心, 保定 071000
2. Research Center of Cattle and Sheep Embryo Engineering Technique of Hebei, Baoding 071000, China
随着人们食品安全意识的提高,饲料安全也逐渐成为饲料的第一属性。啤酒酵母是啤酒生产中常用的发酵酵母,因具有安全、高效、营养丰富等优点,其作为优质的蛋白质饲料在促进畜禽生长、提高畜禽免疫力、调节肠道微生态等方面的潜力也受到了越来越多的关注。啤酒酵母含有丰富的蛋白质、核酸、维生素、矿物质以及多种生物活性物质[1]。阎桂玲等[2]在爱拔益加(AA)肉仔鸡饲粮中添加0.50%的啤酒酵母甘露寡糖,可显著减少盲肠内大肠杆菌和沙门氏菌的数量,增加双歧杆菌的数量;饲粮中添加0.05%和0.10%的啤酒酵母甘露寡糖则可提高肉仔鸡的免疫机能。我国是啤酒生产大国,每年啤酒产量超过4 000万t,但在生产过程中产生的啤酒酵母(约占啤酒产量的0.3%)却没有得到充分的利用[3]。随着相关研究的不断深入,啤酒酵母在多种畜禽生产中的应用效果得到广泛研究,但其对獭兔肠道内环境及营养物质消化率方面的研究鲜有报道。因此,本试验通过研究饲粮中添加不同水平啤酒酵母对生长獭兔盲肠微生物及营养物质消化率的影响,为其在兔生产中的应用提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料及基础饲粮啤酒酵母由河北康源润生生物有限公司提供,过200目筛。生产批号:(2016)02911。红褐色粉末状,蛋白质含量为45%,多糖含量大于25%。
基础饲粮参照谷子林[4]推荐的獭兔营养需求进行配制,其组成及营养水平见表 1,饲粮均制成直径4 mm、长10 mm的颗粒饲粮。
按公母比为1:1选取30日龄、体重相近的健康白色獭兔120只,随机分为4组,每组30个重复,每个重复1只。对照组饲喂基础饲粮,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组为试验组,分别饲喂在基础饲粮中以5、10、15 kg/t的啤酒酵母等量替代豆粕的试验饲粮。
试验前对兔舍进行清理和消毒,常规饲养管理,试验兔单笼饲养,自然通风和光照,自由采食和饮水。试验期间每天08:00和18:00各饲喂1次。预试期10 d,正试期60 d。
1.3 测定指标和方法 1.3.1 盲肠微生物分别在正试期的第20天、第40天、第60天进行屠宰试验,每次每组选取体重相近的6只试验兔(公母各1/2),颈椎脱臼处死,解剖并结扎盲肠。无菌操作将同一部位盲肠内容物在同一时间放入无菌冻存管中,立即放入液氮,之后转入-80 ℃超低温冰箱保存。
每组分别选取3份粪便样品,每份准确称取0.2 g置于2 mL离心管中,采用DNA提取试剂盒提取粪便DNA,紫外分光光度计测定DNA浓度,0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度,后将DNA样品测序分析(由北京百迈客生物科技股份有限公司完成)。
1.3.2 营养物质消化率饲养试验结束前7 d,将试验兔转入消化代谢笼,进行消化试验。试验采用全收粪法,期间记录各试验兔每天的实际采食量,每天于固定时间收集全部粪便,称重后分为2份,一份加10%盐酸固氮,用于测定粗蛋白质(CP)含量;另一份用于测定其他营养物质含量。试验结束后将收集的粪便样品烘干粉碎,放入样品袋中备测。
各常规营养成分的测定方法如下:干物质(DM)含量使用水分皿、烘箱、干燥器等测定(GB/T 6435—1986);总能(GE)使用友欣YX-ZR自动量热仪测定(GB/T 14909—2005);钙(Ca)含量采用高锰酸钾法测定(GB/T 6436—2002),主要器材为三角瓶、滴定管、容量瓶、移液管等;磷(P)含量采用钼黄比色法(GB/T 6437—2002),使用紫外可见分光光度计(光谱722型)测定;粗蛋白质含量采用凯氏定氮法(GB/T 6432—1994),使用Foss Kjeltec8400全自动凯氏定氮议测定;粗纤维(CF)、中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量采用ANKOM A2000i型全自动纤维素分析仪测定;粗脂肪(EE)含量采用索氏抽提法测定(GB/T 6433—2006),主要器材为烘箱、水浴锅、干燥器、提取装置等。
1.4 数据统计分析使用QIIME 1.8.0软件中的UCLUST对Tags在97%的相似度水平下进行聚类,获得操作分类单元(operational taxonomic units,OTU),并基于Silva(细菌)分类学数据库对OTU进行分类学注释。基于OTU分析所得结果,对样品在各个分类水平上进行分类学分析,从而得到各样品在门、纲、目等水平上的群落结构图、物种聚类热图等,得到微生物群落结构组成。采用Excel 2007和SPSS 17.0统计软件对数据进行处理和分析,用one-way ANOVA检验各组数据间差异是否显著,用LSD法进行多重比较,P < 0.05表示差异显著,P < 0.01表示差异极显著。
2 结果与分析 2.1 啤酒酵母对生长獭兔盲肠微生物的影响采用随机抽样的方法,模拟输入序列数目与OUT数量产出间关系,绘制稀释曲线。结果表明,所有样品稀释曲线逐渐趋于平台期,说明实际测序量足以覆盖微生物群落多样性。
2.1.1 样品reads数及OTU统计采用Illumina HiSeq测序平台对样品中16S rRNA基因的V3~V4区进行检测,39个样品测序共获得3 118 072对reads,双端reads拼接、过滤后共产生2 587 518条Clean Tags,平均每个样品产生66 347条Clean Tags。
由图 1可知,按照组别进行分析,各组獭兔盲肠微生物的OTU的数量在819~890之间;且随啤酒酵母添加量的增加而呈现OTU数量逐渐增多的趋势。利用SPSS 19.0进行单因素方差分析,由表 2可见,60日龄各试验组獭兔盲肠微生物OTU数量均高于对照组(P>0.05),其中试验Ⅰ组OTU数量最多;80日龄各试验组獭兔盲肠微生物OTU数量均高于对照组(P>0.05),其中试验Ⅲ组OTU数量最多;100日龄各试验组獭兔盲肠微生物OTU数量均高于对照组(P>0.05),其中试验Ⅱ组OTU数量最多。OTU数量增多但差异不显著表明肠道菌群数量在一定范围内增加,更利于维持菌群的动态平衡,发挥消化、代谢和维持其免疫性能的作用。
Alpha多样性指数分析是对独立样品的物种多样性进行分析,Chao1和Ace指数用于衡量物种丰度的高低,Shannon和Simpson指数用于衡量物种多样性的丰富程度。Shannon指数越高,Simpson指数越低,表明样品的物种多样性越丰富。使用Mothur软件,对各个样品的Alpha多样性指数进行评估。为比较样品间的多样性指数,分析时将样品所含序列数进行标准化。
由表 3可见,獭兔不同日龄时,啤酒酵母添加量对獭兔盲肠微生物Alpha多样性有一定影响。80日龄时,各试验组Ace指数显著高于对照组(P < 0.05),试验Ⅰ、Ⅲ组Chao1指数显著高于对照组(P < 0.05),说明80日龄时獭兔盲肠的微生物数量得到提升,其中以试验Ⅲ组提升效果最明显;100日龄时,试验Ⅱ组Shannon指数显著高于对照组(P < 0.05),说明试验Ⅱ组獭兔盲肠的微生物多样性高于对照组。但是,其他日龄各试验组的Shannon和Simpson指数与对照组相比差异不显著(P>0.05)。
Beta多样性是对不同生态系统之间多样性进行比较,表示出物种组成沿环境梯度或在群落之间的变化率,用来表示生物种类对环境异质性的反映。通过图中各样品点的远近观察个体或者群体间的差异,坐标图上距离越近的样品,相似性越大。由图 2可知,60日龄时,试验组与对照组相似性较大,但有一定差异;80和100日龄时,试验组与对照组均能够明显的区分开来,表明试验组与对照组的微生物多样性存在明显差异。
由表 4可知,啤酒酵母对生长獭兔干物质、总能、磷、粗蛋白质和中性洗涤纤维的消化率均有显著影响(P<0.05),各试验组干物质、总能、磷、粗蛋白质和中性洗涤纤维的消化率均高于对照组高,且均以试验Ⅱ组最高,分别比对照组高13.74%(P<0.05)、12.55%(P<0.05)、31.27%(P<0.05)、20.07%(P<0.05)、64.52%(P<0.05)。啤酒酵母对生长獭兔钙的消化率有改善趋势,以试验Ⅱ组最高,比对照组高21.73%(P>0.05)。
高通量测序技术和生物信息学的不断进步使得二代测序的应用领域得到了广泛扩展,近年来,越来越多的研究将其应用到畜禽肠道菌群的结构和分类上[5]。肠道微生物是宿主的一个额外的“器官”,对动物消化、代谢和免疫性能的维持及菌群平衡具有重要作用。
文献显示,在门水平上,獭兔肠道菌群以厚壁菌门(Firmicutes)为优势菌,之后依次为拟杆菌门(Bacteroidetes)、无壁菌门(Tenericutes)、变形菌门(Proteobacteria)[6]。厚壁菌门属于革兰氏阳性、有孢子形成、专性厌氧的球状或杆状菌种,包括肠球菌科、乳酸杆菌科和链球菌属。拟杆菌门是一类具有促进碳水化合物发酵,参与糖类、胆汁酸和类固醇代谢如分解蛋白胨或葡萄糖,产生琥珀酸、乙酸、甲酸、乳酸和丙酸的菌群,主要功能在于吸收和降解多糖[7]。这2类菌的稳定对獭兔的肠道健康具有十分重要的意义。蓝细菌门菌种在不良环境中可形成具有极高抵抗力的孢子。有些肠道中蓝细菌门菌种产生的神经毒素、肝毒素、细胞毒素及内毒素能够对人体及动物的健康构成威胁。在属水平上进行分析,獭兔肠道菌群优势菌主要为杆菌属(Bacterium)、毛螺菌科(Lachnospiraceae_NK4A136_group)、瘤胃球菌(Ruminococcaceae_NK4A214_group、Ruminococcaceae_V9D2013_group、Ruminococcus_1、Ruminococcaceae_UCG-014、Ruminococcaceae_UCG-010)等。本试验结果显示,饲粮中添加啤酒酵母并未对獭兔属水平上的微生物群落造成明显影响。獭兔盲肠微生物多样性指数的分析结果显示,与对照组相比,80日龄时,各试验组Ace指数显著高于对照组,试验Ⅰ、Ⅲ组Chao1指数显著高于对照组;100日龄时,试验Ⅱ组Shannon指数显著高于对照组,其他日龄各试验组的Shannon和Simpson指数与对照组相比差异不显著。结合数据,可以推测獭兔饲粮中添加啤酒酵母有升高獭兔盲肠内微生物丰度趋势,增加了獭兔盲肠微生物的多样性,对维持獭兔盲肠中的微生物平衡具有促进作用。产生这一结果可能的原因是啤酒酵母中含有酵母璧多糖,酵母璧多糖可以调节肠道菌群平衡,改善肠道菌群结构[8-9],同时酵母璧多糖还具有吸附作用,可以吸附霉菌毒素及部分有害菌[10-11]。
3.2 啤酒酵母对生长獭兔营养物质消化率的影响动物生长前期,由于消化道容量小,消化能力相对较弱,但由于生长强度较大,对营养的需求量大,而植物性饲料原料中含有果胶和植酸等抗营养因子,不仅不易被动物体内源酶所分解,而且易产生黏性,减少营养物质与内源酶相互作用的机会,从而影响营养物质的消化和吸收。因此,筛选应用助消化型饲料添加剂,辅助提高幼龄动物对饲料消化能力,一直是动物营养研究热点。Bontempo等[12]和Shen等[13]研究发现,酵母源产品对仔猪肠道形态有积极效果。饲粮中添加酵母抽提物可以促进仔猪生长,显著改善仔猪饲料转化率[14]。Huff等[15]在人工接种大肠杆菌火鸡的饲粮中添加100和200 g/t酵母细胞壁多糖后发现,接种大肠杆菌后火鸡的饲料转化效率显著改善。肖曼[16]的研究结果表明,饲粮中添加酵母培养物可以提高肉仔鸡的营养物质消化率。本试验结果显示,饲粮添加啤酒酵母对营养物质消化率有改善作用,与他人结果相近,其作用机理可能是酵母璧多糖有改善肠道微生态、促进有益菌的增殖[17]、抑制有害菌的定植以及提高肠道消化酶活性的作用,肠道内环境的改变促进了肠道对营养物质的消化吸收[18];同时,啤酒酵母产生的小肽也可以一定程度上提高肠道消化酶的活性,有益于对营养物质的消化利用[19]。
4 结论啤酒酵母可以丰富獭兔盲肠微生物种群,有助于獭兔盲肠微生物区系稳态的建立,提高营养物质消化率。
[1] |
郑玲玲. 獭兔养殖现状及饲养管理技术[J]. 中国动物保健, 2016, 18(7): 20-21. |
[2] |
阎桂玲, 袁建敏, 呙于明, 等. 啤酒酵母甘露寡糖对肉鸡肠道微生物及免疫机能的影响[J]. 中国农业大学学报, 2008, 13(6): 85-90. DOI:10.3321/j.issn:1007-4333.2008.06.015 |
[3] |
吴振, 江建梅, 舒媛, 等. 啤酒酵母及其衍生品的应用研究进展[J]. 中国酿造, 2014, 33(10): 10-13. DOI:10.11882/j.issn.0254-5071.2014.10.003 |
[4] |
谷子林. 家兔饲料的配制与配方[M]. 北京: 中国农业出版社, 2002.
|
[5] |
杨翠, 李祖明. 分子生物学技术在肠道微生物研究中的应用进展[J]. 中国微生态学杂志, 2017, 29(2): 229-233, 238. |
[6] |
SALYERS A A. Bacteroides of the human lower intestinal tract[J]. Annual Review of Microbiology, 1984, 38: 293-313. DOI:10.1146/annurev.mi.38.100184.001453 |
[7] |
容祖华, 梁少聪, 路浚齐, 等. 间歇性断食对老年前期肥胖大鼠肠道菌群及代谢的影响[J]. 南方医科大学学报, 2017, 37(4): 423-430. DOI:10.3969/j.issn.1673-4254.2017.04.01 |
[8] |
CUSKIN F, LOWE E C, TEMPLE M J, et al. Corrigendum:human gut bacteroidetes can utilize yeast mannan through a selfish mechanism[J]. Nature, 2015, 520(7547): 388. |
[9] |
LI T, DONG Z R, GUO Z Y, et al. Mannose-mediated inhibitory effects of PA-MSHA on invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma via EGFR/Akt/IκBβ/NF-κB pathway[J]. Liver International, 2015, 35(4): 1416-1429. DOI:10.1111/liv.2015.35.issue-4 |
[10] |
李玉欣.毕赤酵母甘露寡糖对猪生产性能和免疫性能的影响[D].博士学位论文.北京: 中国农业大学, 2015: 2-13. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10019-1015584424.htm
|
[11] |
KOGAN G, KOCHER A. Role of yeast cell wall polysaccharides in pig nutrition and health protection[J]. Livestock Science, 2007, 109(1/2/3): 161-165. |
[12] |
BONTEMPO V, DI GIANCAMILLO A, SAVOINI G, et al. Live yeast dietary supplementation acts upon intestinal morpho-functional aspects and growth in weanling piglets[J]. Animal Feed Science and Technology, 2006, 129(3/4): 224-236. |
[13] |
SHEN Y B, PIAO X S, KIM S W, et al. Effects of yeast culture supplementation on growth performance, intestinal health, and immune response of nursery pigs[J]. Journal of Animal Science, 2009, 87(8): 2614-2624. DOI:10.2527/jas.2008-1512 |
[14] |
车炼强, 苏国旗, 胡亮, 等. 酵母抽提物替代血浆蛋白粉对断奶仔猪生产性能的影响[J]. 饲料工业, 2012, 33(14): 7-10. DOI:10.3969/j.issn.1001-991X.2012.14.002 |
[15] |
HUFF G R, HUFF W E, JALUKAR S, et al. The effects of yeast feed supplementation on turkey performance and pathogen colonization in a transport stress/Escherichia coli challenge[J]. Poultry Science, 2013, 92(3): 655-662. DOI:10.3382/ps.2012-02787 |
[16] |
肖曼.酵母培养物对肉仔鸡生产性能、营养物质利用率及肠道相关指标的影响[D].硕士学位论文.湛江: 广东海洋大学, 2013: 17-18. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10566-1013225094.htm
|
[17] |
IANNACCONE F, BOVERA F. Mannanoligosaccharides in rabbit nutrition:a review[J]. Journal of Nutritional Ecology and Food Research, 2013, 1(1): 2-11. DOI:10.1166/jnef.2013.1002 |
[18] |
IJI P A, SAKI A A, TIVEY D R. Intestinal structure and function of broiler chickens on diets supplemented with a mannan oligosaccharide[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2001, 81(12): 1186-1192. DOI:10.1002/(ISSN)1097-0010 |
[19] |
王恬, 傅永明, 吕俊龙, 等. 小肽营养素对断奶仔猪生产性能及小肠发育的影响[J]. 畜牧与兽医, 2003, 35(6): 4-8. DOI:10.3969/j.issn.0529-5130.2003.06.002 |