动物营养学报    2019, Vol. 31 Issue (3): 1463-1470    PDF    
天然富硒植物无花果叶中硒提取方法的研究
李军德1, 刘晓娟2, 宋吉英2     
1. 青岛农业大学校医院, 青岛 266109;
2. 青岛农业大学化学与药学院, 青岛 266109
摘要: 本试验旨在比较天然富硒植物无花果叶中硒的提取方法。试验采用4种方法从无花果叶中提取硒,分别是混合酸消解法、超声-微波协同萃取法、索氏提取法和磁力搅拌法,讨论每种方法的不同提取条件对提取效果的影响,并将提取到的硒用灵敏度高的荧光光度法进行定量。结果表明:1)混合酸消解法提取硒的效果最好,超声-微波协同萃取法提取效果略次之,磁力搅拌法提取硒的效果最差。2)混合酸消解法4种不同的混合酸消解体系中,高氯酸-硫酸-硝酸(体积比1:1:3)组成的消解体系提取硒的效果最好,消解24 h提取硒的含量为0.13 μg/g。3)正交试验确定超声-微波协同萃取法的最佳提取条件是用甲醇作为提取剂,微波功率400 W,提取时间15 min,物料比1:10(g:mL),在此条件下提取硒的含量为0.12 μg/g。由此可知,不同方法提取无花果叶中硒的效果不同。混合酸消解法虽然提取硒的效果最好,但是该方法中用的强酸危险性大,试验周期长;超声-微波协同萃取法提取硒的效果仅略差于混合酸消解法,同时该方法可实时监控,操作简单安全,且试验耗时远远低于混合酸消解法。因此,建议采用超声-微波协同萃取法提取无花果叶中的硒。
关键词:      无花果叶     提取方法     荧光    
Study on Extraction Methods of Selenium in Fig Leaves as a Natural Selenium-Enriched Plant
LI Junde1, LIU Xiaojuan2, SONG Jiying2     
1. Hospital of Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China;
2. College of Chemistry and Pharmaceutical Sciences, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China
Abstract: This experiment was conducted to compare the extraction method of selenium from fig leaves which had rich selenium as a natural plant. The four extraction methods, including mixed acid digestion method, ultrasound-microwave synergistic extraction method, Soxhlet extraction method and magnetic stirring method were discussed and evaluated. The different conditions for extraction efficiency were optimized and selenium content in fig leaves was measured by fluorescence spectrometry with high sensitivity. The results showed as follows:1) the mixed acid digestion method had the highest extraction efficiency, the ultrasound-microwave synergistic extraction method was slightly worse than the mixed acid digestion method, and the magnetic stirring method was the worst. 2) In the four different acid digestion systems of mixed acid digestion method, the system consisting of the volume ratio of perchloric acid, sulphuric acid and nitric acid was 1:1:3 had the best effect for extracting selenium. The content of selenium in fig leaves was 0.13 μg/g with extraction time 24 h. 3) The content of selenium was 0.12 μg/g with ultrasound-microwave synergistic extraction method. The optimum extraction conditions of ultrasound-microwave synergistic extraction method through orthogonal test were identified as the follows:methanol as solvent, microwave power 400 W, extraction time 15 min and solid-liquid ratio as 1:10 (g:mL). The results indicated that there are differences of extraction effect with different methods. The mixed acid digestion method has the best extraction effect but strong acids used in the experiment is too dangerous for the operation with long time digestion. The extraction effect of ultrasound-microwave synergistic extraction method is slightly worse than the mixed acid digestion method, but it can shorten extraction time, reduce sample consumption, operate expediently and monitor in real time. Therefore, ultrasound-microwave synergistic extraction method for extracting selenium from fig leaves is recommended.
Key words: selenium     fig leaves     extraction method     fluorescence    

硒是人和动物必需的微量元素,它不仅能够促进机体的生长发育和新陈代谢,同时具有参与硒蛋白和含硒酶的合成、提高机体免疫力等生物学功能[1-2]。相关资料研究表明,无机硒有一定的毒性,且不易被吸收,不适合人和动物使用,有机硒在动物生长过程中的使用效果明显优于无机硒[3-4],但因有机硒的成本较高,从而限制了其在饲料行业的应用[5-13]。天然植物添加剂是指能够促进和改善动物生长性能的天然饲料添加剂,它能够补充饲粮中一些营养成分的不足,提高饲料利用率,促进畜禽生长。植物体内的硒主要以有机硒形态存在,无机硒含量很少,有机硒占硒总量的80%以上,由大分子硒和硒代氨基酸及其衍生物形式存在的小分子硒化合物组成[14]。无花果在生长过程中因其独特的味道不吸引虫害,不需喷洒农药,是一种天然的绿色农产品。植物活性有机硒是人类和动物允许使用的有效硒源,无花果叶中含有大量的植物活性有机硒,但产量丰富的无花果叶目前基本没有被成规模利用,造成资源浪费。鉴于无花果叶中含有丰富的有机硒,因此可采集粉碎后制成叶粉,添加到牛、羊、马等草食动物的常规饲粮中,解决动物生长中因硒缺乏而造成的营养和保健问题。按照GB 26418—2010《饲料中硒的允许量》规定,反刍动物牛、羊等配合饲料中硒的含量应≤0.5 mg/kg,因此,即使是有机硒,在动物饲粮中的添加也要适量。但无花果叶中硒的含量因产地气候和土壤等客观条件的不同而不同,没有统一的参考标准,因此在使用时需对无花果叶中硒的含量进行测定。从植物中提取目标物常用的方法有溶剂提取法、超声波提取法、微波提取法、超临界流体萃取法、消解法和酶提取法等,目前植物中硒的提取方法主要有溶剂提取法、超声波或者微波提取法以及消解法等。本试验旨在比较从无花果叶中提取有机硒的方法,以青岛某地区的无花果叶为试验对象,将提取的硒用荧光光度法进行定量分析,确定最佳提取方法,为动物饲粮中无花果叶的添加量提供控制依据。

1 材料与方法 1.1 主要仪器与试剂

仪器:F-2500荧光分光光度计(Hitachi公司);GW-2000超声-微波协同萃取反应仪(上海新拓分析仪器科技有限公司);PB-10 pH计(北京赛多利斯科学仪器北京有限公司);TGL-20B-C高速台式离心机(上海安亭科技仪器厂);RE-52AA型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);DF-101S型集热式磁力搅拌器(开封市宏兴科教仪器厂);95-2型电动磁力搅拌器(上海司乐仪器有限公司);FW100型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。

试剂:硒标准溶液(浓度1 000 μg/mL,GSB04-1751-2004,北京索莱宝科技有限公司);2, 3-二氨基萘(DAN,北京寰宇科创生物科技发展有限公司),试剂级;其他试剂均为优级纯;无花果叶(青岛某地区自采)晾干粉碎后待用。

1 g/L的DAN溶液:准确取0.100 0 g DAN,用0.1 mol/L的盐酸溶液溶解,定容至100 mL棕色容量瓶,以上操作在暗室环境进行,DAN溶液避光保存,使用周期不超过30 d。

1 μg/mL的硒标准储备溶液:用移液管准确移取1 000 μg/mL的硒标准溶液0.1 mL于100 mL容量瓶中,用0.1 mol/L的盐酸定容。

乙二胺四乙酸(EDTA)-盐酸羟胺混合溶液:称取5.00 g EDTA和10.00 g盐酸羟胺用去离子水溶解,二者混合定容至500 mL。

1.2 硒含量测定的前处理方法和光谱参数

前处理方法:取含硒溶液5 mL,加入15 mL EDTA-盐酸羟胺混合溶液反应10 min,再加入3 mL DAN溶液,调节溶液pH=2.0并定容至50 mL,混合溶液转移至圆底烧瓶中,80 ℃条件下加热反应20 min,冷却后将溶液转移至分液漏斗,用5 mL环己烷振摇萃取10 min,取环己烷层溶液待测。

光谱参数:最大激发波长(λEX)=379 nm,最大发射波长(λEM)=521 nm,激发波长扫描范围为300~600 nm,发射波长扫描范围为300~800 nm,激发波长狭缝宽度为5 nm,发射波长狭缝宽度为5 nm,扫描速度300 nm/min,延迟时间0 s,重复次数1次。

1.3 硒的外标定量分析方法

试验中硒的定量分析采取外标法,取1 μg/mL的硒标准储备溶液0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL,分别配制成浓度为0.005、0.010、0.020、0.050、0.100 μg/mL系列标准溶液,标准溶液按照1.2的前处理方法和光谱参数进行测定,以硒含量为横坐标,所测的荧光强度为纵坐标绘制标准工作曲线,根据得到的线性方程对样品中硒含量进行定量分析。

1.4 混合酸消解法提取硒的试验方法

本试验所用的混合酸消解体系分别是硝酸-高氯酸、硫酸-高氯酸、硝酸-双氧水和高氯酸-硫酸-硝酸。称取0.5 g无花果叶粉末于圆底烧瓶中,加入混合酸10 mL,消解一定时间后控温赶酸,然后用5 mL 0.1 mol/L的盐酸溶解残留物,溶液用一次性滤膜过滤以除去可能存在的固体颗粒,滤液按照1.2的方法进行处理,待测。

1.5 超声-微波协同萃取法提取硒的试验方法

影响无花果叶中硒提取效果的因素较多,为了确定影响提取效果因素的主次,采用4因素3水平正交试验,按照L9(34)正交表(表 1)安排试验内容,设计9个代表性试验对提取效果进行验证。称取3.0 g无花果叶粉末于超声-微波协同萃取的专用烧瓶中,设置超声-微波协同萃取的试验条件,将萃取后的混合溶液高速离心10 min,上清液旋蒸至干,残留物用5 mL 0.1 mol/L的盐酸进行溶解,溶液用一次性滤膜过滤以除去可能存在的固体颗粒,滤液按照1.2的方法进行处理,待测。

表 1 正交试验的因素和水平 Table 1 Factors and levels for orthogonal test
1.6 索氏提取法提取硒的试验方法

分别选取甲醇、乙醇和环己烷作为提取剂。称取5.0 g无花果叶粉末于圆底烧瓶中,加入100 mL提取剂和几粒沸石防止爆沸,加热回流提取4次,将回流得到的溶液高速离心10 min,上清液在45 ℃条件下旋蒸,旋蒸后的残留物按照1.2中的方法用5 mL 0.1 mol/L的盐酸溶解残留物,再加入15 mL EDTA-盐酸羟胺混合溶液及DAN溶液进行处理,溶液用一次性滤膜过滤,待测。

1.7 磁力搅拌法提取硒的试验方法

分别选取甲醇、乙醇和环己烷作为提取剂。称取5.0 g无花果叶粉末于圆底烧瓶中,加入100 mL提取剂,用封口膜密封烧瓶口以防止提取剂在试验中挥发。试验在低于提取剂沸点10 ℃的条件下加热并充分搅拌提取3.0 h,冷却至室温后高速离心10 min,上清液在45 ℃条件下旋蒸,旋蒸后的残留物按照1.2中的方法用5 mL 0.1 mol/L的盐酸溶解残留物,再加入15 mL EDTA-盐酸羟胺混合溶液及DAN溶液进行处理,溶液用一次性滤膜过滤,待测。

1.8 数据处理

试验数据采用Excel 2010进行整理和处理。

2 结果与分析 2.1 硒的最大激发波长和最大发射波长

取一定浓度的硒标准溶液,按照1.2中的方法进行前处理后,在相应的光谱条件下扫描其激发光谱和发射光谱。由图 1的光谱图可以看出,硒的最大激发波长为379 nm,最大发射波长为521 nm,因此,在此光谱条件下对不同提取方法得到的无花果叶中硒的含量进行定量测定。

图 1 硒的激发光谱图(A)和发射光谱图(B) Fig. 1 Excitation spectrogram (A) and emission spectrogram (B) of selenium
2.2 硒的定量分析性能数据

表 2可知,试验方法的性能数据如线性方程、相关系数(R2)、相对标准偏差(RSD)和加标回收率都较理想,验证了试验方法的可行性。

表 2 定量分析性能数据 Table 2 Performance data of quantitative analysis (n=5)
2.3 混合酸消解法提取无花果叶中的硒

表 3可知,不同的混合酸消解体系,各种酸的组成比例不同,试验中消解的时间也各不相同;消解完成后,赶酸温度均为120 ℃,主要是为了充分赶净混合酸;为了对比不同的混合酸消解体系对无花果叶中硒的提取效果,试验中混合酸的总体积和物料比是相同的。从提取结果来看,高氯酸-硫酸-硝酸消解体系对无花果叶中硒的提取效果最佳,提取到无花果叶中硒的含量最高,为0.13 μg/g,硝酸-双氧水消解体系提取效果次之,提取到无花果叶中硒的含量为0.09 μg/g,硝酸-高氯酸消解体系提取效果再次之,提取到无花果叶中硒的含量为0.07 μg/g,硫酸-高氯酸消解体系效果最差,提取到无花果叶中硒的含最低,为0.04 μg/g。

表 3 混合酸消解法提取无花果叶中的硒 Table 3 Extraction of selenium in fig leaves by mixed acid digestion method
2.4 超声-微波协同萃取法提取无花果叶中的硒

表 4可知,9个代表性正交试验的因素和水平组合所得结果各不相同,试验结果的考察指标为溶液的荧光强度,因为荧光强度与提取液中硒含量成正比,荧光强度越大,提取的硒越多。根据极差(R)值可知,提取剂是影响提取效果的最主要因素,微波功率次之,物料比的影响最小;根据各因素的K值,超声-微波协同萃取法最佳试验条件是用甲醇作提取剂,微波功率400 W,提取时间15 min,物料比1 : 10(g : mL),在此条件下提取到无花果叶中的硒含量为0.12 μg/g。

表 4 L9(34)正交试验和结果分析 Table 4 Results and analysis of L9(34) orthogonal test
2.5 索氏提取法提取无花果叶中的硒

表 5可知,在提取剂的体积、样品质量、虹吸回流次数相同的条件下,硒的提取效果只与溶剂有关,只有甲醇能够提取得到硒,用乙醇和环己烷进行提取没有得到硒,但从硒的含量来看,用甲醇进行提取得到硒的含量较低,说明提取效果一般。

表 5 索氏提取法提取无花果叶中的硒 Table 5 Extraction of selenium in fig leaves by Soxhlet extraction method
2.6 磁力搅拌法提取无花果叶中的硒

分别以甲醇、乙醇和环己烷作为提取剂,用磁力搅拌法对无花果叶中的硒进行提取,结果发现都没有提取到硒,说明磁力搅拌法对无花果叶中硒的提取效果差,不能采用。

2.7 无花果叶中硒的4种提取方法对比

根据提取试验得到的硒含量数据,将试验所用的4种提取方法中的最佳提取方案列出,根据所测得的硒含量和主要提取条件对比提取方法的可行性,具体见表 6。从所测得硒的含量看,混合酸消解法中的高氯酸-硫酸-硝酸(体积比为1 : 1 : 3)的提取硒效果最好,超声-微波协同萃取法略次之,磁力搅拌法提取硒的效果最差;从操作流程分析,混合酸消解法试验周期长,且所用强酸有一定的危险性和腐蚀性;而超声-微波协同萃取操作简单安全,提取时间短,提取硒的效果和混合酸消解法差别不大,建议采用。

表 6 无花果叶中硒的4种提取方法对比 Table 6 Comparison of four extraction methods for selenium in fig leaves
3 讨论 3.1 混合酸消解法对无花果叶中硒提取效果的影响

混合酸消解法是湿法消解的一种,它是用不同酸或混合酸与过氧化氢或其他氧化剂的混合溶液,在加热条件下利用混合酸的化学能力,使被提取的物质处于强酸环境中,在不破坏提取物的前提下破坏其中的有机物,从而将目标组分从样品中溶解出来,转化为可测定形式的方法[15]。酸消解法常用的酸种类有硝酸、高氯酸、硫酸和过氧化氢等,植物样品通常采用混合酸消解法进行测定前的预处理。本试验选择具有氧化性的强酸和双氧水组成不同的消解体系,目的是提高溶液的氧化性,将无花果叶中所含的二价硒氧化为四价硒。试验中采用的4种混合酸组成分别为高氯酸-硫酸-硝酸、硝酸-双氧水、硝酸-高氯酸、硫酸-高氯酸。从提取结果来看,含有硝酸的混合酸提取得到的硒含量相对较高,这是因为硝酸是一种强氧化剂,可以破坏样品中的有机成分。热的高氯酸有强烈的氧化性和脱水性,其沸点较高,可以在赶酸操作除去硝酸后继续氧化样品;硫酸的强脱水作用可以迅速分解有机物,因此,高氯酸-硫酸-硝酸消解体系提取的硒含量最高,为0.13 μg/g,而缺少硝酸的硫酸-高氯酸消解体酸提取的硒含量最低,为0.04 μg/g。本试验赶酸温度控制在120 ℃,这是因为高氯酸在超过130 ℃时有爆炸的危险。混合酸消解法的缺点是强酸在使用过程中有危险性和腐蚀性,消解液易浑浊,加热消解时也会产生泡沫,从而造成目标组分的损失,因此需要增加消解时间以减少泡沫,导致试验周期长;另外,消解和赶酸操作产生的气体也会对环境有污染。

3.2 超声-微波协同萃取法对无花果叶中硒提取效果的影响

超声-微波协同萃取法具有效率高、耗能低、耗时短、操作简单安全和实时监控的优点[16-17],这也是近年来从植物中提取活性成分和有效成分的主要方法[18-20],在样品的前处理中得到了广泛的应用。影响超声-微波协同萃取效率的主要因素有物料比、提取剂种类、微波功率和提取时间,不同的因素下又有不同的影响水平。本试验设计了4因素3水平的L9(34)正交试验,对提取效果进行优化,以确定出影响因素的主次关系和最佳试验方案。从分析结果来看,提取剂种类是影响提取效果的最主要因素,微波功率次之,物料比的影响最小。在选定的最佳试验条件[甲醇作为提取剂,微波功率400 W,提取时间15 min,物料比1 : 10 (g : mL)]下提取得到无花果叶中的硒含量为0.12 μg/g。超声-微波协同萃取对无花果叶中硒的提取效果与混合酸消解法相当,同时其在操作上快捷简单且可控,具有明显的优势。

3.3 索氏提取法对无花果叶中硒提取效果的影响

索氏提取法也称为连续提取法、索氏抽提法,是一种经典的从固体物质中提取目标物的方法,它具有操作简单、安全性高以及可以反复提取的特点。虽然样品在每一次虹吸回流过程中都能被热的溶剂所萃取,但索氏提取法耗时长,溶剂用量大,萃取效果一般。本试验中用不同的萃取剂进行提取,在虹吸回流4次的条件下,用甲醇进行提取得到硒的含量为0.02 μg/g,含量较低,而用乙醇和环己烷进行提取均没有得到硒。这主要是因为索氏提取法在提取过程中,溶剂对目标物的提取只是通过热溶剂浸泡使目标物溶解在其中,不同形态的硒在不同溶剂中的溶解能力不同,从而导致硒的提取效果一般。

3.4 磁力搅拌法对无花果叶中硒提取效果的影响

磁力搅拌法是实验室常用的一种简单且易于操作的提取方法,在搅拌过程中,样品与溶剂充分接触并达到均匀。本试验中用磁力搅拌提取法在加热条件下提取3 h,3种提取剂均没有得到目标物,提取效果差。这主要是因为磁力搅拌法只是对目标物和溶剂单纯的进行搅拌,植物样品中的硒特别是有机硒未能溶于溶剂中。

4 结论

① 综合比较4种从无花果叶中提取硒的方法,超声-微波协同萃取法提取硒效果好,且操作简单安全、耗时短、耗能低,可作为无花果叶中硒的一种有效提取方法。

② 超声-微波协同萃取法提取无花果叶中硒的最佳试验条件是用甲醇作为提取剂,微波功率400 W,提取时间15 min,物料比1 : 10 (g : mL);用该方法提取到无花果叶中的硒含量为0.12 μg/g。

参考文献
[1]
SURAI P F, FISININ V I. Selenium in poultry breeder nutrition:an update[J]. Animal Feed Science and Technology, 2014, 191: 1-15. DOI:10.1016/j.anifeedsci.2014.02.005
[2]
CAO C Y, ZHAO X, FAN R F, et al. Dietary selenium increases the antioxidant levels and ATPase activity in the arteries and veins of poultry[J]. Biological Trace Element Research, 2016, 172(1): 222-227.
[3]
SURAI P F, KOCHISH I I, FISININ V I, et al. Selenium in poultry nutrition:from sodium selenite to organic selenium sources[J]. The Journal of Poultry Science, 2018, 55(2): 79-93. DOI:10.2141/jpsa.0170132
[4]
ZIA W M, KHALIQUE A, NAVEED S, et al. Organic and inorganic selenium in poultry:a review[J]. Indian Journal of Animal Research, 2018, 52(4): 483-489.
[5]
王登峰.有机硒对奶牛产奶性能、营养物质消化及血液生化指标的影响[D].硕士学位论文.呼和浩特: 内蒙古农业大学, 2011: 33-35. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10129-1011178272.htm
[6]
RAN L W, WU X S, SHEN X Z, et al. Effects of selenium form on blood and milk selenium concentrations, milk component and milk fatty acid composition in dairy cows[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2010, 90(13): 2214-2219. DOI:10.1002/jsfa.4073
[7]
KARKOODI K, CHAMANI M, BEHESHTI M, et al. Effect of organic zinc, manganese, copper, and selenium chelates on colostrum production and reproductive and lameness indices in adequately supplemented holstein cows[J]. Biological Trace Element Research, 2012, 146(1): 42-46.
[8]
GUYOT H, SPRING P, ANDRIEU S, et al. Comparative responses to sodium selenite and organic selenium supplements in Belgian Blue cows and calves[J]. Livestock Science, 2007, 111(3): 259-263. DOI:10.1016/j.livsci.2007.04.018
[9]
李明, 哈斯, 介晓磊, 等. 富含硒钴锌的苜蓿青干草在牛羊饲喂中的效果[J]. 家畜生态学报, 2011, 32(4): 34-37. DOI:10.3969/j.issn.1673-1182.2011.04.009
[10]
权群学, 陈少谋, 胡登明. 利用天然富硒玉米生产富硒鸡蛋试验[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2016(12): 106-107.
[11]
郭孝, 胡华锋, 介晓磊, 等. 日粮中添加富硒钴苜蓿草粉对家兔饲料转化率和肉品质的影响[J]. 家畜生态学报, 2017, 38(12): 29-33. DOI:10.3969/j.issn.1673-1182.2017.12.006
[12]
吴国杰, 舒绪刚, 尹国强, 等. 硒饲料添加剂在动物养殖中的应用[J]. 广东饲料, 2015, 24(9): 27-29. DOI:10.3969/j.issn.1005-8613.2015.09.007
[13]
释凯, 李勇, 任大喜, 等. 有机硒对奶牛生产性能的影响及富硒乳制品开发研究[J]. 中国畜牧杂志, 2015, 51(24): 44-48. DOI:10.3969/j.issn.0258-7033.2015.24.009
[14]
覃爱苗, 唐平, 余卫平. 硒在植物中的生物学效应[J]. 东北农业大学学报, 2011, 42(10): 6-11. DOI:10.3969/j.issn.1005-9369.2011.10.002
[15]
刘云, 谢锦忠, 屈明华, 等. 湿法消解-原子荧光法测定竹笋中的微量硒[J]. 竹子研究汇刊, 2007, 26(3): 12-15. DOI:10.3969/j.issn.1000-6567.2007.03.003
[16]
LIU Z Z, GU H Y, YANG L. An approach of ionic liquids/lithium salts based microwave irradiation pretreatment followed by ultrasound-microwave synergistic extraction for two coumarins preparation from Cortex fraxini[J]. Journal of Chromatography A, 2015, 1417: 8-20. DOI:10.1016/j.chroma.2015.09.037
[17]
YANG Y Q, CHU G H, ZHOU G J, et al. Rapid determination of the volatile components in tobacco by ultrasound-microwave synergistic extraction coupled to headspace solid-phase microextraction with gas chromatography-mass spectrometry[J]. Journal of Separation Science, 2016, 39(6): 1173-1181. DOI:10.1002/jssc.v39.6
[18]
TANG S R, SONG H, CHEN Y J, et al. Synergistic extraction and antioxidant activities of ginger polyphenols by ultrasound wave and microwave[J]. Advanced Materials Research, 2012, 550-553: 580-585. DOI:10.4028/www.scientific.net/AMR.550-553
[19]
OCHOA-RIVAS A, NAVA-VALDEZ Y, SERNA-SALDÍVAR S O, et al. Microwave and ultrasound to enhance protein extraction from peanut flour under alkaline conditions:effects in yield and functional properties of protein isolates[J]. Food and Bioprocess Technology, 2017, 10(3): 543-555. DOI:10.1007/s11947-016-1838-3
[20]
XU W, YAN X H, SHAO R, et al. Optimization of ultrasonic-microwave synergistic extraction of ricinine from castor cake by response surface methodology[J]. Current Pharmaceutical Biotechnology, 2016, 17(13): 1126-1133. DOI:10.2174/1389201017666160920091657