产蛋周期延长具有重要的经济和生态效益。产蛋周期每增加10周,每打鸡蛋可节约大约1 g氮。而产蛋后期,肠道代谢性损伤导致营养素吸收下降、机体代谢疾病加剧(脂肪肝、骨质疏松症等)以及鸡蛋(蛋壳、蛋清)品质严重下降,这是实现蛋鸡生产“产蛋期延长计划”(100周龄500枚蛋)亟待解决的重要瓶颈问题[1]。因此,如何缓解或有效解决产蛋后期生产性能和产品品质下降,对于提升蛋鸡养殖效益及蛋鸡产业发展和升级具有重要的现实意义。
果寡糖(FOS)是一类由蔗糖分子通过β-1, 2糖苷键结合多个D-果糖(n<8)而形成的小分子糖的总称,具有低热值、稳定、不易被胃肠道消化等理化特性,其广泛存在于大麦、大蒜、洋葱、黑麦等植物中,尤其以菊芋块茎中含量最丰富。研究表明,果寡糖作为饲料添加剂具有调节动物肠道菌群结构[2-4]、促进肠道发育[4-6]、提高机体免疫力[7-8]、调控脂质代谢和矿物吸收[8-11]等功能。目前,果寡糖作为益生元类饲料添加剂,被广泛应用于奶牛[5]、羊[12-14]、猪[15-19]、肉鸡[2-4]和鹌鹑[8, 10]等动物生产上。然而,在蛋鸡上果寡糖的量效关系缺乏系统研究,针对其在产蛋后期蛋鸡上的研究更是鲜有报道。本试验旨在观察饲粮中添加不同水平果寡糖对产蛋后期蛋鸡生产性能、蛋品质、营养素利用率、血清生化指标和肠道形态结构的影响,初步探讨产蛋后期饲喂果寡糖的有效性,进而确定其适宜添加量,以期为果寡糖在产蛋鸡生产中的应用提供参考依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验用果寡糖产品的果寡糖含量为98%,购于日本明治制果有限公司。
1.2 试验设计与试验饲粮采用单因子试验设计,选取384只65周龄产蛋率和体重相近的健康海兰褐蛋鸡,随机分成4组,每组8个重复,每个重复12只。对照组饲喂基础饲粮,试验组在基础饲粮上分别添加0.2%、0.4%和0.6%果寡糖。试验分为预试期1周和正试期12周。参照《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)、结合海兰褐产蛋鸡饲养手册配制玉米-豆粕型基础饲粮,其组成及营养水平见表 1。
试验采用半开放式鸡舍3层立体笼养,每笼(40 cm×37 cm×40 cm)3只,32个重复均匀分布。早晚补光保证光照时间16 h/d,光照强度20 lx,室内相对湿度50%~80%,自然通风和横向负压通风相结合。自由采食和饮水;专人管理,每日捡蛋2次,每周带鸡消毒和清理鸡粪1次;常规免疫。
1.4 测定指标及方法 1.4.1 生产性能正试期内,每天以重复为单位记录产蛋数、产蛋量和耗料量。计算试验前期(第1~6周)、试验后期(第7~12周)和试验全期(第1~12周)的产蛋率、平均日采食量、平均蛋重和料蛋比。
1.4.2 蛋品质正试期第6周末和第12周末,每重复随机选取6枚鸡蛋,采用日本富士坪公司生产的蛋形指数测定仪测定蛋形指数,采用SONOVA蛋品质自动分析仪(Egg AnalyzerTM, Orka Technology Ltd.)测定鸡蛋蛋白高度、哈氏单位和蛋黄颜色;蛋壳强度分析仪(Egg Force Reader, Orka Technology Ltd.)测定蛋壳强度;蛋壳厚度测定仪(Egg Shell Thickness Gauge, Orka Technology Ltd.)测定蛋壳厚度。
1.4.3 血清生化指标正试期第12周末,每重复随机选取2只鸡翅静脉采血3 mL,静置,吸取上清液于离心管中,2 500 r/min离心10 min,取上清液分装于1.5 mL Eppendorf管,-20 ℃保存待用。血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)含量采用卓越300型全自动生化分析仪(上海科华)测定,试剂盒购自上海科华生物工程股份有限公司。血清球蛋白(GLB)含量为血清TP含量与血清ALB含量之差。
1.4.4 营养素利用率饲养试验结束前3天,每重复随机挑选1笼(3只)健康产蛋鸡,采用全收粪法进行代谢试验。试验前断料不断水12 h,此后,以重复为单位准确记录3天的采食量,并于早晚收集新鲜粪样,剔除毛屑杂物后称重。按100 g鲜粪加入10 mL 10%硫酸,充分混匀,于65~70 ℃烘干至恒重,回潮,粉碎后过40目筛制成风干样。
参照张丽英[20]主编的《饲料分析及饲料质量检测技术》中的常规方法进行测定饲粮及粪中干物质、能量、粗蛋白质和粗脂肪的含量,计算饲粮营养素利用率。其中,饲粮及粪中总能采用氧弹燃烧法测定,粗蛋白质含量采用凯氏定氮法测定,粗脂肪含量采用索氏抽提法测定。计算公式为:
正试期第12周末,对照组与0.2%果寡糖添加组每重复选取1只鸡屠宰,剖开腹腔,轻轻挤出空肠消化道内容物,用生理盐水冲洗净残余物,滤纸吸干消化器官残余水分,剪取空肠和回肠前段(前1/4处)约2 cm,用生理盐水冲洗净内容物,10%甲醛固定,制作石蜡切片,苏木精-伊红(HE)染色,HE染色切片光镜下观察,每例样本分别选取3个完整的典型肠绒毛、隐窝,使用图像分析软件ImagePro-Plus 7.0(Media Cybernetics公司,美国)对肠绒毛高度、隐窝深度进行测量,并计算绒毛高度/隐窝深度值。每个视野统计3组数据,绒毛高度是指绒毛顶端到绒毛基部的长度,隐窝深度是指肠腺底部到2个绒毛之间基部开口处的距离。HE染色切片于400倍显微镜下,每例样本选取5处典型视野(肠绒毛上皮组织),计数100个绒毛黏膜柱状细胞,并记录其中杯状细胞数量。
1.5 数据统计分析采用SPSS 16.0软件的one-way ANOVA进行方差分析,再进行F检验和Duncan氏法进行多重比较,用Contrast命令检验果寡糖的线性和二次效应,肠黏膜结构数据采用成组法t检验,以P < 0.05为差异显著性标准,0.05≤P < 0.10为有差异显著性趋势。
2 结果与分析 2.1 饲粮添加果寡糖对产蛋后期蛋鸡生产性能和蛋品质的影响由表 2可知,饲粮添加果寡糖对试验前期(第1~6周)蛋鸡的产蛋率、平均蛋重、平均日采食量和料蛋比均无显著影响(P>0.05)。试验后期(第7~12周),0.2%果寡糖添加组蛋鸡产蛋率有提高的趋势(P=0.053),料蛋比显著降低(P < 0.05),且两者均随果寡糖添加量增加呈二次曲线变化(P < 0.05)。对产蛋率和料蛋比进行二次曲线方程拟合,以产蛋率和料蛋比为评判指标,果寡糖最适添加量分别是0.239%和0.234%(表 3)。试验全期(1~12周),各组间产蛋率、平均蛋重、平均日采食量和料蛋比无显著差异(P>0.05)。由表 4可知,各组在试验第6周末的蛋壳强度、蛋壳厚度、蛋白高度、蛋黄颜色和哈氏单位均无显著差异(P>0.05);试验第12周末,饲粮添加果寡糖有加深蛋黄颜色的趋势(P=0.088),蛋黄颜色评分随饲粮果寡糖添加量增加呈线性升高(P < 0.05)。
由表 5可知,饲粮添加果寡糖显著提高了蛋鸡表观代谢能和粗蛋白质利用率(P < 0.05),且随果寡糖添加量增加呈二次曲线变化(P < 0.05),其中0.2%果寡糖添加组蛋鸡的表观代谢能和粗蛋白质利用率显著高于对照组(P < 0.05)。各组间干物质和粗脂肪利用率无显著差异(P>0.05)。
由表 6可知,蛋鸡血清TP和GLB含量随饲粮果寡糖添加量的增加呈线性增加(P < 0.05),各组间蛋鸡血清TP、ALB和GLB含量无显著差异(P>0.05)。随着饲粮果寡糖添加量的增加,蛋鸡血清TC、TG和HDL含量呈线性降低(P < 0.05),且0.4%果寡糖添加组和0.6%果寡糖添加组蛋鸡血清TG含量显著低于对照组(P < 0.05)。
由表 7可知,与对照组相比,饲粮添加0.2%果寡糖显著降低了蛋鸡空肠隐窝深度(P < 0.05),显著增加了回肠绒毛高度(P < 0.05);2组间的绒毛高度/隐窝深度值和黏膜上皮杯状细胞数量无显著差异(P>0.05)。
研究表明,果寡糖可提高犊牛[5]、绵羊[12-13]、肉鸡[2, 4]的日增重和蛋鸡产蛋率[21],且能改善犊牛[5]、绵羊[13]、蛋鸡[21]和肉鸡[2-4]的饲料报酬。本试验中,果寡糖的促生产作用主要体现在试验后期(第7~12周),其提高了产蛋后期蛋鸡的产蛋率,改善了料蛋比,这与王明海[21]在蛋鸡上的试验结果类似。果寡糖对动物的促生产表现可能与其维持肠黏膜完整性[2, 19],改善营养素利用率[16]的作用有关。研究发现,果寡糖可改善肠道内环境,促进肠道发育和黏膜增殖,快速修复受损肠黏膜[2],且能提高粗蛋白质的利用率[16],减少能量的损失[12]。本试验中,根据生产性能指标,果寡糖最佳添加量为0.2%,而添加较高剂量则未观察到改善作用。可能的原因是,高水平的果寡糖可通过微生物代谢产生更多有害气体,引发腹泻[17],且内源性微生物对果寡糖发酵过快导致损伤肠黏膜[22],Kim等[23]在肉鸡上的研究也证实了这点。
生产者与消费者均很重视鸡蛋品质。随着蛋鸡周龄的增加,蛋品质下降问题十分突出。目前,尚未见到关于果寡糖针对蛋品质的研究报道。本试验发现,饲粮添加果寡糖一定程度提高了试验第12周末的蛋黄颜色,具体机理尚不清晰,可能与果寡糖干预了脂质代谢[10, 16]有关,进而影响到蛋黄中色素物质的沉积[24]。
3.2 饲粮添加果寡糖对产蛋后期蛋鸡营养素利用率的影响高峰等[7]研究发现,仔猪饲粮添加0.17%果寡糖极显著提高了血液尿素氮含量,表明消化道对饲粮蛋白质分解增强,同时日增重的提高证明动物体的蛋白质合成增强,由此说明果寡糖提高了饲粮粗蛋白质的利用率。另有研究表明,绵羊饲粮中添加大豆寡糖减少了饲粮能量的损失[12]。与之类似,本试验结果显示,饲粮添加果寡糖提高了产蛋后期蛋鸡的表观代谢能和粗蛋白质利用率。肠黏膜结构完整性[25]和消化酶活性是影响营养物质吸收利用的直接因素,果寡糖能促进肠道发育[6],有助于维持肠黏膜的完整性和损伤后的快速修复[2, 15],保障肠道的消化吸收功能;同时,果寡糖可提高肠道的淀粉酶、脂肪酶和各类蛋白酶的活性[3, 9, 19],加快营养物质的分解与利用。通过这2条途径,果寡糖可有效地提高营养物质的利用率。
3.3 饲粮添加果寡糖对产蛋后期蛋鸡血清生化指标的影响本试验期末的血清生化指标结果表明,果寡糖线性提高了血清GLB和TP含量。血清中TP和ALB含量可以反映机体营养状态及蛋白质的吸收和代谢水平[26]。因此,本试验中血清TP含量的提高表明果寡糖影响了产蛋后期蛋鸡机体蛋白质的代谢。GLB是机体内参与免疫反应的蛋白质,反应机体免疫水平。本试验中血清GLB含量的提高可能是由于果寡糖具有一定免疫原性,能增加巨噬细胞活性[27],增强机体非特异性免疫[28]。此外,本试验中,试验组蛋鸡血清TC、TG和HDL含量均低于对照组,说明果寡糖参与了产蛋后期蛋鸡的脂质代谢调控。王国杰等[8]研究报道,在鹌鹑饲粮中添加0.9%的果寡糖,可以显著降低血清TC和蛋黄胆固醇含量。这与邰秀林等[5]的试验结果相一致,他们证明饲粮中添加果寡糖可以显著降低犊牛血清TC含量,且有降低血清TG含量的趋势。果寡糖对脂肪代谢的调控可能与其调节肠道菌群、改善肠道内环境的功能有关。果寡糖可以通过影响肠道有益微生物数量与其代谢产物的量来调节与脂肪代谢有关激素浓度,从而调控脂肪代谢[29];此外,果寡糖可增加肠道双歧杆菌的数量[30],双歧杆菌又通过影响胆固醇合成途径中还原酶的活性,从而降低血清胆固醇含量[31];同时,双歧杆菌和乳酸杆菌对胆汁盐具有同化和共沉积的作用,继而降低肠道内胆酸浓度,一方面增加胆酸和类固醇的粪便排出量[9, 32],另一方面胆酸浓度的降低可抑制肠道内脂肪酶的活性,从而降低饲粮中脂肪的乳化和分解[33]。
3.4 饲粮添加果寡糖对产蛋后期蛋鸡肠道形态结构的影响肠道绒毛高度和隐窝深度可直接反映肠道对营养物质吸收能力,肠绒毛的高度增加代表肠上皮的细胞数量变多,肠道对营养物质吸收能力增强。研究表明,果寡糖有助于维持肠黏膜结构的完整性,促进肠道的发育和黏膜的增殖,同时快速修复受损肠黏膜[2]。占秀安等[4]研究报道,饲粮中添加4 000和6 000 mg/kg果寡糖可显著提高肉鸡盲肠上皮黏膜腺窝高度和细胞密度。也有研究表明肉仔鸡饲粮中添加果寡糖,可提高小肠绒毛高度,降低小肠隐窝深度[6]。在断奶前仔猪上的研究发现,饲粮添加果寡糖能够有效地缓解固体饲粮对空肠、回肠绒毛的机械损害程度[15]。Bielecka等[34]报道,果寡糖能增加鼠的盲肠湿重、盲肠壁重及其内容物重。本试验中,0.2%果寡糖添加组回肠绒毛高度显著提高,空肠隐窝深度显著降低,这与前人研究结果类似。果寡糖在肠道内的降解主要以微生物发酵的方式进行,产物可被肠细胞吸收利用,成为其不断增殖的能源。例如,降解产生的丁酸盐是结肠细胞生长的首选原料,且能通过稳定DNA和修复损伤来促进正常细胞的形成,从而能增加肠黏膜隐窝深度及隐窝内细胞的密度[9, 35];同时果寡糖在肠道内的不断发酵,延长了肠道内容物的滞留时间,促进肠组织逐渐变厚增生、体积增大、肠壁黏膜变薄,增大了肠道与食糜的接触面积,有利于营养物质的吸收。
4 结论① 饲粮添加0.2%的果寡糖能改善产蛋后期蛋鸡肠道形态结构,提高营养素利用率,改善试验后期(第7~12周)的生产性能和蛋品质;随饲粮中果寡糖添加量增加,产蛋后期蛋鸡血清TP和GLB含量线性升高,血清TC、TG和HDL含量线性降低。
② 以试验后期生产性能为主要评价指标,以营养素利用率为辅助评价指标,果寡糖在蛋鸡产蛋后期饲粮中的最适添加量为0.20%~0.25%。
[1] |
BAIN M M, NYS Y, DUNN I C. Increasing persistency in lay and stabilising egg quality in longer laying cycles.What are the challenges?[J]. British Poultry Science, 2016, 57(3): 330-338. DOI:10.1080/00071668.2016.1161727 |
[2] |
XU Z R, HU C H, XIA M S, et al. Effects of dietary fructooligosaccharide on digestive enzyme activities, intestinal microflora and morphology of male broilers[J]. Poultry Science, 2003, 82(6): 1030-1036. DOI:10.1093/ps/82.6.1030 |
[3] |
张厂, 胡先勤, 郭福有, 等. 果寡糖对肉鸡生产性能、肠道菌群、消化酶活性及屠宰性能的影响[J]. 中国家禽, 2007, 29(15): 14-16. DOI:10.3969/j.issn.1004-6364.2007.15.004 |
[4] |
占秀安, 胡彩虹, 许梓荣, 等. 果寡糖对肉鸡生长、肠道菌群和肠形态的影响[J]. 中国兽医学报, 2003, 23(2): 196-198. DOI:10.3969/j.issn.1005-4545.2003.02.030 |
[5] |
邰秀林, 龙翔, 向钊, 等. 低聚果糖对早期断奶犊牛生长性能和血液理化指标及肠黏膜形态的影响[J]. 中国畜牧杂志, 2009, 45(11): 34-38. |
[6] |
易中华, 马秋刚, 张建云, 等. 果寡糖和芽孢杆菌对肉仔鸡肠黏膜形态结构的影响[J]. 当代畜牧, 2008(8): 40-42. |
[7] |
高峰, 周光宏, 韩正康. 寡果糖对雏鸡生产性能、免疫功能和内分泌的影响[J]. 动物营养学报, 2001, 13(2): 51-55. DOI:10.3969/j.issn.1006-267X.2001.02.012 |
[8] |
王国杰, 柯叶艳, 韩正康, 等. 寡果糖对蛋用鹌鹑生产性能、脂肪代谢、免疫和内分泌机能的影响[J]. 畜牧与兽医, 2000, 32(6): 1-2. DOI:10.3969/j.issn.0529-5130.2000.06.001 |
[9] |
胡彩虹, 占秀安, 许梓荣. 果寡糖对肉仔鸡肌肉中胆固醇水平的影响及其机理探讨[J]. 畜牧兽医学报, 2003, 34(4): 349-355. DOI:10.3321/j.issn:0366-6964.2003.04.007 |
[10] |
黄杰河, 于桂阳, 郑春芳. 饲料中添加果寡糖对鹌鹑生产性能与胆固醇含量的影响[J]. 经济动物学报, 2010, 14(1): 35-37. DOI:10.3969/j.issn.1007-7448.2010.01.009 |
[11] |
TAKAHARA S, MOROHASHI T, SANO T, et al. Fructooligosaccharide consumption enhances femoral bone volume and mineral concentrations in rats[J]. The Journal of Nutrition, 2000, 130(7): 1792-1795. DOI:10.1093/jn/130.7.1792 |
[12] |
郭勇庆, 张英杰, 刘月琴, 等. 不同剂量牛蒡果寡糖对绵羊生产性能和氮平衡的影响[J]. 中国农学通报, 2010, 26(3): 15-18. DOI:10.3969/j.issn.1007-7774.2010.03.005 |
[13] |
郭勇庆.牛蒡果寡糖对绵羊生产性能、营养物质消化代谢影响研究[D].硕士学位论文.保定: 河北农业大学, 2010: 14-17. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-11920-2010138719.htm
|
[14] |
肖宇, 程明, 汪文鑫, 等. 外源寡糖对奶山羊免疫机能的影响[J]. 中国兽医学报, 2012, 32(10): 1516-1520. |
[15] |
时祺, 朱伟云, 杭苏琴. 果寡糖对断奶前仔猪粪样中微生物和有机酸浓度的影响[J]. 南京农业大学学报, 2011, 34(6): 121-124. |
[16] |
严文恒.果寡糖与土霉素在育肥猪生产上的比较试验[D].硕士学位论文.延边: 延边大学, 2007: 24-30. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10184-2007183762.htm
|
[17] |
MIKKELSEN L L, KNUDSEN K E B, JENSEN B B. In vitro fermentation of fructo-oligosaccharides and transgalacto-oligosaccharides by adapted and unadapted bacterial populations from the gastrointestinal tract of piglets[J]. Animal Feed Science and Technology, 2004, 116(3/4): 225-238. |
[18] |
XU C L, CHEN X D, JI C, et al. Study of the application of fructooligosaccharides in piglets[J]. Asian-Australasian Journal of Animal Science, 2005, 18(7): 1011-1016. DOI:10.5713/ajas.2005.1011 |
[19] |
XU Z R, ZOU X T, HU C H, et al. Effects of dietary fructooligosaccharide on digestive enzyme activities, intestinal microflora and morphology of growing pigs[J]. Asian-Australasian Journal of Animal Science, 2002, 15(12): 1784-1789. DOI:10.5713/ajas.2002.1784 |
[20] |
张丽英. 饲料分析及饲料质量检测技术[M]. 3版. 北京: 中国农业大学出版社, 2007: 48-104.
|
[21] |
王明海. 果寡糖对蛋鸡产蛋性能及鸡蛋品质的影响[J]. 南京农学专报, 2002, 18(4): 26-28. |
[22] |
TEN BRUGGENCATE S J M, BOVEE-OUDENHOVEN I M J, LETTINK-WISSINK M L G, et al. Dietary fructooligosaccharides increase intestinal permeability in rats[J]. The Journal of Nutrition, 2005, 135(4): 837-842. DOI:10.1093/jn/135.4.837 |
[23] |
KIM G B, SEO Y M, KIM C H, et al. Effect of dietary prebiotic supplementation on the performance, intestinal microflora, and immune response of broilers[J]. Poultry Science, 2011, 90(1): 75-82. DOI:10.3382/ps.2010-00732 |
[24] |
ZAGHINI A, MARTELLI G, RONCADA P, et al. Mannanoligosaccharides and aflatoxin B1 in feed for laying hens:effects on egg quality, aflatoxins B1 and M1 residues in eggs, and aflatoxin B1 levels in liver[J]. Poultry Science, 2005, 84(6): 825-832. DOI:10.1093/ps/84.6.825 |
[25] |
邹杨, 杨占山, 李胜利, 等. 果寡糖作用机理及其在反刍动物上的应用研究[J]. 中国奶牛, 2011(8): 7-10. DOI:10.3969/j.issn.1004-4264.2011.08.003 |
[26] |
马友彪, 周建民, 张海军, 等. 白酒糟酵母培养物对产蛋鸡生产性能、免疫机能和肠黏膜结构的影响[J]. 动物营养学报, 2017, 29(3): 890-897. DOI:10.3969/j.issn.1006-267x.2017.03.020 |
[27] |
KELLY-QUAGLIANA K A, NELSON P D, BUDDINGTON R K, et al. Dietary oligofructose and inulin modulate immune functions in mice[J]. Nutrition Research, 2003, 23(2): 257-267. DOI:10.1016/S0271-5317(02)00516-X |
[28] |
GUIGOZ Y, ROCHAT F, PERRUISSEAU-CARRIER G, et al. Effects of oligosaccharide on the faecal flora and non-specific immune system in elderly people[J]. Nutrition Research, 2002, 22(1/2): 13-25. |
[29] |
SUZUKI Y, KAIZU H, YAMAUCHI Y. Effect of cultured milk on serum cholesterol concentrations in rats which fed high-cholesterol diets[J]. Journal of the Japanese Society of Animal Science, 1991, 62(6): 565-571. |
[30] |
胡彩虹, 王友明. 果寡糖对肥育猪生长及肠道菌群等的影响[J]. 无锡轻工大学学报, 2001, 20(6): 586-572, 577. |
[31] |
傅念.四株双歧杆菌对高脂饮食大鼠肥胖形成的影响及相关机制的研究[D].博士学位论文.长沙: 中南大学, 2008. http://cdmd.cnki.com.cn/article/cdmd-10533-2008164558.htm
|
[32] |
ROBERFROID M B, DELZENNE N M. Dietary fructans[J]. Annual Review of Nutrition, 1998, 18: 117-143. DOI:10.1146/annurev.nutr.18.1.117 |
[33] |
张倩, 王宝维.寡糖在家禽生产中的应用研究进展[J].2009(1): 52-55, 57. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTotal-ZGDB200901018.htm
|
[34] |
BIELECKA M, BIEDRZYCKA E, MAJKOWSKA A, et al. Effect of non-digestible oligosaccharides on gut microecosystem in rats[J]. Food Research International, 2002, 35(2/3): 139-144. |
[35] |
SAKATA T. Stimulatory effect of short-chain fatty acids on epithelial cell proliferation in the rat intestine:a possible explanation for trophic effects of fermentable fibre, gut microbes and luminal trophic factors[J]. British Journal of Nutrition, 1987, 58(1): 95-103. DOI:10.1079/BJN19870073 |