引用本文
马娅君,
卢昌文,
陈庆菊,
唐志如.
口服异常毕赤酵母AR
2016对昆明小鼠生长性能和安全性的影响[J]. 动物营养学报, 2019, 31(3): 1452-1462.
MA Yajun,
LU Changwen,
CHEN Qingju,
TANG Zhiru.
Effects of Orally
Pichia anonmala AR
2016 on Growth Performance and Safety of
Kunming Mice[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2019, 31(3): 1452-1462.
口服异常毕赤酵母AR2016对昆明小鼠生长性能和安全性的影响
西南大学动物科技学院, 西南大学生物饲料与分子营养实验室, 重庆 400715
收稿日期: 2018-08-31
基金项目: 国家自然科学基金项目（31772610）；国家重点研发计划（2018YFD0501000）；重庆市留学人才创新计划重点项目（cx2017024）；重庆市自然科学基金项目（cstc2016jcyjA1414）
摘要: 本试验旨在通过研究异常毕赤酵母AR2016菌株对昆明小鼠生长性能、血清生化指标、血常规和免疫功能的影响，综合评价异常毕赤酵母AR2016菌株的安全性。试验1：选择20只健康的昆明小鼠，随机分为2组，每组10只，雌雄各占1/2。按每10 g体重最大灌胃容量0.2 mL进行7 d经口毒性试验，对照组灌胃生理盐水，试验组灌胃异常毕赤酵母AR2016菌株发酵液（菌体浓度2×109 CFU/mL）。试验2：选择40只健康的昆明小鼠，随机分为4组，每组10只，雌雄各占1/2。每10 g体重最大灌胃容量0.2 mL进行28 d经口毒性试验，对照组灌胃生理盐水，低、中、高剂量组灌胃异常毕赤酵母AR2016菌株发酵液，菌体浓度分别为2×107、2×108、2×109 CFU/mL。结果表明：1）异常毕赤酵母AR2016菌株处理7或28 d后，小鼠无明显中毒现象，未出现死亡，属"无毒"级（最大耐受剂量>20 000 mg/kg）。2）与对照组相比，异常毕赤酵母AR2016菌株处理7 d后，试验组小鼠平均日采食量（ADFI）显著降低（P < 0.05）；异常毕赤酵母AR2016菌株处理28 d后，各剂量组小鼠ADFI显著提高（P < 0.05）。3）与对照组相比，异常毕赤酵母AR2016菌株处理7 d后，试验组小鼠血清白蛋白、尿素氮含量显著降低（P < 0.05），血清肌酐含量和谷草转氨酶活性显著提高（P < 0.05）；异常毕赤酵母AR2016菌株处理28 d后，各组间血清生化指标无显著变化（P>0.05）。4）异常毕赤酵母AR2016菌株处理7 d后，与对照组相比，试验组小鼠白细胞、红细胞压积及淋巴细胞数量显著提高（P < 0.05），试验组雄性小鼠血红蛋白含量显著高于对照组雄性小鼠（P < 0.05），试验组雄性小鼠红细胞数量显著高于试验组雌性小鼠（P < 0.05），试验组雌性小鼠中性细胞比率显著低于对照组雌性小鼠（P < 0.05），试验组雌性小鼠嗜酸性粒细胞数量显著高于对照组雌性小鼠（P < 0.05）；异常毕赤酵母AR2016菌株处理28 d后，各组间血常规指标无显著变化（P>0.05）。5）与对照组相比，异常毕赤酵母AR2016菌株处理7 d后，试验组小鼠血清中干扰素-γ（INF-γ）、肿瘤坏死因子-α含量显著提高（P < 0.05）；异常毕赤酵母AR2016菌株处理28 d后，高剂量组雌性小鼠血清INF-γ含量显著提高（P < 0.05）。综上，异常毕赤酵母AR2016菌株对昆明小鼠无毒，具较高生物安全性，可提高昆明小鼠ADFI，增强机体免疫功能，具有一定的开发利用价值。
关键词:
异常毕赤酵母AR2016
昆明小鼠
急性毒性
安全性
Effects of Orally Pichia anonmala AR2016 on Growth Performance and Safety of Kunming Mice
MA Yajun
, LU Changwen
, CHEN Qingju
, TANG Zhiru
Key Laboratory for Bio-Feed and Animal Nutrition, Southwest University, Chongqing 400715, China
Abstract: To comprehensively evaluate the bio-safety of Pichia anonmala AR2016 strain, this study was carried out to investigate effects of Pichia anonmala AR2016 strain on growth performance, serum biochemical indexes, hemogram indexes and immune function in Kunming mice. In experiment 1, a total of 20 Kunming mice were randomly assigned to one of two groups with 10 mice in each group (half male and half female). A 7-day oral toxicity test was performed at a dose of 0.2 mL per 10 g body weight; control group supplemented with normal saline, and experimental group supplemented with Pichia anonmala AR2016 strain at the concentration of 2×109 CFU/mL. In experiment 2, a total of 40 Kunming mice were randomly assigned to one of four groups with 10 mice in each group (half male and half female). A 28-day oral toxicity test was performed at a dose of 0.2 mL per 10 g body weight; control group supplemented with normal saline, low dose group, middle dose group and high dose group supplemented with Pichia anonmala AR2016 strain at concentrations of 2×107, 2×108, 2×109 CFU/mL, respectively. The results showed as follows:1) after 7 or 28 d treatment by Pichia anonmala AR2016 strain, no poisoning and death were found in mice, it was a "non-toxic" grade, and the maximum tolerated dose was more than 20 000 mg/kg. 2) Compared with the control group, after 7 d treatment by Pichia anonmala AR2016 strain, average daily feed intake (ADFI) of mice in experimental group significantly decreased (P < 0.05); after 28 d treatment by Pichia anonmala AR2016 strain, ADFI of mice in each dosage group significantly increased (P < 0.05). 3) Compared with the control group, after 7 d treatment by Pichia anonmala AR2016 strain, the contents of albumin and urea nitrogen in serum of mice in experimental group significantly decreased (P < 0.05), and serum creatinine content and aspartate transaminase activity significantly increased (P < 0.05); after 28 d treatment by Pichia anonmala AR2016 strain, serum biochemical indexes among groups had no significant difference (P>0.05). 4) After 7 d treatment by Pichia anonmala AR2016 strain, compared with the control group, white blood cell, hematokrit, lymphocytes count of mice in experimental group significantly increased (P < 0.05), hemoglobin content of male mice in experimental group was significantly higher than that of male mice in control group (P < 0.05), red blood cell count of male mice in experimental group was significantly higher than that of female mice in experimental group (P < 0.05), neutral cell rate of female mice in experimental group was significantly lower than that of female mice in control group (P < 0.05), and count of eosinophils of female mice in experimental group was significantly higher than that of female mice in control group (P < 0.05); after 28 d treatment by Pichia anonmala AR2016 strain, blood routine indexes among groups had no significant difference (P>0.05). 5) Compared with the control group, after 7 d treatment by Pichia anonmala AR2016 strain, the content of interferon-γ (INF-γ) and tumor necrosis factor-α in serum of mice in experimental group significantly increased (P < 0.05); after 28 d treatment by Pichia anonmala AR2016 strain, INF-γ content in serum of female mice in high dose group significantly increased (P < 0.05). Therefore, the Pichia anomala AR2016 strain is non-toxic and high safety to Kunming mice, can increase ADFI, improve immune function, and having the value for further research and development.
Key words:
Pichia anomala AR2016
Kunming mice
acute toxicity
safety
相比抗生素而言，微生态制剂是一种新型、绿色环保的饲料添加剂。目前，饲用微生态制剂的种类主要有芽胞杆菌类、乳酸菌类和酵母菌类。异常毕赤酵母(Pichia anomala)产植酸酶、β-1, 3-葡聚糖酶、挥发性脂肪酸和嗜杀毒素等物质[1-2]，同时富含多种必需氨基酸、消化酶和生物活性物质，具有防腐、提高饲粮营养价值、增加蛋白质含量和降低抗营养物质浓度等作用[3-4]，工业发酵中异常毕赤酵母可利用豆饼水解液产生大量微生物蛋白质[5]。因此，异常毕赤酵母在微生物饲料添加剂和蛋白质资源方面具有很高的应用价值和开发前景。虽然很多益生酵母已在市场上广泛应用，但一些产品仍然存在安全隐患，对动物健康造成潜在危害，甚至引起各种疾病发生[6]。因此，益生菌的安全性非常重要，欧洲食品安全权威机构已把安全合格认定要求用于饲料微生物添加剂的安全性评价[7]。本试验通过测定异常毕赤酵母AR2016菌株对昆明小鼠的毒性和易位性，以及通过分析处理后昆明小鼠生长性能、血清生化指标和血常规的变化，评价其安全性，以期为异常毕赤酵母AR2016菌株被开发为绿色、安全和环保的微生物饲料添加剂提供一定的参考依据。
1 材料与方法
1.1 菌种、试验动物和培养基
异常毕赤酵母AR2016菌株由西南大学动物科技学院应用微生物实验室分离筛选自湖南安仁传统固态酒药，现保藏于中国典型培养物保藏中心(编号为CCTCC M2017594)。无特定病原体(SPF)级昆明小鼠，雌雄各占1/2，体重为21~26 g，供试鼠和饲粮均购买于重庆医科大学实验动物中心。酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)培养基配制如下：1%(质量体积分数)酵母粉、2%(质量体积分数)蛋白胨、2%(质量体积分数)葡萄糖，蒸馏水配制，于121 ℃条件下灭菌15 min。
1.2 异常毕赤酵母AR2016发酵液的制备
将活化的异常毕赤酵母AR2016菌株接种到YPD液体培养基中，28 ℃、200 r/min条件下发酵培养24 h。于10 000 r/min下冷冻离心10 min，沉淀菌体，收集上清，沉淀的菌体用收集的上清调整菌体浓度分别为2×107、2×108和2×109 CFU/mL，即为不同浓度供试菌悬液。
1.3 7 d经口急性毒性试验
参照《食品安全国家标准急性经口毒性试验》[8]最大耐受剂量法进行急性毒性试验。选择20只体重为(22.95±0.66) g、健康的昆明小鼠，随机分为2组，每组10只，雌雄各占1/2。采用灌胃法，按每10 g体重最大灌胃容量0.2 mL灌胃，对照组灌胃生理盐水，试验组灌胃异常毕赤酵母AR2016菌株发酵液(菌体浓度2×109 CFU/mL)。每天09:00进行灌胃，试验处理前禁食16 h，连续观察7 d，记录动物的一般表现、行为、采食及中毒表现和死亡情况。
1.4 28 d经口毒性试验
参照《食品安全国家标准28天经口毒性试验》[9]动物饲养法和《食品安全国家标准急性经口毒性试验》[8]限量法进行毒性试验。选择40只体重为(25.43±0.69) g、健康的昆明小鼠，随机分为4组，每组10只，雌雄各占1/2。采用灌胃法，按每10 g体重最大灌胃容量0.2 mL灌胃，对照组灌胃生理盐水，低、中、高剂量组灌胃异常毕赤酵母AR2016菌株发酵液，菌体浓度分别为2×107、2×108、2×109 CFU/mL。每天09:00进行灌胃，试验处理前禁食16 h，连续观察28 d，记录动物的一般表现、行为、采食及中毒表现和死亡情况。
1.5 饲养管理及试验饲粮
供试小鼠采用单笼饲养，室温控制在21 ℃左右，自由饮水和采食，垫料为刨木花，每2 d清扫1次鼠笼，饲粮参照GB 14924.3—2001[10]营养水平进行配制，基础饲粮组成及营养水平见表 1。
表 1(Table 1)
表 1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)
Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis)
| % |
| 项目Items |
含量Content |
| 原料Ingredients |
| 玉米Corn |
47.80 |
| 豆粕Soybean meal |
11.00 |
| 玉米蛋白粉Corn gluten meal |
6.00 |
| 鱼粉Fish meal |
7.80 |
| 豆油Soybean oil |
11.50 |
| 麸皮Wheat bran |
9.50 |
| 石粉Limestone |
0.90 |
| 磷酸氢钙CaHPO4 |
1.50 |
| 抗氧化剂Antioxidant |
0.02 |
| 维生素预混料Vitamin premix1) |
0.20 |
| 矿物元素预混料Trace mineral premix2) |
2.74 |
| 食盐NaCl |
0.20 |
| 苏氨酸Thr |
0.14 |
| L-赖氨酸盐酸盐L-Lys·HCl |
0.58 |
| 色氨酸Trp |
0.02 |
| 蛋氨酸Met |
0.08 |
| 精氨酸Arg |
0.02 |
| 合计Total |
100.00 |
| 营养水平Nutrient levels3) |
| 消化能DE/(MJ/kg) |
15.60 |
| 粗蛋白质CP |
20.01 |
| 钙Ca |
1.16 |
| 有效磷AP |
0.82 |
| 赖氨酸Lys |
1.32 |
| 蛋氨酸Met |
0.78 |
| 精氨酸Arg |
1.10 |
| 色氨酸Trp |
0.25 |
| 苏氨酸Thr |
0.88 |
1)维生素预混料为每千克饲粮提供Vitamin premix provided the following per kg of the diet：VA 14 000 IU，VD 1 500 IU，VE 120 IU，VK 5.0 mg，泛酸pantothenic acid 24.0 mg，核黄酸riboflavin 12.0 mg，叶酸folic acid 6.0 mg，尼克酸nicotinic acid 29.1 mg，硫胺素thiamine 13.1 mg，VB6 12.0 mg，生物素biotin 0.2 mg，VB12 0.017 mg。
2)矿物元素预混料为每千克饲粮提供Trace mineral premix provided the following per kg of the diet：Mg 5 000 mg，Zn 30 mg，Fe 120 mg，Mn 75 mg，Cu 10 mg，K 5 000 mg，I 0.5 mg。
3)消化能和氨基酸为计算值，其余为实测值。DE and amino acids were calculated values, while the others were measured values. |
|
表 1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)
Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis)
|
1.6 样品采集
观察期结束后，供试小鼠禁食24 h，眼眶静脉采血，每组雌雄各采5只。取约2 mL血样静置2 h左右，4 ℃ 3 500 r/min冷冻离心5 min，取上清分装于1.5 mL无菌离心管中，-80 ℃保存，用于血清生化指标测定。取约0.5 mL血样置于含有乙二胺四乙酸(EDTA)的塑料试管中，用于血常规测定。采血后颈椎脱臼法处死小鼠，对小鼠进行大体检查，肉眼观察小鼠主要脏器是否有病理变化。
1.7 血清生化指标及血常规测定
测定血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(AKP)活性及白蛋白(ALB)、总胆红素(T-BIL)、肌酐(Cr)、尿素氮(UN)、白细胞介素-10(IL-10)、干扰素-γ(INF-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量，所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，测定步骤按照说明书进行操作。血常规测定采用Sysmex XT-2000i全自动血液分析仪进行五分群血细胞分型。
1.8 主要器官易位检查
将肝脏、肾脏和脾脏等主要器官组织匀浆，各取100 μL匀浆液涂布于YPD固体培养基平板上，28 ℃培养48 h，观察酵母培养结果，进行活菌计数。
1.9 统计分析
试验结果用Excel 2016软件进行整理后，采用SAS 9.0统计软件对数据进行one-way ANOVA单因素方差分析和显著性检验，P < 0.05表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 异常毕赤酵母AR2016菌株对小鼠的毒性和易位性
异常毕赤酵母AR2016菌株处理7或28 d后，试验组小鼠未出现中毒及死亡，生命活动与对照组相比无明显异常，解剖未见异常，异常毕赤酵母AR2016菌株最大耐受剂量>20 000 mg/kg，参照GB 15193.3—2014急性毒性半数致死剂量(LD50)分级表，属无毒级别[8]。组织匀浆涂布培养结果显示，YPD培养基上未长出异常毕赤酵母AR2016菌株，表明异常毕赤酵母AR2016菌株在小鼠肝脏、肾脏、脾脏组织及血液中均未发生易位。
2.2 异常毕赤酵母AR2016菌株对小鼠生长性能的影响
如表 2所示，异常毕赤酵母AR2016菌株处理7 d后，试验组雌性小鼠末重显著低于对照组雌性小鼠、对照组和试验组雄性小鼠(P < 0.05)；与对照组相比，试验组小鼠平均日采食量显著降低(P < 0.05)，试验组雌性小鼠最低。
表 2(Table 2)
表 2 异常毕赤酵母AR2016菌株处理7 d后小鼠的生长性能
Table 2 Growth performance of mice after 7 d treatment by Pichia anonmala AR2016 strain (n=5)
项目
Items |
雄性Male |
|
雌性Female |
SEM |
P值
P-value |
对照组
Control group |
试验组
Experimental group |
对照组
Control group |
试验组
Experimental group |
| 初重IBW/g |
22.40 |
22.22 |
|
21.76 |
21.40 |
0.66 |
0.69 |
| 末重FBW/g |
28.70a |
28.02a |
26.15b |
23.26c |
0.39 |
< 0.01 |
| 平均日采食量ADFI/(g/d) |
5.81a |
5.42b |
4.96c |
4.70d |
0.05 |
< 0.01 |
同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。下表同。
In the row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P < 0.05). The same as below. |
|
表 2 异常毕赤酵母AR2016菌株处理7 d后小鼠的生长性能
Table 2 Growth performance of mice after 7 d treatment by Pichia anonmala AR2016 strain (n=5)
|
如表 3所示，异常毕赤酵母AR2016菌株处理28 d后，与对照组相比，各剂量组小鼠末重均无显著差异(P>0.05)；各剂量组雄性小鼠平均日采食量显著高于对照组(P < 0.05)，但各剂量组间差异不显著(P>0.05)；与对照组相比，各剂量组雌性小鼠平均日采食量均显著提高(P < 0.05)，中剂量组和高剂量组显著高于低剂量组(P < 0.05)，中剂量组和高剂量组间差异不显著(P>0.05)。
表 3(Table 3)
表 3 异常毕赤酵母AR2016菌株处理28 d后小鼠的生长性能
Table 3 Growth performance of mice after 28 d treatment by Pichia anonmala AR2016 strain (n=5)
项目
Items |
对照组
Control group |
低剂量组
Low dose group |
中剂量组
Middle dose group |
高剂量组
High dose group |
SEM |
P值
P-value |
| 雄性Male |
| 初重IBW/g |
25.58 |
24.97 |
25.39 |
25.78 |
0.69 |
0.86 |
| 末重FBW/g |
39.28 |
39.30 |
40.22 |
41.21 |
1.11 |
0.59 |
| 平均日采食量ADFI /(g/d) |
5.87b |
6.95a |
7.02a |
7.05a |
0.09 |
< 0.01 |
| 雌性Female |
| 初重IBW/g |
23.59 |
23.10 |
23.53 |
23.29 |
0.58 |
0.93 |
| 末重FBW/g |
33.85 |
34.31 |
33.98 |
33.66 |
0.93 |
0.97 |
| 平均日采食量ADFI /(g/d) |
4.94c |
5.01b |
5.58a |
5.65a |
0.15 |
0.02 |
|
表 3 异常毕赤酵母AR2016菌株处理28 d后小鼠的生长性能
Table 3 Growth performance of mice after 28 d treatment by Pichia anonmala AR2016 strain (n=5)
|
2.3 异常毕赤酵母AR2016菌株对昆明小鼠血清生化指标的影响
如表 4所示，异常毕赤酵母AR2016菌株处理7 d后，试验组雄性和雌性小鼠血清ALB和UN含量显著低于对照组雄性和雌性小鼠(P < 0.05)；试验组小鼠血清Cr含量和AST活性显著高于对照组(P < 0.05)，且试验组雄性小鼠血清Cr含量显著高于试验组雌性小鼠(P < 0.05)，试验组雄性小鼠血清T-BIL含量显著高于试验组雌性小鼠(P < 0.05)。
表 4(Table 4)
表 4 异常毕赤酵母AR2016菌株处理7 d后小鼠的血清生化指标
Table 4 Serum biochemical indexes of mice after 7 d treatment by Pichia anonmala AR2016 strain (n=5)
项目
Items |
雄性Male |
|
雌性Female |
SEM |
P值
P-value |
对照组
Control group |
试验组
Experimental group |
对照组
Control group |
试验组
Experimental group |
| 谷丙转氨酶ALT/(U/L) |
156.00 |
153.00 |
|
179.00 |
170.00 |
4.55 |
0.05 |
| 谷草转氨酶AST/(U/L) |
509.00b |
588.00a |
485.00b |
581.00a |
18.90 |
0.04 |
| 碱性磷酸酶ALP/(U/L) |
187.00 |
186.00 |
190.00 |
171.00 |
4.76 |
0.14 |
| 白蛋白ALB/(g/L) |
16.10c |
14.40d |
23.00a |
21.60b |
0.23 |
< 0.01 |
| 总胆红素T-BIL/(μmol/L) |
7.74ab |
8.05a |
7.11c |
7.41bc |
0.11 |
0.02 |
| 肌酐Cr/(μmol/L) |
73.60c |
88.90a |
66.90c |
80.50b |
1.72 |
0.01 |
| 尿素氮UN/(mmol/L) |
12.30a |
9.75b |
9.51b |
6.79c |
0.09 |
< 0.01 |
|
表 4 异常毕赤酵母AR2016菌株处理7 d后小鼠的血清生化指标
Table 4 Serum biochemical indexes of mice after 7 d treatment by Pichia anonmala AR2016 strain (n=5)
|
如表 5所示，异常毕赤酵母AR2016菌株处理28 d后，各剂量组相对于对照组，血清生化指标均无显著变化(P>0.05)。
表 5(Table 5)
表 5 异常毕赤酵母AR2016菌株处理28 d后小鼠的血清生化指标
Table 5 Serum biochemical indexes of mice after 28 d treatment by Pichia anonmala AR2016 strain (n=5)
项目
Items |
对照组
Control group |
低剂量组
Low dose group |
中剂量组
Middle dose group |
高剂量组
High dose group |
SEM |
P值
P-value |
| 雄性Male |
| 谷丙转氨酶ALT/(U/L) |
151.00 |
153.00 |
156.00 |
151.00 |
2.10 |
0.23 |
| 谷草转氨酶AST/(U/L) |
458.00 |
462.00 |
465.00 |
455.00 |
7.19 |
0.75 |
| 碱性磷酸酶ALP/(U/L) |
184.00 |
181.00 |
174.00 |
153.00 |
9.56 |
0.18 |
| 白蛋白ALB/(g/L) |
15.17 |
13.90 |
13.72 |
14.20 |
0.37 |
0.09 |
| 总胆红素T-BIL/(μmol/L) |
7.51 |
7.44 |
7.42 |
7.46 |
0.14 |
0.96 |
| 肌酐Cr/(μmol/L) |
73.05 |
67.96 |
70.90 |
72.65 |
1.29 |
0.08 |
| 尿素氮UN/(mmol/L) |
11.86 |
11.05 |
11.42 |
11.86 |
0.21 |
0.07 |
| 雌性Female |
| 谷丙转氨酶ALT/(U/L) |
151.00 |
151.00 |
153.00 |
149.00 |
3.16 |
0.78 |
| 谷草转氨酶AST/(U/L) |
458.00 |
457.00 |
466.00 |
464.00 |
6.57 |
0.73 |
| 碱性磷酸酶ALP/(U/L) |
182.00 |
180.00 |
174.00 |
175.00 |
4.09 |
0.46 |
| 白蛋白ALB/(g/L) |
15.17 |
15.00 |
14.81 |
14.87 |
0.13 |
0.28 |
| 总胆红素T-BIL/(μmol/L) |
7.51 |
7.53 |
7.50 |
7.46 |
0.09 |
0.94 |
| 肌酐Cr/(μmol/L) |
73.05 |
72.09 |
70.90 |
70.98 |
0.81 |
0.26 |
| 尿素氮UN/(mmol/L) |
11.86 |
12.00 |
11.52 |
11.88 |
0.15 |
0.33 |
|
表 5 异常毕赤酵母AR2016菌株处理28 d后小鼠的血清生化指标
Table 5 Serum biochemical indexes of mice after 28 d treatment by Pichia anonmala AR2016 strain (n=5)
|
2.4 异常毕赤酵母AR2016菌株对昆明小鼠血常规的影响
如表 6所示，异常毕赤酵母AR2016菌株处理7 d后，试验组小鼠白细胞(WBC)、红细胞(RBC)数量、血红蛋白(HGB)含量、红细胞压积(HCT)、淋巴细胞数量、中性细胞比率及嗜酸性粒细胞数量均发生变化。试验组雄性小鼠和雌性小鼠WBC数量、HCT及淋巴细胞数量分别显著高于对照组雄性小鼠和雌性小鼠(P < 0.05)，且雄性小鼠显著高于雌性小鼠(P < 0.05)；试验组雄性小鼠HGB含量显著高于对照组雄性小鼠(P < 0.05)，试验组雌性小鼠高于对照组雌性小鼠，但差异不显著(P>0.05)；试验组雄性小鼠RBC数量显著高于试验组雌性小鼠(P < 0.05)；试验组雌性小鼠中性细胞比率显著低于对照组雌性小鼠(P < 0.05)，试验组雄性小鼠低于对照组雄性小鼠，但差异不显著(P>0.05)；试验组雌性小鼠嗜酸性粒细胞数量显著高于对照组雌性小鼠(P < 0.05)，试验组雄性小鼠高于对照组雄性小鼠，但差异不显著(P>0.05)。
表 6(Table 6)
表 6 异常毕赤酵母AR2016菌株处理7 d后小鼠的血常规指标
Table 6 Blood routine indexes of mice after 7 d treatment by Pichia anonmala AR2016 strain (n=5)
项目
Items |
雄性Male |
|
雌性Female |
SEM |
P值
P-value |
对照组
Control group |
试验组
Experimental group |
对照组
Control group |
试验组
Experimental group |
| 白细胞数量WBC count/(×109 L-1) |
4.70b |
6.76a |
|
4.33b |
6.62a |
0.10 |
< 0.01 |
| 红细胞数量RBC count/(×1012 L-1) |
11.43ab |
12.81a |
10.12b |
11.67b |
0.44 |
0.05 |
| 血红蛋白含量HGB content/(g/L) |
155.00b |
179.00a |
150.00b |
168.00ab |
3.90 |
0.02 |
| 红细胞压积HCT/% |
62.50b |
71.50a |
53.00c |
62.80b |
1.67 |
< 0.01 |
| 血小板数量PLT count/(×109 L-1) |
892.00 |
940.00 |
875.00 |
911.00 |
14.18 |
0.11 |
| 平均血小板体积MPV/(fL) |
7.60 |
7.77 |
6.63 |
7.23 |
0.16 |
0.30 |
| 血小板压积PCT/% |
0.69 |
0.73 |
0.58 |
0.66 |
0.02 |
0.30 |
| 红细胞平均体积MCV/fL |
54.70 |
55.80 |
52.50 |
53.90 |
1.11 |
0.32 |
| 平均血红蛋白量MCH/pg |
13.50 |
14.00 |
14.80 |
14.40 |
0.26 |
0.90 |
| 平均血红蛋白浓度MCHC/(g/L) |
248.00 |
251.00 |
282.00 |
267.00 |
5.47 |
0.30 |
| 中性细胞比率NEUT rate/% |
25.70a |
21.20ab |
25.50a |
19.20b |
0.96 |
0.02 |
| 淋巴细胞比率LYMPH rate/% |
70.30 |
72.60 |
71.30 |
73.10 |
1.09 |
0.39 |
| 单核细胞比率MONO rate/% |
2.66 |
3.40 |
2.43 |
3.03 |
0.42 |
0.47 |
| 嗜酸性粒细胞比率EO rate/% |
1.39 |
2.81 |
1.50 |
4.63 |
0.59 |
0.05 |
| 中性细胞数量NEUT count/(×109 L-1) |
1.21 |
1.44 |
1.11 |
1.27 |
0.07 |
0.12 |
淋巴细胞数量
LYMPH count/(×109 L-1) |
3.30b |
4.94a |
3.08c |
4.84a |
0.06 |
< 0.01 |
单核细胞数量
MONO count/(×109 L-1) |
0.13 |
0.23 |
0.11 |
0.20 |
0.03 |
0.10 |
| 嗜酸性粒细胞数量EO count/(×109 L-1) |
0.07b |
0.19ab |
0.07b |
0.31a |
0.04 |
0.03 |
|
表 6 异常毕赤酵母AR2016菌株处理7 d后小鼠的血常规指标
Table 6 Blood routine indexes of mice after 7 d treatment by Pichia anonmala AR2016 strain (n=5)
|
如表 7所示，异常毕赤酵母AR2016菌株处理28 d后，各剂量组小鼠血常规指标与对照组相比均无显著变化(P>0.05)。
表 7(Table 7)
表 7 异常毕赤酵母AR2016菌株处理28 d后小鼠的血常规指标
Table 7 Blood routine indexes of mice after 28 d treatment by Pichia anonmala AR2016 strain (n=5)
项目
Items |
对照组
Control group |
低剂量组
Low dose group |
中剂量组
Middle dose group |
高剂量组
High dose group |
SEM |
P值
P-value |
| 雄性Male |
| 白细胞数量WBC count/(×109 L-1) |
4.61 |
4.87 |
4.88 |
4.72 |
0.09 |
0.23 |
| 红细胞数量RBC count/(×1012 L-1) |
12.01 |
12.09 |
11.49 |
11.15 |
0.23 |
0.11 |
| 血红蛋白含量HGB content/(g/L) |
166.00 |
162.00 |
159.00 |
159.00 |
3.06 |
0.48 |
| 红细胞压积HCT/% |
56.57 |
58.30 |
58.01 |
53.97 |
1.19 |
0.17 |
| 血小板数量PLT count/(×109 L-1) |
918.00 |
922.00 |
907.00 |
899.00 |
13.04 |
0.64 |
| 平均血小板体积MPV/fL |
7.36 |
7.16 |
6.98 |
7.08 |
0.18 |
0.58 |
| 血小板压积PCT/% |
0.67 |
0.66 |
0.63 |
0.64 |
0.02 |
0.35 |
| 红细胞平均体积MCV/fL |
47.10 |
48.25 |
50.50 |
48.40 |
0.68 |
0.09 |
| 平均血红蛋白量MCH/pg |
13.78 |
13.12 |
13.87 |
14.26 |
0.40 |
0.50 |
平均血红蛋白浓度
MCHC/(g/L) |
293.00 |
276.00 |
274.00 |
294.00 |
10.02 |
0.43 |
| 中性细胞比率NEUT rate/% |
26.68 |
23.85 |
27.04 |
24.89 |
2.01 |
0.67 |
| 淋巴细胞比率LYMPH rate/% |
68.47 |
70.50 |
67.34 |
69.49 |
1.51 |
0.55 |
| 单核细胞比率MONO rate/% |
3.25 |
3.03 |
3.48 |
3.61 |
0.26 |
0.49 |
| 嗜酸性粒细胞比率EO rate/% |
1.09 |
2.37 |
1.63 |
1.58 |
0.55 |
0.51 |
嗜碱性粒细胞比率
BASO rate/% |
0.55 |
0.40 |
0.51 |
0.43 |
0.07 |
0.50 |
中性细胞数量
NEUT count/(×109 L-1) |
1.23 |
1.16 |
1.32 |
1.18 |
0.11 |
0.72 |
淋巴细胞数量
LYMPH count/(109 L-1) |
3.16 |
3.43 |
3.29 |
3.28 |
0.07 |
0.18 |
单核细胞数量
MONO count/(×109 L-1) |
0.15 |
0.14 |
0.17 |
0.17 |
0.01 |
0.34 |
嗜酸性粒细胞数量
EO count/(×109 L-1) |
0.05 |
0.12 |
0.08 |
0.07 |
0.03 |
0.48 |
嗜碱性粒细数量
BASO count/(×109 L-1) |
0.03 |
0.02 |
0.03 |
0.02 |
0.00 |
0.62 |
| 雌性Female |
白细胞数量
WBC count/(×109 L-1) |
4.45 |
4.32 |
4.34 |
4.41 |
0.08 |
0.65 |
红细胞数量
RBC count/(×1012 L-1) |
10.50 |
10.53 |
10.16 |
10.27 |
0.32 |
0.81 |
血红蛋白含量
HGB content/(g/L) |
157.00 |
154.00 |
155.00 |
159.00 |
3.11 |
0.72 |
| 红细胞压积HCT/% |
47.88 |
49.60 |
49.32 |
47.99 |
1.70 |
0.84 |
血小板数量
PLT count/(×109 L-1) |
900.00 |
878.00 |
884.00 |
882.00 |
4.11 |
0.06 |
| 平均血小板体积MPV/fL |
6.95 |
7.18 |
7.04 |
7.01 |
0.11 |
0.54 |
| 血小板压积PCT/% |
0.63 |
0.63 |
0.62 |
0.62 |
0.01 |
0.93 |
| 红细胞平均体积MCV/fL |
45.60 |
46.90 |
48.56 |
46.75 |
0.77 |
0.20 |
| 平均血红蛋白量MCH/pg |
14.91 |
14.58 |
15.27 |
15.44 |
0.21 |
0.14 |
平均血红蛋白浓度
MCHC/(g/L) |
327.00 |
312.00 |
314.00 |
330.00 |
7.42 |
0.34 |
| 中性细胞比率NEUT rate/% |
25.51 |
25.55 |
26.12 |
24.93 |
1.95 |
0.44 |
淋巴细胞比率
LYMPH rate/% |
70.11 |
72.37 |
69.63 |
70.41 |
1.16 |
0.50 |
单核细胞比率
MONO rate/% |
3.04 |
3.28 |
2.65 |
3.06 |
0.44 |
0.79 |
嗜酸性粒细胞比率
EO rate/% |
1.01 |
2.47 |
0.93 |
1.24 |
0.57 |
0.32 |
嗜碱性粒细胞比率
BASO rate/% |
0.33 |
0.37 |
0.34 |
0.34 |
0.11 |
0.99 |
中性细胞数量
NEUT count/(×109 L-1) |
1.14 |
0.94 |
1.13 |
1.10 |
0.10 |
0.50 |
淋巴细胞数量
LYMPH count/(109 L-1) |
3.12 |
3.12 |
3.04 |
3.11 |
0.04 |
0.50 |
单核细胞数量
MONO count/(×109 L-1) |
0.13 |
0.14 |
0.12 |
0.14 |
0.02 |
0.75 |
嗜酸性粒细胞数量
EO count/(×109 L-1) |
0.05 |
0.11 |
0.04 |
0.06 |
0.02 |
0.30 |
嗜碱性粒细数量
BASO count/(×109 L-1) |
0.02 |
0.02 |
0.02 |
0.02 |
0.01 |
1.00 |
|
表 7 异常毕赤酵母AR2016菌株处理28 d后小鼠的血常规指标
Table 7 Blood routine indexes of mice after 28 d treatment by Pichia anonmala AR2016 strain (n=5)
|
2.5 异常毕赤酵母AR2016菌株对昆明小鼠免疫功能的影响
如表 8所示，异常毕赤酵母AR2016菌株处理7 d后，试验组小鼠血清IL-10含量未出现显著变化(P>0.05)；试验组雄性小鼠和雌性小鼠血清INF-γ和TNF-α含量分别与对照组雄性小鼠和雌性小鼠相比显著升高(P < 0.05)。
表 8(Table 8)
表 8 异常毕赤酵母AR2016菌株处理7 d后小鼠的炎症细胞因子含量
Table 8 Inflammatory cytokine contents of mice after 7 d treatment by Pichia anonmala AR2016 strain (n=5)
| ng/L |
项目
Items |
雄性Male |
|
雌性Female |
SEM |
P值
P-value |
对照组
Control group |
试验组
Experimental group |
对照组
Control group |
试验组
Experimental group |
| 白介素-10 IL-10 |
40.26 |
35.09 |
|
40.36 |
36.74 |
1.48 |
0.09 |
| 干扰素-γ INF-γ |
87.60b |
104.80a |
87.70b |
114.70a |
3.17 |
< 0.01 |
| 肿瘤坏死因子-α TNF-α |
92.60b |
108.70a |
95.20b |
118.00a |
2.98 |
< 0.01 |
|
表 8 异常毕赤酵母AR2016菌株处理7 d后小鼠的炎症细胞因子含量
Table 8 Inflammatory cytokine contents of mice after 7 d treatment by Pichia anonmala AR2016 strain (n=5)
|
如表 9所示，异常毕赤酵母AR2016菌株处理28 d后，与对照组相比，各剂量组雄性小鼠血清IL-10含量未出现显著变化(P>0.05)，各剂量组雄性小鼠血清INF-γ和TNF-α含量有升高趋势，但差异不显著(P>0.05)；与对照组相比，高剂量组雌性小鼠血清INF-γ显著升高(P < 0.05)，各剂量组血清IL-10和TNF-α含量无显著差异(P>0.05)。
表 9(Table 9)
表 9 异常毕赤酵母AR2016菌株处理28 d后小鼠的炎症细胞因子含量
Table 9 Inflammatory cytokine contents of mice after 28 d treatment by Pichia anonmala AR2016 strain (n=5)
| ng/L |
项目
Items |
对照组
Control group |
低剂量组
Low dose group |
中剂量组
Middle dose group |
高剂量组
High dose group |
SEM |
P值
P-value |
| 雄性Male |
| 白介素-10 IL-10 |
41.06 |
40.06 |
40.44 |
40.61 |
1.09 |
0.93 |
| 干扰素-γ INF-γ |
74.94 |
80.02 |
83.54 |
83.67 |
2.49 |
0.11 |
肿瘤坏死因子-α
TNF-α |
66.61 |
71.00 |
71.27 |
73.44 |
2.16 |
0.23 |
| 雌性Female |
| 白细胞介素-10 IL-10 |
40.81 |
39.59 |
39.41 |
40.78 |
1.14 |
0.74 |
| 干扰素-γ INF-γ |
78.11b |
80.62ab |
81.69ab |
87.28a |
1.75 |
0.03 |
肿瘤坏死因子-α
TNF-α |
72.61 |
73.92 |
77.46 |
72.81 |
1.88 |
0.30 |
|
表 9 异常毕赤酵母AR2016菌株处理28 d后小鼠的炎症细胞因子含量
Table 9 Inflammatory cytokine contents of mice after 28 d treatment by Pichia anonmala AR2016 strain (n=5)
|
3 讨论
3.1 异常毕赤酵母AR2016菌株对昆明小鼠的毒性和易位性
作为畜禽微生物饲料添加剂主要是要具有安全性，大量摄入活菌制剂的毒性及其易位性等日益成为人们关注的问题[11]。细菌易位是一种生活细菌或其产品穿过肠道屏障累及周围组织和器官的现象，可引起全身炎症反应、组织损伤、器官衰竭以及机体死亡[12-13]。因此，细菌易位对动物及人类具危险性，在开发微生物产品时应检测其易位性。本研究急性毒性试验结果显示，供试小鼠未出现死亡，运动和饮水等均未受到明显影响，表明异常毕赤酵母AR2016菌株无毒。本研究易位试验结果表明，经最大剂量异常毕赤酵母AR2016菌株处理7 d和经不同剂量异常毕赤酵母AR2016菌株处理28 d后，异常毕赤酵母AR2016菌株在各供试小鼠肝脏、肾脏、脾脏组织及血液中均未发生易位现象，表明异常毕赤酵母AR2016菌株具较高安全性，有开发成微生物饲料添加剂的潜能。
3.2 异常毕赤酵母AR2016菌株对昆明小鼠生长性能的影响
本试验结果显示，经最大剂量异常毕赤酵母AR2016菌株处理7 d后，供试小鼠末重和平均日采食量显著下降，试验组雌性小鼠显著低于试验组雄性小鼠，末重和平均日采食量下降原因可能是由于小鼠机体还未适应大量活菌的入侵，导致机体出现了炎症反应，进而导致平均日采食量下降，体重减轻，雌性小鼠抵抗力弱于雄性小鼠。然而，经不同剂量异常毕赤酵母AR2016菌株处理28 d后，小鼠平均日采食量显著提高，表明异常毕赤酵母AR2016菌株对昆明小鼠饮食有一定影响，但小鼠机体能自我修复消除炎症，采食量甚至还显著提高，说明异常毕赤酵母AR2016菌株能改善饲粮适口性，提高平均日采食量，这可能与酵母细胞中含有的核酸、核苷酸和谷氨酸等具有改善风味的作用有关[14-15]，以及与异常毕赤酵母能耐受高渗透压、低pH和低氧等极端环境，在低氧条件下异常毕赤酵母产乙酸乙酯、乙醇和甘油等代谢产物的能力增强[16]，异常毕赤酵母在动物肠道内能生长繁殖，发酵产生代谢产物有关。微生物饲料添加剂一般要求具有能在动物肠道内生长繁殖、产生多种消化酶和蛋白酶、促进营养物质的消化、吸收和提高饲料的转化率、产生多种生长因子促进动物生长等功能[17]。异常毕赤酵母耐酸、耐胆盐以及能在人工模拟胃肠液中生长繁殖，异常毕赤酵母具有开发为微生物饲料添加剂的特性。
3.3 异常毕赤酵母AR2016菌株对昆明小鼠血清生化指标和血常规的影响
肝脏是合成ALB的主要场所，当肝脏受损时，肝细胞合成ALB减少，血液中ALB含量亦减少[18]。AST主要分布在肝脏，当肝脏受创伤、缺血、低氧、细胞完整性和功能受损时，细胞膜的通透性就会增加，AST就会从细胞质渗入血液中，因此血清中AST活性能反映肝脏的受损程度[19]，当肾脏功能异常时，UN、Cr和T-BIL含量等指标会发生变化。本研究血清生化试验结果表明，经最大剂量异常毕赤酵母AR2016菌株处理7 d后，试验组小鼠血清ALB和UN含量均显著降低，血清Cr、T-BIL含量及AST活性显著升高，其中ALB、UN、Cr和T-BIL含量雄性小鼠与雌性小鼠之间存在显著差异，表明异常毕赤酵母AR2016菌株对小鼠肝脏和肾脏功能有一定影响，而且与动物的性别有一定的关联，肝肾功能受损可能是由于大量活菌突然入侵动物机体导致动物器官受损代谢异常。本研究血常规试验结果显示，异常毕赤酵母AR2016菌株处理7 d后，试验组小鼠WBC数量和淋巴细胞数量显著升高，以及中性细胞数量有升高趋势，这可能是由于菌体及其代谢产物的入侵引起了相关炎症反应。WBC对动物机体具有重要的保护作用，是抵制病原体、微生物以及细菌入侵的第1道屏障，中性粒细胞可吞噬入侵菌体并将其分解化脓，淋巴细胞则与机体免疫功能相关尤其是细胞免疫，然而过度免疫会导致炎症反应[20]。
经不同剂量异常毕赤酵母AR2016菌株处理28 d后，小鼠血清生化指标和血常规指标均未出现显著变化, 说明小鼠机体代谢水平恢复至正常，其脏器功能能够复原。裘纪莹等[21]通过测定小鼠的急性经口毒性、肝功能和血常规指标评价解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7的安全性，3 d内无中毒及死亡，15 d后肝功能和血常规无显著变化，判定其安全性较高、无毒。李文明等[22]也采用类似的方法评价解淀粉芽孢杆菌LJ1的安全性，14 d后肝功能和血常规无显著变化，因此推断其对动物机体是安全的。本研究与前人研究结果一致，因此表明异常毕赤酵母AR2016菌株具有较高安全性。
3.4 异常毕赤酵母AR2016菌株对昆明小鼠免疫功能的影响
微生物饲料添加剂能刺激免疫系统产生免疫应答，从而促进机体免疫应答，增强动物机体抗病能力[23]，Kotzamanidis等[24]以小鼠为模型，采用酶联免疫吸附方法测定血清IL-10、INF-γ和TNF-α含量来评价乳酸菌菌株的免疫功能，本试验研究也采用此方法对异常毕赤酵母AR2016菌株的免疫功能进行评价。本研究细胞因子试验结果显示，经最大剂量异常毕赤酵母AR2016菌株处理7 d后，试验组小鼠血清IFN-γ和TNF-α含量显著升高，可能与WBC数量增加有关，菌体入侵致使小鼠机体出现炎症反应。经不同剂量异常毕赤酵母AR2016菌株处理28 d后，血清IL-10和TNF-α含量无显著变化，说明小鼠机体无炎症现象已恢复健康水平，高剂量组小鼠血清中IFN-γ含量显著高于对照组、低剂量组以及中剂量组，这可能是高剂量异常毕赤酵母AR2016菌株具有增强免疫功能的作用，由此推测异常毕赤酵母AR2016菌株具有开发为微生物饲料添加剂的潜力。
4 结论
① 异常毕赤酵母AR2016菌株对昆明小鼠无毒，具较高生物安全性。
② 异常毕赤酵母AR2016菌株可提高昆明小鼠平均日采食量，增强机体免疫功能，具有一定的开发利用价值。
参考文献
| [1] |
VOHRA A, SATYANARAYANA T. Phytase production by the yeast, Pichia anomala[J]. Biotechnology Letters, 2001, 23(7): 551-554. DOI:10.1023/A:1010314114053 |
| [2] |
IZGÜ F, ALTLNBAY D, ACUN T. Killer toxin of Pichia anomala NCYC 432;purification, characterization and its exo-β-1, 3-glucanase activity[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2006, 39(4): 669-676. DOI:10.1016/j.enzmictec.2005.11.024 |
| [3] |
DE MELO E A, DE LIMA R.MARIANO R, LARANJEIRA D, et al. Efficacy of yeast in the biocontrol of bacterial fruit blotch in melon plants[J]. Tropical Plant Pathology, 2015, 40(1): 56-64. DOI:10.1007/s40858-015-0008-x |
| [4] | |
| [5] | |
| [6] | |
| [7] |
SUNDH I, MELIN P. Safety and regulation of yeasts used for biocontrol or biopreservation in the food or feed chain[J]. Antonie van Leeuwenhoek, 2011, 99(1): 113-119. DOI:10.1007/s10482-010-9528-z |
| [8] |
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 15193.3-2014食品安全国家标准急性经口毒性试验[S].北京: 中国标准出版社, 2015.
|
| [9] |
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 15193.22-2014食品安全国家标准28天经口毒性试验[S].北京: 中国标准出版社, 2015.
|
| [10] |
中华人民共和国国家质量监督检验疫总局.GB 14924.3-2001实验动物小鼠大鼠配合饲料[S].北京: 中国标准出版社, 2002.
|
| [11] | |
| [12] |
BALZAN S, DE ALMEIDA QUADROS C, DE CLEVA R, et al. Bacterial translocation:overview of mechanisms and clinical impact[J]. Journal of Gastroenterology and Hepatology, 2007, 22(4): 464-471. DOI:10.1111/jgh.2007.22.issue-4 |
| [13] |
FOUTS D E, TORRALBA M, NELSON K E, et al. Bacterial translocation and changes in the intestinal microbiome in mouse models of liver disease[J]. Journal of Hepatology, 2012, 56(6): 1283-1292. DOI:10.1016/j.jhep.2012.01.019 |
| [14] | |
| [15] |
VAN HEUGTEN E, FUNDERBURKE D W, DORTON K L. Growth performance, nutrient digestibility, and fecal microflora in weanling pigs fed live yeast[J]. Journal of Animal Science, 2003, 81(4): 1004-1012. DOI:10.2527/2003.8141004x |
| [16] |
WALKER G M. Pichia anomala:cell physiology and biotechnology relative to other yeasts[J]. Antonie van Leeuwenhoek, 2011, 99(1): 25-34. DOI:10.1007/s10482-010-9491-8 |
| [17] | |
| [18] | |
| [19] |
CHEN S L, XUE N, WU M T, et al. Influence of preoperative serum aspartate aminotransferase (AST) level on the prognosis of patients with non-small cell lung cancer[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2016, 17(9): 1474. DOI:10.3390/ijms17091474 |
| [20] |
曹雪涛. 医学免疫学[M]. 6版. 北京: 人民卫生出版社, 2013.
|
| [21] | |
| [22] | |
| [23] | |
| [24] | |
