肠黏膜上皮细胞和肠道相关淋巴组织共同构成人和动物肠道的免疫屏障。其中，自然杀伤(natural killing，NK)细胞被认为是人和动物固有免疫的主要承担者，是机体抗感染的第1道天然防线^[1]。人和小鼠的研究表明，NK细胞在黏膜系统中发挥重要的免疫屏障功能，显著促进呼吸道、肠道黏膜上皮细胞增殖分化并抑制其凋亡，改善上皮细胞活力和紧密连接，修复受损上皮细胞^[2-3]。动物出生后其免疫系统只有受到肠道微生物的不断刺激才能发育完全^[4]。大量研究表明益生菌(如乳酸菌)能够改善动物肠黏膜屏障功能^[5-7]，但其免疫学机理尚未完全阐明。

1 NK细胞的发育学特性及分子表型

NK细胞是由骨髓造血干细胞演化而来的一类重要的免疫细胞。在骨髓，造血干细胞发育演化为多能干细胞，随后发育为2类祖细胞，即髓系祖细胞和淋巴样祖细胞，后者进一步分化为T细胞、B细胞、树突状细胞(dendritic cell，DC)和NK细胞。这些免疫细胞在后天环境中的可塑性很大，如NK细胞具有自我更新的能力，这种能力是介乎干细胞与终末细胞的一种分化能力，受外界大环境和体内微环境的介导^[8-9]。因而通过追踪、检测、鉴定细胞膜上特定表达的分子来区别、分离NK细胞，反映其所处的生命阶段是较为困难的^[9]。尽管如此，越来越多的研究报道了处于不同生命阶段(如静止、成熟、细胞毒性和凋亡等)的NK细胞膜上表达的分子具有特异性^{[1, 9-10]}。

Sanos等^[1]报道，在小鼠肠黏膜固有层，典型的NK细胞膜上表达NK细胞蛋白46[NKp46，即自然细胞毒性触发受体1(natural cytotoxicity triggering receptor 1，NCR1)]，但不表达RAR相关孤儿受体γt(RAR-related orphan receptor，RORγt)，这类NK细胞可分泌干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)，但需依赖白细胞介素(IL)-15获得细胞杀伤毒性。然而，NKp46⁺/RORγt⁺的一类细胞则不依赖IL-15，也不分泌IFN-γ，但可分泌IL-22，这类细胞很可能是淋巴组织诱导样细胞。实际上，目前确定的是，在静止或初生的NK细胞系的膜表面上，可检测到高水平的NK1.1受体分子。NK1.1是NK细胞系早期所特有的一种受体蛋白；其他类型细胞如自然杀伤性T细胞膜上虽然也表达此蛋白分子，但表达水平较低，至少在小鼠肝脏、脾脏和黏膜中存在此规律^{[5, 8, 10]}。在受抗原刺激后，NK细胞膜表达受体分子，包括自然杀伤细胞2族成员(natural killer group 2-member D，NKG2D)、Ly49和CD45.1，细胞释放颗粒(含有大量的穿孔素、蛋白酶等)，并伴随表达溶酶体相关膜蛋白1(lysosomal-associated membrane protein 1，LAMP-1，也称CD107a)，同时分泌IFN-γ。LAMP-1、IFN-γ等因子的生成目前已被认定为NK细胞具备细胞毒害活性的标志^[8]。在小鼠上的研究表明，CD45.1是区分NK细胞成熟与否(即是否经受过抗原刺激)的标志性分子^[8]。因此，可综合膜蛋白的生化表型、合成分泌活性细胞因子等情况来区分、判断NK细胞系及其所处的生理阶段(表 1)。

在家禽的研究上，由于肠黏膜NK细胞、T细胞和B细胞同属于CD8⁺细胞系，通过标记膜表面的特征性分子[如CD3、CD4、免疫球蛋白轻链(immunoglobulin light chain, IgL)和T细胞受体(T cell receptor，TCR)2]可以计算得到T细胞和B细胞的数量，从而推算得到NK细胞的数量^[11]。肠黏膜30%的肠上皮细胞间的T淋巴细胞为NK细胞，它们与T淋巴细胞共同构成肠黏膜的第1道免疫防线^[11]。

2 NK细胞在免疫系统中的地位与角色 2.1 NK细胞同时具备先天免疫和获得性免疫功能

T、B淋巴细胞是目前公认的具有获得性免疫能力的2类细胞。未受抗原刺激的T细胞在接触抗原而激活后，先后会经历4个过程，即扩增期、收缩期、免疫记忆期、免疫回忆反应期^[12-13]。在扩增期，T细胞受抗原的激活作用后，在1周内时间至少分裂扩增10次，产生大量具有效应功能的子代细胞^[14]；在收缩期，90%~95%的处于激活状态的T细胞进入凋亡状态，此时期机体所有的组织器官均可见到此类现象^[14-15]；在免疫记忆期，未凋亡的T细胞分化产生长寿的记忆细胞，这些细胞长久地潜伏于淋巴组织或非淋巴组织^{[12, 16]}；在免疫回忆反应期，当机体再次感染相同抗原后，潜伏的T细胞快速增殖并对抗原产生破坏作用^[12-13]。

一直以来，NK细胞被认为仅属于先天免疫系统^{[1, 11, 17]}。直到2009年，Sun等^[10]利用TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白基因缺乏(Tyrobp^-/-)小鼠模型(其NK细胞胞膜缺乏细胞毒性的标志性受体分子——Ly49受体，即试验小鼠模型不具备功能性的NK细胞)的研究发现，给小鼠模型过继性移植具有细胞毒性的NK细胞，并立即对小鼠进行小鼠巨细胞病毒(MCMV)攻毒。攻毒后第7天，肝脏、脾脏中的的功能性NK细胞增殖程度达到最大，而后逐渐降低，至第37天时恢复到过继移植初期的水平。值得注意的是，攻毒后55~70 d，试验小鼠体内仍可检测到具有活性的NK细胞。可见，NK细胞具有类似于T细胞的免疫过程，即扩增期、收缩期和免疫记忆期。在上述试验小鼠的肝脏、脾脏收集得到具有免疫记忆的NK细胞，再次将其过继移植到Tyrobp^-/-小鼠体内，并实施MCMV攻毒，发现NK细胞在攻毒后7 d内快速增殖，并对小鼠存活具有保护能力，表明该试验获得的NK细胞同样具有免疫回忆反应的特点^[10]。由此可见，NK细胞具有同时参与先天免疫和获得性免疫的功能。类似的报道还见于Sun等^[8]。

2.2 NK细胞与其他免疫细胞的免疫关联

NK细胞占外周血中T淋巴细胞总数的5%~15%^[8-9]，而家禽肠上皮细胞层里更有高达30%的T淋巴细胞为具有细胞毒性的NK细胞^{[11, 17]}。这提示了NK细胞在免疫一线感应免疫信号的重要性。

2.2.1 与DC的关系

自Fernandez等^[18]发现DC可通过直接接触的方式激活NK细胞后，对NK细胞和DC间的相互作用关系的研究就成为免疫学领域的一个热点。随后，NK细胞和DC相互作用概貌被揭示出来：激活的NK细胞可直接或间接(与微生物信号协同)促进DC成熟(尽管激活的NK细胞对未成熟的DC具有细胞毒害作用，而对成熟的具有保护作用)。这一过程通过依赖于膜受体——NK细胞蛋白30(NKp30)与DC接触、以及肿瘤坏死因子(TNF)-α或IFN-γ分泌的方式而实现；反过来，激活的DC会通过分泌IL-12、IL-18、IL-15和INF-α/β等细胞因子诱导NK细胞增殖、分化，并增强NK细胞的细胞毒性作用且促进其分泌INF-γ。NK细胞和DC的相互作用可见于淋巴组织和非淋巴组织，但不同组织中产生的效应可能不尽相同。此外，NK细胞和DC轴还可影响T细胞的增殖、分化和细胞活性^[19]。

2.2.2 与T细胞的关系

在机体，大部分T细胞利用CD3相关的α或β受体来识别抗原，但有一小部分(约5%)使用γ或δ受体，据此可将T细胞分为α/β T细胞和γ/δ T细胞。γ/δ T细胞很少存在于外周血，但多存在于肠道上皮细胞间^[20]。如前所述，肠道上皮细胞间存在30%的T淋巴细胞为NK细胞^{[11, 17]}。共同位于肠上皮细胞间的NK细胞与γ/δ T细胞，在先天免疫和获得性免疫中发挥重要作用^{[11, 17, 20]}。γ/δ T细胞可通过CD137途径激活和增强NK细胞的活性^[21]。NK细胞可以通过分泌细胞因子的方式，也可以通过直接与T细胞接触的方式，调节T细胞的增殖分化。NK细胞受到激活后，表达主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ类分子、多种TCR共刺激分子(如B7-H3、CD70)及活化受体(如NKp30、NKp46、NKG2D和CD16)，刺激或将抗原呈递给T淋巴细胞，促使T淋巴细胞增强本身的免疫活力^[22]。

2.2.3 与Th1细胞的关系

大量研究表明，NK细胞分泌的INF-γ可诱导抗原特异性T细胞向辅助性Th1方向极化，也可通过促进DC分泌IL-12，增强CD8⁺ T细胞的免疫应答能力^{[19, 22-23]}。Th1主要调节细胞免疫，而Th2则调节体液免疫。若机体发生过敏，常伴随着Th1/Th2失衡，且倾向Th2方向发展。由此推断，NK细胞可能在抑制机体过敏过程中起重要作用。

3 肠黏膜NK细胞及肠道微生物对其调控作用 3.1 肠黏膜NK细胞表型、分布和发育

动物机体超过50%的免疫细胞聚集于肠黏膜中，与此相一致，哺乳动物肠道微生物荷载量是本身体细胞数量的10倍^[8]。肠黏膜作为与微生物接触的界面，其间的免疫活动异常剧烈和复杂。在这种微环境下，肠黏膜NK细胞的表型、分布、发育与以往所认识的相差较大^{[9, 24-25]}。传统认为，NK细胞仅具备颗粒调节的细胞毒性及分泌INF-γ和TNF-α 2种主要细胞因子。近年来的研究根据是否表达转录因子RORγt，将肠黏膜NK细胞分为RORγt⁺或RORγt^- 2种亚型，并且二者均高水平表达NKp46^{[3, 9, 25]}。对小鼠^[2]、羊^[25]、牛^[26]及人^[3]的研究证实，NKp46是肠黏膜NK细胞高度保守的特征性分子，常用来判定NK细胞是否来源于肠黏膜。此外，相比存在于血液、淋巴结和肝脏等组织的NK细胞，肠黏膜NK细胞在正常生理状况下不具备细胞毒性，因其本身不表达细胞凋亡相关诱导配体——肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)和Fas配体(Fas ligand，FasL)蛋白^[2]。正常生理状态下，黏膜NK细胞可以分泌多种细胞因子，如IL-22、IL-10、IL-26和白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)^{[2, 24]}。同时，肠黏膜上皮细胞胞膜存在IL-22受体1、IL-10受体2等受体^[2]，提示肠上皮细胞可感受NK细胞的免疫状态并做出响应。有趣的是，即使在免疫应激状态下，肠道黏膜RORγt⁺ NK细胞亦极少分泌INF-γ和TNF-α，但可表达趋化因子及其配体，并持续不断地合成分泌IL-22、IL-10、IL-26和LIF。IL-10具有降低黏膜炎症的作用；IL-22可激发上皮细胞生长、增殖和分化，抑制细胞凋亡，从而维持黏膜上皮细胞的完整性^[2-3]；IL-26和LIF可通过刺激上皮细胞信号转导及转录激活蛋白(signal transducer and activator of transcription，STAT)1和STAT3的磷酸化而激活上皮细胞分化和功能的作用。

在羊上的研究发现，NK细胞主要分布于小肠派氏(Payer’s)结和大肠结的固有层、滤泡、滤泡间区域和圆顶状区域中；此外，上皮细胞间也存在NK细胞。从分布密度角度看，空肠、回肠和大肠的圆顶状区域密度最高，其次是滤泡间区域和固有层，最低部位是滤泡^[25]。可见，从解剖角度看，肠黏膜NK细胞与肠上皮细胞空间上接近，但其中的生理学意义尚不明朗。家禽肠道上皮细胞间存在大量的CD8⁺淋巴细胞，其中30%为不具有细胞毒性的NK细胞，这提示NK细胞与肠上皮细胞存在一定的联系^[11]。实际上，黏膜NK细胞可通过趋化因子受体(chemokine receptor，CCR)-6及其配体——趋化因子C-C-基元配体20(CCL-20)轴，获得迁移能力；并通过分泌多种因子(CD96、CD103)促进其本身黏附于上皮细胞^[7]。这些结果提示，黏膜NK细胞与肠上皮细胞存在着紧密的生理信号联系。

如前所述，肠黏膜NK细胞来源于骨髓，并由肠道微环境介导特化^[8-9]。目前，尚不清楚这个特化过程的分子机制，IL-15和IL-18或在这个过程起介导作用^[8]。先前对猪的研究发现，未采食初乳(含有大量抗体)的新生仔猪血液NK细胞呈现出具备抗体依赖细胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)的活性，但无自然杀伤的特点；无菌成年猪血液NK细胞均具有ADCC和自然杀伤活性，提示肠黏膜NK细胞活性不仅受肠道微生态的调节作用，也受食源性物质的调节作用；令人惊讶的是，无菌条件和未采食初乳猪血液NK细胞的ADCC活性似乎较正常条件下所饲养猪的要高，提示初乳和环境对机体NK细胞活性的调节作用^[27]。相似地，Yang等^[28]也发现，胚胎期仔猪和成年猪血液NK细胞对鸡血红细胞的ADCC反应能力相当，但对病毒感染NK细胞的自然杀伤反应需在出生1日龄后才开始获得，2周龄时达到成年水平，而对肿瘤细胞系K562的自然杀伤反应需在1周龄后才表现出变化，2周龄时达到成年水平。这些结果表明，猪外周循环系统中NK细胞呈现出一定的发育规律，但其肠黏膜NK细胞的发育规律仍未见报道。

3.2 肠黏膜NK细胞的功能(维持、修复肠上皮细胞完整性与功能)

在肠黏膜，大量NK细胞黏附于肠上皮细胞间^{[7, 11]}。研究证实，黏膜NK细胞自身分泌的部分细胞因子是保证肠道屏障完整性的必要条件，发挥维护肠道健康的作用^{[2-3, 24]}。黏膜NK细胞可以分泌多种细胞因子，包括IL-22、IL-10、LIF和IL-26^[29]。Kumar等^[24]的研究表明呼吸道黏膜NCR1⁺RORγt⁺ NK细胞合成分泌IL-22的效率远高于其他类型细胞(如DC、巨嗜细胞及其他T细胞)，是黏膜IL-22的最大贡献者。IL-22可促进肠道黏液蛋白、防御素、抗菌肽和凝集素的合成与分泌并维持肠道完整性^[29-30]。基因敲除小鼠模型的研究证实，IL-22缺失导致小鼠呼吸道上皮细胞在流感病毒感染的情况下无法得到修复；而对受感染的IL-22^-/-小鼠接种IL-22⁺ NK细胞则能够显著修复其气管和支气管黏膜损伤，缓解流感病毒导致的体重下降等症状^[24]。同样，给重组激活基因2缺失(recombination activating gene 2 deletion，Rag2^-/-)小鼠(机体不存在T淋巴细胞，排除T细胞分泌IL-22带来的影响)攻毒柠檬酸杆菌，虽然试验鼠小肠黏膜合成IL-22的NK细胞数量未变，但其合成IL-22的能力提高了20倍，并促进小鼠恢复健康；而Rag2^-/-白细胞介素2受体γ亚基缺失(interleukin-2 receptor subunit gamma deletion，IL-2RG^-/-)(NK细胞无法合成IL-22)小鼠在感染柠檬酸杆菌后第7天全部死亡^[2]。可见，黏膜NK细胞通过分泌IL-22在上皮细胞的损伤修复过程中发挥重要作用^[19]。

3.3 肠道微生物对NK细胞免疫功能的调节作用

关于微生物对NK细胞的激活作用，目前大部分研究主要集中于相关辅助细胞或因子在NK细胞活性和功能调控过程中的作用。可以确定的是，DC在NK细胞的成熟、活化及增殖分化过程中发挥重要作用^{[8-9, 20]}；而嗜酸性乳杆菌能促进DC分泌IL-12，后者激活NK细胞，并促使其合成、分泌INF-γ^{[8, 31]}。此外，口服乳杆菌调节了血液致炎细胞因子如TNF-α、IL-6和INF-γ的水平^{[2, 5]}；这些致炎细胞因子均可影响黏膜NK细胞的活性。但是，微生物能否直接与NK细胞发生互作而调控NK细胞的活性和功能，目前仍未有定论。Yang等^[7]报道，肠道共生菌可调节黏膜免疫细胞合成IL-22的能力；而黏膜NK细胞已被证实是肠黏膜IL-22的最大贡献者，提示肠道共生菌与黏膜NK细胞之间可能存在紧密关联。如前所述，NK细胞大量存在于肠上皮细胞之间^[32]，提示NK细胞可能具有直接感应肠道微生物的能力；Sivori等^[33]亦推断NK细胞可直接感受乳酸菌的调节而发挥功能。在健康状态下，乳酸菌^[34-35]和双歧杆菌^[36]可刺激肠道黏膜免疫系统的发育。Rizzello等^[23]认为乳酸菌的免疫调节功能主要体现在刺激NK细胞增殖并增强其细胞功能，对动物机体维持健康和预防疾病具有重要意义。Fink等^[31]亦报道嗜酸性乳杆菌和干酪乳杆菌显著提高NK细胞的活力和杀菌能力；此外，Costabile等^[37]研究表明鼠李糖乳杆菌显著提高健康老年人的NK细胞活力。体外研究表明，乳酸菌显著提高NK细胞数量和活性，同时促进肠上皮细胞系Caco-2合成并分泌IL-15^[38]，后者已被证实在维持NK的存活、增殖与分化等过程中起决定性作用^[9]。Qiu等^[39]进一步研究发现，植物乳杆菌通过识别Toll样受体2(Toll-like receptor 2，TLR2)促进非接触性共培养的NK细胞合成并分泌IL-22，从而提高共培养体系中小肠上皮细胞紧密连接蛋白的表达，修复大肠杆菌K88诱导的细胞损伤。可见，肠道微生物，尤其是具有益生特性的乳酸菌，可通过激活辅助细胞或直接激活NK细胞而调节其免疫功能，改善肠道健康。

4 小结

免疫系统和微生物系统是构成肠道屏障的两大重要组分。NK细胞在肠黏膜上皮物理屏障功能的维护中发挥关键作用，而肠道微生物对NK细胞的免疫功能具有显著的调节作用。乳酸菌类益生菌已被证实能够改善畜禽(特别是初生/幼龄动物)的肠道健康，后续进一步研究益生菌对肠黏膜NK细胞免疫功能的调控作用将有助于阐明益生菌发挥功效的免疫学机制。