在现代集约化畜牧业的生产中,为提高反刍动物生长性能而大量饲喂以谷物淀粉为主的高精料饲粮,往往导致瘤胃酸中毒的发生[1]。乳酸是瘤胃内重要的中间代谢产物,在反刍动物发生瘤胃酸中毒的进程中扮演着重要的角色。目前国际上多数学者认同乳酸中毒学说,即乳酸产生菌和利用菌的菌群失调使瘤胃内乳酸逐渐累积,从而诱发瘤胃酸中毒[2-4]。乳酸产生菌主要包括牛链球菌、溶纤维丁酸弧菌、乳酸杆菌等;乳酸利用菌主要有埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii, M. elsdenii)、反刍兽新月单胞菌(Selenomonus ruminantium, S. ruminantium)[4]。瘤胃中超过70%的乳酸可被M. elsdenii代谢为挥发性脂肪酸(VFA)[5]。因此,许多研究者通过提高瘤胃内乳酸利用的方式来调控瘤胃酸中毒,例如:添加硫胺素可促进M. elsdenii的增殖,降低乳酸浓度,提高瘤胃pH[6];添加益生素、酵母提取物等可提高乳酸利用菌活力及增殖速率,加速对乳酸的分解利用;瘤胃内接种M. elsdenii可有效缓解瘤胃酸中毒[7]。研究表明,生长环境pH、培养基底物类型、乳酸的浓度和构型等都对乳酸的利用机制有显著的影响。本文综述了瘤胃内乳酸利用的主要通路、调控因素及其在瘤胃酸中毒缓解相关方面的应用,旨在系统地总结反刍动物瘤胃乳酸代谢的主要机制,为瘤胃酸中毒的调控提供理论参考。
1 瘤胃中乳酸的利用途径总结利用同位素标记研究乳酸代谢产物而提出的几条代谢途径[8-10],瘤胃中乳酸的分解代谢通路主要有3条:琥珀酸途径、丙烯酸途径、乙酸和丁酸途径(图 1)。常规饲粮条件下,瘤胃中乳酸主要经琥珀酸途径或者由乙酸和丁酸途径进行代谢,D型乳酸和L型乳酸经由对应的乳酸脱氢酶(LDH)转化为丙酮酸,丙酮酸在丙酮酸羧化酶的催化下生成草酰乙酸,再经苹果酸和延胡索酸生成琥珀酸,最终琥珀酸脱羧生成丙酸;生成的丙酮酸也能在丙酮酸脱氢酶的作用下生成乙酰辅酶A,最终生成乙酸和丁酸。而在高精料饲粮条件下,乳酸主要经过丙烯酸途径,即D型乳酸先在乳酸消旋酶(LR)的作用下转化成L型乳酸再进一步代谢,而L型乳酸通过丙酰辅酶A转移酶生成乳酰辅酶A,随后脱水生成丙烯酰辅酶A,最终丙烯酰辅酶A加氢还原成丙酸。
瘤胃pH是评估和判定瘤胃发酵功能的一项重要的生理指标,由于亚急性瘤胃酸中毒(subacute ruminal acidosis, SARA)的临床症状并不明显,目前国际上多数研究者通过检测pH的变化来判断SARA的发生,即当瘤胃pH处于5.0~5.5为SARA,pH处于5.0以下为急性酸中毒。正常饲喂条件下,瘤胃内的pH保持在5.8~6.8;而高精料饲喂条件下,大部分微生物得到了充足的能量供应,生长速度大大提高,使瘤胃中总挥发性脂肪酸的浓度升高,pH下降[11]。当pH下降到5.5左右,大部分微生物的生长受到抑制,而能耐受较低pH的牛链球菌成为优势菌群,并以乳酸为主要的代谢终产物,而此时由于多数乳酸分解菌活动受到抑制,仅有M. elsdenii能较好地利用乳酸[1]。可见,瘤胃pH可能是影响瘤胃中乳酸分解菌活动最重要的因素。
pH主要通过影响酶的活性来改变乳酸代谢通路中反应的进程。丙酰辅酶A转移酶、乳酰辅酶A脱水酶和丙烯酰辅酶A还原酶介导了M. elsdenii乳酸代谢途径的关键步骤(图 1)。而经典化学认为,代谢途径中催化不可逆反应的酶为控制代谢反应的关键。但据目前的研究来看,乳酸代谢主要的2条途径中大多为可逆反应,且丙烯酸通路中关键酶编码基因序列尚未发掘,多数学者的研究方向主要集中在不同pH下M. elsdenii的生长速率及其代谢产物的变化,鲜有pH影响瘤胃内乳酸代谢途径中酶活性的相关报道。随着相关技术的发展,未来可进一步研究pH对乳酸代谢通路中酶活性的变化及相关基因表达的影响,以期从蛋白质和转录水平更深入地解析瘤胃酸中毒发生的进程。
2.2 底物类型M. elsdenii和S. ruminantium都能以乳酸为发酵底物产挥发性脂肪酸,但只有M. elsdenii对乳酸的利用没有抑制,S. ruminantium可能对乳酸的利用存在分解代谢抑制。Russell等[12]体外研究以多种底物培育不同的瘤胃细菌发现,乳酸仅在蔗糖、木糖和葡萄糖消耗后才被S. ruminantium使用,而M. elsdenii能同时利用葡萄糖、麦芽糖和乳酸。这可能是由于乳酸向丙酮酸转化时LDH活性受到葡萄糖抑制[13],但其具体的影响机制仍待进一步研究证明。此外,M. elsdenii利用乳酸的代谢产物也因底物不同而有所差异。以乳酸为单一底物体外培养M. elsdenii时,多数菌株的主要产物为乙酸和丙酸;以葡萄糖为底物时,M. elsdenii主要产物为丁酸,并不产生丙酸[14]。原因是LR只能由D型乳酸和L型乳酸诱导,故以葡萄糖为底物无法产生丙酸[15]。并且,当乳酸和葡萄糖同时存在时,乳酸比葡萄糖利用的更快,只有乳酸的浓度很低时,葡萄糖才会被利用,乳酸的发酵速度比葡萄糖快5~6倍[16]。因此,在饲喂以淀粉为主的高精料饲粮时,M. elsdenii的乳酸利用率高于S. ruminantium,可能对瘤胃酸中毒的缓解起至关重要的作用。
2.3 乳酸浓度当反刍动物发生亚急性酸中毒时,瘤胃中乳酸浓度在0~5 mmol/L变化,与正常状态下相差不大;急性酸中毒时,乳酸浓度高达50~120 mmol/L,因为SARA期瘤胃酸度下降,但M. elsdenii耐受酸度的阈值为5.4,此时大多数瘤胃细菌已裂解死亡,而M. elsdenii仍可利用乳酸大量增殖[17],故SARA初期乳酸浓度维持在正常水平。若此时碳源比较充足,牛链球菌将继续繁殖,产生的乳酸导致pH进一步下降,此时乳酸利用菌的生存受到抑制,乳酸大量累积,导致急性酸中毒的发生。而体外建立瘤胃酸中毒模型发现,当发生SARA时的乳酸浓度在15~25 mmol/L[18],因为在瘤胃中乳酸除了经M. elsdenii代谢利用外,瘤胃上皮对乳酸也有一定的吸收作用,故体外酸中毒诱导模型中乳酸浓度稍高于体内。
本课题组前期的研究结果显示,培养基中高、中、低3种乳酸浓度(15、30、90 mmol/L)能够显著影响M. elsdenii的生长速率、乳酸利用率及相关基因的相对表达量,且低浓度下M. elsdenii趋向于产乙酸,高浓度下趋向于产丙酸和丁酸[19]。这与研究报道中反刍动物采食大量易发酵碳水化合物后,瘤胃丙酸比例提高,乙酸比例降低的结论一致[20]。高浓度乳酸条件下为M. elsdenii提供了充足的能量,通过提高瘤胃酸中毒时期M. elsdenii的数量能够加速乳酸的消耗,从而缓解瘤胃酸中毒。
2.4 乳酸分子构型乳酸具有2种同分异构体,即L型乳酸和D型乳酸,在瘤胃中主要由M. elsdenii代谢产生挥发性脂肪酸,也可由瘤胃上皮细胞吸收。L型乳酸通过丙烯酸途径转化为丙酸,D型乳酸的代谢途径可能有2条:一是经LR转化为L型乳酸后进行代谢,二是在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)非依赖性D-LDH的催化下转化为丙酮酸后代谢,且L型乳酸的反应速度低于D型乳酸[21],因为LR的存在限制了2种乳酸构型之间的转化[15]。2种异构体在瘤胃上皮的吸收率也存在差异,通常是L型乳酸的吸收大于D型乳酸的吸收速率[22],因为D-LDH存在于线粒体内膜上,D型乳酸需经转运蛋白从细胞质转运到线粒体基质中才能被氧化,并且发现D型乳酸穿梭线粒体膜时存在3种转运蛋白:D型乳酸/H+转运蛋白、D型乳酸/酮酸转运蛋白和D型乳酸/苹果酸转运蛋白[23]。但是据报道由于动物体内缺乏D-LDH,D型乳酸和L型乳酸在肾脏中的吸收方式为主动转运,且共用一套钠盐转运系统而相互干扰,这些因素导致血液中D型乳酸大量蓄积,最终诱发代谢性酸中毒[24]。
3 提高瘤胃内乳酸利用进而缓解瘤胃酸中毒的措施传统的缓解瘤胃酸中毒的方法是在饲粮中直接添加碳酸盐等缓冲剂,可以在一定程度上缓解瘤胃酸中毒症状,但长期添加会影响机体酸碱平衡和阴阳离子平衡,具有负面效应[1]。瘤胃酸中毒发生的根本原因是瘤胃内乳酸产生菌与乳酸利用菌的菌群失调,使乳酸的产生和分解不平衡,从而造成乳酸累积。因此,生产中常常通过降低乳酸产生和提高乳酸利用的方式来避免酸中毒的发生。例如,接种牛链球菌和乳酸杆菌的疫苗能够刺激机体产生抗体,降低瘤胃液中乳酸浓度及以牛链球菌、乳酸杆菌数量[25];或者通过使用莫能菌素等离子载体类抗生素可破坏牛链球菌胞内Na+-Ca2+平衡,抑制其大量增殖,降低乳酸的产生[22]。但抗生素的使用也同时会抑制瘤胃纤维降解细菌和厌氧真菌,不利于粗饲料的利用,近年来国际上多数国家已禁止使用抗生素作为饲料添加剂。因此,研发替代抗生素来改善瘤胃发酵的物质成为当务之急。
3.1 瘤胃接种乳酸利用菌M. elsdenii是瘤胃中主要的乳酸分解菌,能将酸性较强的乳酸转化为酸性更弱的挥发性脂肪酸,从而提高瘤胃内环境pH[10]。在饲喂高精料饲粮的绵羊瘤胃中,M. elsdenii占乳酸利用菌总数的21%,能将瘤胃中60%~80%的乳酸代谢为丙酸[5],一般的乳酸分解菌在pH=5.5左右时活性受到抑制,但M. elsdenii还能够利用乳酸进行代谢。并且M. elsdenii优先利用乳酸,与牛链球菌竞争葡萄糖、麦芽糖等底物,抑制牛链球菌的生长[16]。所以,M. elsdenii是理想的提高瘤胃乳酸代谢能力的菌株。而S. ruminantium虽然占瘤胃中可培养细菌的22%~51%,但具有乳酸降解能力的菌株只占不到1%,在酸性环境下对乳酸的代谢比较缓慢,大部分菌株既可利用乳酸又可生产乳酸,并且葡萄糖的存在会抑制LDH活性从而降低乳酸向丙酮酸的转化率,故选择S. ruminantium来缓解瘤胃酸中毒可能不太有效。
M. elsdenii作为一种微生物添加剂来缓解瘤胃酸中毒症状的研究早有报道,在不同菌株、不同添加剂量的选择上做了大量研究。Kung等[26]研究瘤胃液体外发酵易发酵碳水化合物时发现,接种M. elsdenii B159可降低瘤胃液中乳酸的积累。在急性酸中毒的绵羊瘤胃中灌注M. elsdenii JDB301能够维持了瘤胃的稳定性(pH>6.0)[27]。近年来发现添加M. elsdenii NCIMB 4115菌株在实际生产中的效用较好。Henning等[18]研究发现,M. elsdenii NCIMB 4115菌株在控制瘤胃酸中毒方面具有潜在作用,并将之应用于动物试验发现,无论是突然还是逐步过渡到高精料饲粮,与对照组相比,瘤胃中添加此菌株均可显著提高pH,降低瘤胃内乳酸浓度[7]。Aikman等[28]在早期泌乳奶牛瘤胃中补充M. elsdenii NCIMB 4115使瘤胃发酵模式趋向于产丙酸的方向改变,并提高了瘤胃pH。这些研究表明,M. elsdenii的不同菌株均能对瘤胃酸中毒起到缓解的作用。
添加剂量也是决定M. elsdenii是否能够有效缓解瘤胃酸中毒的一个重要的因素,早期的研究主要是计算接种M. elsdenii个数。Kung等[26]研究高剂量(瘤胃中终浓度为8.7×106个/mL)M. elsdenii菌液接种到体外人工瘤胃中,与对照组相比,pH一直保持在5.3以上,此时M. elsdenii具有相当的活力,可以分解牛链球菌产生的大部分乳酸。Robinson等[29]向瘤胃中接种终浓度为6×107个/mL的M. elsdenii 407A可显著降低瘤胃乳酸浓度,提高pH,减轻瘤胃酸中毒。之后的研究主要采用平板计数法来更准确地表示接种M. elsdenii菌株的剂量,此法可测定样品中可培养的活的微生物数量。据报道,通过瘤胃瘘管添加M. elsdenii NCIMB 4115菌株使瘤胃终浓度达到4×104 CFU/mL即可有效降低乳酸累积,改善瘤胃发酵,缓解瘤胃酸中毒[7]。
3.2 添加有机酸电子受体延胡索酸是琥珀酸途径的关键中间产物,也是重要的电子受体,可转移细胞间的氢,从而降低甲烷和乳酸的产量[30],而S. ruminantium主要经过琥珀酸途径代谢乳酸产丙酸、延胡索酸,提高S. ruminantium的增殖速率。已有研究报道延胡索酸可提高反刍动物瘤胃中乳酸利用菌S. ruminantium的数量,并且在高精料条件下能增加丙酸的生成,显著提高瘤胃液pH,添加剂量为4 mmol/L时降低乳酸的效果较为显著[31]。与延胡索酸类似,苹果酸也可提高S. ruminantium利用乳酸的能力。Nisbet等[32]向含有乳酸的培养基中添加10 mmol/L的苹果酸刺激S. ruminantium利用乳酸的能力最佳。作为乳酸代谢及三羧酸循环的中间产物,延胡索酸和苹果酸等有机酸电子受体能被机体代谢利用,与抗生素相比无残留,不会产生细菌抗药性,因此可作为一种绿色的添加剂替代抗生素在瘤胃酸中毒中应用。
3.3 添加硫胺素硫胺素是机体碳水化合物代谢过程必需的辅酶因子,主要以焦磷酸硫胺素的形式参与丙酮酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶辅酶的脱羧反应,当机体内硫胺素缺乏时,碳水化合物便不能正常代谢,丙酮酸无法进入三羧酸循环的氧化过程,只能通过LDH转化为乳酸,造成丙酮酸和乳酸的累积[33]。正常饲喂条件下,反刍动物自身可以合成足够的硫胺素,不需额外添加;在高精料饲粮条件下,反刍动物体内硫胺素需要量升高,而瘤胃微生物硫胺素的合成量不足,从而导致瘤胃酸中毒的发生。Pan等[34]测定了由高精料诱导SARA的奶牛中与硫胺素相关代谢酶的活性,高精料组血浆中丙酮酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶的活性显著低于对照组(正常饲粮组),而在高精料组中添加硫胺素后,二者的活性显著升高。另外研究还表明,硫胺素可降低瘤胃中乳酸产生菌的数量,提高乳酸利用菌的数量,从而降低乳酸的累积。潘晓花等[6]利用体外批次培养法发现添加180 mg/kg硫胺素可改善瘤胃发酵,降低瘤胃pH和乳酸浓度,有效缓解SARA。Wang等[35]进一步研究发现,在饲喂高精料诱导SARA的奶牛饲粮中添加180 mg/kg硫胺素可显著提高M. elsdenii和S. ruminantium的数量。但对于硫胺素如何影响瘤胃中的微生物菌群的机制尚不清楚,有待于进一步研究。总之,在饲喂高精料的反刍动物饲粮中添加硫胺素可以起到缓解瘤胃酸中毒的作用。
4 小结有关瘤胃酸中毒中乳酸代谢机制的研究仍停留在20世纪80~90年代时利用同位素标记法提出的几条可能的代谢通路,当前多数研究集中于外界环境及底物碳源对主要乳酸利用菌M. elsdenii代谢产物及生长速率的影响,缺乏对代谢通路的系统性解析、验证。另外,转录层次上如各关键酶编码基因等对乳酸的代谢也起重要的调控作用,但未见有相关研究报道。同时,瘤胃内接种M. elsdenii是预防和缓解瘤胃酸中毒的有效措施,由于当前技术条件限制,难以在饲养场中大规模应用,单一的预防措施难以有效控制瘤胃酸中毒的发生。因此,应利用代谢组学、宏基因组学、转录组学等先进的高通量检测手段,系统地研究M. elsdenii对乳酸的利用规律;此外,利用多种调控技术相结合的方式可能会更加有效地控制瘤胃酸中毒的发生。
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