2. 中国农业科学院饲料研究所, 农业农村部饲料生物技术重点实验室, 北京 100081
2. Key Laboratory for Feed Biotechnology of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Institute of Feed Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
铜是人和动物不可缺少的微量元素之一,在动物的生长、繁殖、免疫及一系列生命活动中发挥重要作用[1]。铜通过参与合成铜蓝蛋白,影响铁的吸收和转运,缺铜时会引起缺铜性贫血[2]。铜也是许多酶的组成成分,尤其是铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、酪氨酸酶和细胞色素氧化酶的组成部分[3-6],铜锌超氧化物歧化酶是体内主要的抗氧化酶[4],酪氨酸酶是黑色素合成的关键酶[5],细胞色素氧化酶在能量转移中起着极为重要的作用[6]。目前,人们对动物产品和生活环境的要求越来越高,饲粮中微量元素添加剂问题日益引起社会的关注。因此,我国《饲料添加剂安全使用规范》规定,家禽配合饲粮或全混合饲粮中铜的最高限量为35 mg/kg。在畜牧生产实践中硫酸铜(CuSO4)的应用最为广泛,但硫酸铜存在易吸潮结块、贮存不便等缺点,且可催化饲粮中不饱和脂肪氧化。因此,有必要寻求新型铜源,碱式氯化铜(tribasic copper chloride,TBCC)在促进肉仔鸡生长方面比硫酸铜更有效,且对维生素的不良氧化作用比硫酸铜低[7];蛋氨酸铜(copper methionine,CuM)的生物学利用率比硫酸铜高。目前对新型铜源的研究主要集中于高铜的生物学利用率,而不同铜水平时动物对铜的吸收利用差异很大,所以有必要进行低铜饲粮铜源相对生物学利用率的研究。本试验旨在研究不同铜源及添加水平对肉仔鸡生长性能、血浆抗氧化酶活性和肝脏铜、锌、铁含量的影响,探讨硫酸铜、碱式氯化铜和蛋氨酸铜的相对生物学利用率,为研制新型高效环保饲料添加剂提供试验依据。
1 材料与方法 1.1 试验设计与试验动物试验采用3×2完全随机设计,3种铜源分别为硫酸铜(国药集团化学试剂有限公司,铜含量为25.45%)、碱式氯化铜(苏州联雄精细化工科技有限公司,铜含量为58.12%)和蛋氨酸铜(武汉远成共创科技有限公司,铜含量为16.36%),2个铜添加水平分别为10和20 mg/kg,另设1个不添加铜的对照组,共7组。试验在安徽科技学院畜牧科技园动物生产基地进行,选择1日龄健康雄性爱拔益加(AA)肉仔鸡504只,随机分为7组,每组6个重复,每个重复12只鸡。
1.2 饲养管理与试验饲粮肉仔鸡采用笼养方式,免疫程序、光照制度参照AA肉仔鸡饲养管理手册,试验期为21 d。试验饲粮的配制参照我国《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004),基础饲粮组成及营养水平见表 1。
饲粮在配制时现场采样,采集于自封袋中,于-20 ℃保存以备分析饲粮微量元素含量。于21日龄时,每个重复选取健康、接近平均体重的肉仔鸡2只,每组12只,共84只,称重后颈静脉采血,静置后3 500 r/min离心15 min,制备血浆,分装于离心管中,-20 ℃冻存以备血浆抗氧化酶活性检测;然后屠宰取出肝脏放入自封塑料袋中,-20 ℃冻存以备分析微量元素含量。
1.4 测定指标与方法 1.4.1 生长性能记录肉仔鸡的耗料量和鸡只死淘数,并于1和21日龄早晨对全部肉仔鸡空腹称重,计算1~21日龄肉仔鸡的平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。
1.4.2 铜、锌和铁含量于105 ℃将饲粮和肝脏样品烘至恒重,称取1.5 g样品于锥形瓶中,用超纯水润湿,加入20 mL优级纯硝酸,混匀,封口静置24 h,置于电炉上低温消煮至近干,再加入2 mL高氯酸,加热,待冒白烟溶液未干前停止加热,将溶液无损失地转移到100 mL容量瓶中,用纯水定容,使用VARIAN SpectrAA-240原子吸收分光光度计测定铜、锌和铁含量,并以纯水作空白。
1.4.3 血浆抗氧化酶活性采用紫外/可见分光光度计测定血浆铜蓝蛋白和铜锌超氧化物歧化酶活性,所用试剂盒购自南京建成生物工程研究所,严格参照试剂盒说明书进行测定。
1.5 数据统计分析采用SAS 9.13软件中GLM程序进行试验数据分析,铜源和铜添加水平的主效应采用双因素方差分析进行差异显著性检验,其中P < 0.05为差异显著,P < 0.01为差异极显著。铜源相对生物学利用率采用多元线性回归斜率比法计算[8]。建立的回归方程为:Y=d+aX1+bX2+cX3,其中:Y为饲粮中添加铜的敏感指标;d为截距,即不添加铜时的敏感指标值;X1、X2和X3分别为硫酸铜、碱式氯化铜和蛋氨酸铜的添加水平(以铜元素计算)。以硫酸铜为参比标准物(100%),碱式氯化铜和蛋氨酸铜的相对生物学利用率分别为b/a×100和c/a×100。
2 结果 2.1 饲粮铜源和铜添加水平对1~21日龄肉仔鸡生长性能的影响由表 2可知,饲粮铜源和铜添加水平及其交互作用对1~21日龄肉仔鸡的末重、平均日采食量、平均日增重和料重比均无显著影响(P>0.05)。对照组的末重、平均日采食量和平均日增重低于硫酸铜、碱式氯化铜和蛋氨酸铜添加组;10 mg/kg铜添加水平组的末重、平均日采食量和平均日增重低于20 mg/kg铜添加水平组,高于对照组,但均无显著差异(P>0.05)。饲粮铜源和铜添加水平对料重比无显著影响(P>0.05)。
由表 3可知,饲粮铜源和铜添加水平对21日龄肉仔鸡的血浆铜蓝蛋白活性有极显著影响(P < 0.01);对照组的血浆铜蓝蛋白活性极显著低于硫酸铜、碱式氯化铜和蛋氨酸铜添加组(P<0.01);对照组的血浆铜蓝蛋白活性极显著低于10和20 mg/kg铜添加水平组(P<0.01),10 mg/kg铜添加水平组显著低于20 mg/kg铜添加水平组(P<0.05)。饲粮铜源对血浆铜锌超氧化物歧化酶活性有显著影响(P < 0.05);对照组的血浆铜锌超氧化物歧化酶活性极显著低于碱式氯化铜和蛋氨酸铜添加组(P<0.01),显著低于硫酸铜添加组(P<0.05)。饲粮铜源和铜添加水平的交互作用对血浆抗氧化酶活性无显著影响(P>0.05)。
多元线性回归分析结果显示,21日龄肉仔鸡的血浆铜蓝蛋白活性与饲粮铜添加水平之间存在极显著的线性回归关系(P<0.01)。以血浆铜蓝蛋白活性为指标,建立血浆铜蓝蛋白活性与饲粮铜添加水平之间的回归方程为(图 1):
Y=2.487 48+0.007 82X1+0.011 03X2+0.011 11X3 (R2=0.334 0,P < 0.000 1)。
式中:Y为血浆铜蓝蛋白活性;X1、X2和X3分别为饲粮硫酸铜、碱式氯化铜和蛋氨酸铜的添加水平。以肉仔鸡对硫酸铜中铜的生物利用率为100%,根据回归方程斜率比法计算肉仔鸡对碱式氯化铜和蛋氨酸铜的相对生物学利用率分别为141.05%和142.07%。结果表明,蛋氨酸铜的生物学利用率极显著高于硫酸铜(P < 0.01),与碱式氯化铜无显著差异(P>0.05)。
2.3 饲粮铜源和铜添加水平对21日龄肉仔鸡肝脏铜、锌和铁含量的影响由表 4可知,饲粮铜源和铜添加水平对21日龄肉仔鸡的肝脏铜含量有极显著影响(P < 0.01),对肝脏锌和铁含量无显著影响(P>0.05)。对照组的肝脏铜含量极显著低于硫酸铜、碱式氯化铜和蛋氨酸铜添加组(P<0.01);对照组的肝脏铜含量极显著低于10 mg/kg铜添加水平组(P<0.01),10 mg/kg铜添加水平组的肝脏铜含量极显著低于20 mg/kg铜添加水平组(P<0.01)。饲粮铜源和铜添加水平的交互作用对肝脏铜、锌和铁含量无显著影响(P>0.05)。
多元线性回归分析结果显示,21日龄肉仔鸡的肝脏铜含量与饲粮铜添加水平之间存在极显著的线性回归关系(P<0.01)。以肝脏铜含量为指标,建立肝脏铜含量与饲粮铜添加水平之间的回归方程为(图 2):
Y=9.306 05+0.043 28X1+0.055 23X2+0.059 57X3 (R2=0.390 6,P < 0.000 1)。
式中:Y为肝脏铜含量;X1、X2和X3分别为硫酸铜、碱式氯化铜和蛋氨酸铜的添加水平。以肉仔鸡对硫酸铜中铜的生物利用率为100%,根据回归方程斜率比法计算肉仔鸡对碱式氯化铜和蛋氨酸铜的相对生物学利用率分别为127.61%和137.64%。结果表明,蛋氨酸铜的生物学利用率极显著高于硫酸铜(P < 0.01),与碱式氯化铜无显著差异(P>0.05)。
3 讨论铜是一种必需微量元素,家禽对铜的需要量一般为4~6 mg/kg[9]。研究表明,饲粮中添加125~250 mg/kg铜对断奶仔猪的生长有促进作用[10-11],而铜对肉仔鸡的促生长作用没有断奶仔猪明显[12],但可提高鹅的生长性能[13-14]。Kim等[15]在肉鸡饲粮中分别添加0、100、200和300 mg/kg铜,与硫酸铜相比,碱式氯化铜可显著提高肉鸡的平均日增重和平均日采食量。本研究结果表明,肉仔鸡的平均日增重和平均日采食量均随饲粮铜添加水平的增加而增加,但饲粮中添加20 mg/kg铜对肉仔鸡的生长性能无显著影响。分析其原因可能有以下几个方面:一是由于在动物饲粮中添加高剂量铜存在潜在危害,我国对饲粮中铜的添加水平做出了严格的限制,本试验饲粮中铜的添加水平相对较低,未达到影响生长性能的剂量;二是与试验动物的品种有关,肉鸡的消化生理特点与猪、鹅有明显不同;三是与饲粮组成有关,研究表明,在小麦鱼粉型饲粮中添加250 mg/kg铜可显著提高肉鸡的生长性能,但在玉米豆粕型饲粮中添加相同剂量的铜却对肉鸡的生长性能无显著影响[16-17],本研究采用玉米豆粕型饲粮。
铜酶或铜蛋白广泛存在于动物体中,并发挥着不同的生理功能[18]。铜锌超氧化物歧化酶是一种金属酶,广泛存在于所有细胞的细胞质中,在防止细胞氧化损伤和清除超氧化物自由基方面发挥着重要作用[19]。铜蓝蛋白是铜在血液中存在的主要形式,在铁的运输和代谢过程中发挥着重要作用[20]。Wu等[12]研究表明,肉鸡饲粮中添加30 mg/kg铜,血清铜锌超氧化物歧化酶和铜蓝蛋白活性显著升高。本试验研究表明,21日龄肉仔鸡的血浆铜蓝蛋白和铜锌超氧化物歧化酶活性随饲粮铜添加水平的增加而升高。
肉鸡对不同来源的铜有不同的利用率。一般而言,肉鸡对硫酸铜的生物学利用率高于溶解性较差的氧化铜和硫化铜,碱式氯化铜的溶解性低于硫酸铜[21],而本试验结果表明,肉仔鸡对碱式氯化铜的生物学利用率高于硫酸铜,分析其原因可能是由于碱式氯化铜在中性溶液中溶解度较小,经过胃液(酸性)后显著改变了其溶解性。
动物从饲粮中摄入的铜主要贮存于肝脏[22]。肝脏铜含量会随饲粮铜水平的变化而变化,是评价铜源相对生物学利用率的敏感指标[15]。Wu等[23]以肝脏铜含量为判定指标,碱式氯化铜和蛋氨酸铜相对于硫酸铜(100%)的生物学利用率分别为104%和111%。Guo等[24]以肝脏铜含量为判定指标,赖氨酸铜、蛋白质螯合铜A和蛋白质螯合铜B相对于硫酸铜(100%)的生物学利用率分别为111%、109%和105%。本试验结果与前人的研究结果一致,肉仔鸡对氨基酸螯合铜的生物学利用率显著高于硫酸铜。也有研究表明,碱式氯化铜中铜的相对生物学利用率低于硫酸铜,如Kim等[15]以肉鸡肝脏铜含量和羽毛铜含量为评价指标,得出碱式氯化铜相对于硫酸铜(100%)的生物学利用率分别为92.6%和84.3%。这可能与试验动物、饲粮铜水平或敏感指标的选择有关,因此进一步研究铜源在不同动物胃肠道中的吸收机制显得尤为重要。
肝脏铜含量虽然是评价铜源相对生物学利用率的敏感指标,但肝脏的取样不方便。血浆铜蓝蛋白活性可反映铜在机体中的代谢状态,是评价铜源相对生物学利用率的另一个敏感指标[23]。本研究结果表明,21日龄肉仔鸡血浆铜蓝蛋白活性与饲粮铜添加水平之间存在极显著的线性回归关系,采用血浆铜蓝蛋白活性为指标评价铜源的相对生物学利用率是一种较为可靠的方法。Hansen等[25]以血浆铜蓝蛋白活性为指标评价鹿对不同铜源的利用率,表明甘氨酸铜相对于硫酸铜(100%)的生物学利用率为157%。
4 结论① 饲粮铜添加水平≤20 mg/kg(基础饲粮中铜含量为9.65 mg/kg)时对1~21日龄肉仔鸡的生长性能无显著影响,但饲粮铜源和铜添加水平对21日龄肉仔鸡的血浆铜蓝蛋白活性和肝脏铜含量有显著影响。
② 21日龄肉仔鸡对低铜饲粮(铜添加水平≤20 mg/kg)中3种铜源的相对生物学利用率为:蛋氨酸铜>碱式氯化铜>硫酸铜。以血浆铜蓝蛋白活性为评价指标,碱式氯化铜和蛋氨酸铜相对于硫酸铜(100%)的生物学利用率分别为141.05%和142.07%;以肝脏铜含量为评价指标,碱式氯化铜和蛋氨酸铜相对于硫酸铜(100%)的生物学利用率分别为127.61%和137.64%。
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