微囊藻是太湖蓝藻水华的主要种群,其大规模暴发严重影响了太湖生态系统,因此控制蓝藻水华是太湖生态系统恢复的重要组成部分。目前,每年从太湖中取出的蓝藻超过12万t。含有微囊藻毒素(microcystin, MC)的蓝藻如果处理不当,可能导致二次污染。因此,蓝藻无害化处理、资源化利用成为治理太湖蓝藻的关键问题。现有的蓝藻资源化利用方法主要是生产沼气和有机肥,但产品附加值不高[1-3]。富含蛋白质的蓝藻是一种新型的植物蛋白质资源,易于转化为氨基酸,在饲料工业中有着广泛的应用价值。蓝藻饲料化利用的最大障碍是微囊藻毒素,即环状多肽(微囊藻毒素-LR、微囊藻毒素-RR等),由于其对肝脏、肾脏等器官具有强烈毒性以及强促癌性,已被认为是严重威胁人类健康的生物污染物并得到广泛关注。目前已有一些关于蓝藻水解产物氨基酸成分的研究[4],也有大量利用小鼠研究微囊藻毒素对人类和动物毒性的报道,如微囊藻毒素对小鼠的毒性评价[5]、肝脏毒性[6]、毒性剂量[7]、诱变性[8]和遗传毒性[9]等,但关于蓝藻酸解产物中微囊藻毒素残留和饲用安全性的研究未见报道。鉴于此,本试验拟研究太湖蓝藻酸解产物的氨基酸种类及含量,对其中可能危害畜禽的微囊藻毒素、重金属含量进行测定,并进行动物急性毒理试验,评价其饲用安全性,以期为蓝藻蛋白质资源的饲料化利用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验用蓝藻取自太湖十八湾藻水分离站。蓝藻干物质中粗蛋白含量为59.46%,粗灰分含量为7.69%,微囊藻毒素-RR含量为50 810 μg/kg,微囊藻毒素-LR含量为32 300 μg/kg。
试验用小鼠购于南京医科大学附属动物医院,体重18~22 g,数量150只(雌雄各占1/2),ICR品系。
1.2 试验方法 1.2.1 蓝藻酸解及毒素降解取蓝藻藻泥(干物质含量为10.11%)10 kg,在50 L密闭发酵罐中进行酸解,酸解时间6~22 h,每间隔2 h作为1个处理,共计9个处理,每个处理3个重复。根据预试验的最佳酸解参数,设置酸解温度为110 ℃,盐酸(12 mol/L)与蓝藻(干物质基础)的质量比为10 : 1。
1.2.2 蓝藻酸解产物中氨基酸组成以及微囊藻毒素和重金属含量分析蓝藻酸解产物中氨基酸组成采用《饲料中氨基酸的测定》(GB/T 18246—2000)[10]所述方法测定,微囊藻毒素含量采用《生活饮用水卫生标准》(GB 5749—2006)[11]所述方法测定,重金属含量采用电感耦合等离子体发射光谱(ICP-AES)法[12]测定。蓝藻的酸解度以质量分数(%)表示,按下式计算:
式中:m为酸解液中氨基酸总量(g);n为100 g蓝藻干物质中粗蛋白质的量(g)。
1.2.3 小鼠急性毒性试验参照《急性毒性试验》(GB 15193.3—2003)[13]进行急性毒性试验。选取健康无病、体重18~22 g ICR品系清洁级小鼠50只,随机分为5个组,每组10只(雌雄各占1/2)。根据小鼠喂食酸解14 h的蓝藻酸解产物的预试验结果[小鼠的半数致死剂量(LD50)约为9.96 g/kg BW],并依据霍恩氏法各剂量组的间距按等比级数安排,设为4个剂量组和1个对照组,4个剂量组酸解14 h的蓝藻酸解产物灌胃剂量分别为2.15(剂量1组)、4.64(剂量2组)、10.00(剂量3组)和21.50 g/kg BW(剂量4组),对照组灌胃0.9%生理盐水,蓝藻酸解产物以0.9%生理盐水溶解,各组灌胃量均为0.2 mL/只。
试验期为14 d,将试验中小鼠死亡率与霍恩氏法LD50查询附录表进行对照,推算出蓝藻酸解产物的LD50,根据急性毒性剂量分级表判别蓝藻酸解14 h产物的毒性级别。
1.2.4 小鼠骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核试验选取健康无病、体重18~22 g ICR品系清洁级小鼠50只,随机分为5个组,每组10只(雌雄各占1/2)。设10 000、5 000和2 500 mg/kg BW蓝藻酸解产物(酸解14 h)3个剂量组以及阴性对照组(无菌水)、阳性对照组(环磷酰胺40 mg/kg BW)。受试样品用无菌水配制,高、中、低剂量组受试样品浓度分别为500、250和125 mg/mL,以20 mL/kg BW灌胃。采用30 h给受试物法[14],2次给受试样品间隔24 h,第2次给受试样品6 h后处死小鼠。取胸骨常规制片、固定、染色、镜检,每只小鼠计数5 000个PCE,观察含微核的PCE数并计算微核率,以千分率计。
选取健康无病、体重18~22 g ICR品系清洁级小鼠50只,随机分为5个组,每组10只(雌雄各占1/2)。分组方法、受试样品以及采用的灌胃剂量和方法同1.2.4,每天1次,连续5 d,每只小鼠计数1 000个结构完整的精子[15]。
1.3 数据统计与分析采用SPSS 16.0软件对小鼠骨髓PCE微核率、PCE/红细胞(RBC)、小鼠精子畸形率数据进行多重比较,数据与平均值±标准差(mean±SD)表示。
2 结果与分析 2.1 蓝藻酸解产物的氨基酸组成及残留的微囊藻毒素和重金属含量 2.1.1 不同酸解时间蓝藻酸解产物的氨基酸组成与含量蓝藻经不同时间酸解,产物中氨基酸总量及各种氨基酸含量存在差异(表 1),即时间因素对蓝藻酸解产物的氨基酸组成和含量有很大影响。蓝藻酸解14 h时,产物中氨基酸总量最高,为52.63%,畜禽生长和发育不同阶段的必需氨基酸,如赖氨酸、蛋氨酸、缬胺酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、精氨酸、甘氨酸、苏氨酸、组氨酸、半胱氨酸的总量为30.25%,占氨基酸总量的57.48%。随着酸解时间的延长,蓝藻的酸解度先增大后减小,在14 h时达到最大值,为88.51%(图 1)。精氨酸、苏氨酸、赖氨酸、蛋氨酸通常作为饲料添加剂,随着蓝藻酸解时间的延长,其含量逐渐增加(图 1),酸解14 h时上述4种氨基酸的总量为10.4%,占氨基酸总量的19.76%。虽然精氨酸在酸解16 h时达到最大产量,但当酸解时间超过14 h后,4种氨基酸的总量呈下降趋势。
酸解前蓝藻中微囊藻毒素-RR和微囊藻毒素-LR含量分别为50 810和32 300 μg/kg(表 2)。酸解可以强烈降解微囊藻毒素,且酸解时间越长,微囊藻毒素残留量越低。当酸解18 h时,蓝藻酸解产物中微囊藻毒素-RR和微囊藻毒素-LR的含量分别为0.90和0.94 μg/kg,其残留量低于我国《生活饮用水卫生标准》[11]规定的饮用水微囊藻毒素-LR限量标准(1.0 μg/L),去除率都达到了99.99%。
蓝藻酸解产物(酸解14 h)中重金属砷(As)、铅(Pb)、汞(Hg)、铬(Cr)的含量均远低于相关国家标准的限量(表 3),因此,从重金属角度来看,蓝藻酸解产物作为饲料利用是安全的。
由表 4可知,小鼠急性毒性试验中雄性小鼠与雌性小鼠死亡率相同,即小鼠死亡率没有性别差异。对照组、剂量1组、剂量2组、剂量3组、剂量4组小鼠死亡率分别为0、20%、20%和100%。
由霍恩氏法LD50查询附录表可知,剂量1组(死亡率为20%)、剂量2组(死亡率为20%)与剂量4组(死亡率为100%)都不变的情况下,随着剂量3组死亡率的不断增加(由40%升到80%),LD50呈现不断减小趋势(由9.09 g/kg BW降到6.19 g/kg BW)。本试验所测剂量3组死亡率为20%,小于40%,按照霍恩氏法LD50查询附录表规律可知,其LD50 > 9.09 g/kg BW,即 > 9 090 mg/kg BW。
由试验测得的LD50 > 9 090 mg/kg BW可知,酸解14 h的蓝藻酸解产物属于小鼠一次经口急性毒理分级标准中的5 001~15 000 mg/kg BW范畴,可推知本研究中蓝藻酸解产物属于实际无毒的毒性级别。
2.3 蓝藻酸解产物对小鼠骨髓PCE微核率的影响由表 5可知,蓝藻酸解产物各剂量组正常成熟红细胞的微核率与阴性对照组差异不显著(P > 0.05),各剂量组之间也未呈现良好的剂量-反应关系。同一剂量下,雌性、雄性小鼠微核率差异不显著(P > 0.05)。上述结果表明,在测试浓度下,蓝藻酸解产物并未显著增加小鼠骨髓嗜多染红细胞的微核率。
微核试验检测结果显示阴性,即本研究中未见蓝藻酸解产物对小鼠骨髓PCE微核形成及PCE/RBC产生影响。
2.4 蓝藻酸解产物对小鼠精子致畸性由表 6可知,3个剂量组的小鼠精子中,各种畸形类型的比例都与阴性对照组非常接近,无定和无钩类型占大部分。各剂量组小鼠精子畸形率与阴性对照组相比差异不显著(P > 0.05),各剂量组之间小鼠精子畸形率差异也不显著(P > 0.05),但各剂量组以及阴性对照组的精子畸形率则极显著低于阳性对照组(P < 0.01)。精子畸形试验检测结果显示为阴性,表明蓝藻酸解产物对小鼠精子畸形率无显著影响,对小鼠精子无致畸形性。
氨基酸是畜禽饲粮中使用的营养强化剂之一,对改善饲粮的营养水平和提高生物效价有重要意义。蓝藻酸解产物氨基酸含量丰富,氨基酸总量可达50%以上,赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸含量与豆粕相当或高于豆粕,特别是苏氨酸,其含量较豆粕高近50%。前期、中期和后期肉用仔鸡对配合饲料中赖氨酸的需求量分别为1.00%、1.15%和0.87%,蛋氨酸需求量分别为0.50%、0.40%和0.34%,蛋氨酸与半胱氨酸总和需求量分别为0.91%、0.76%和0.65%[16],而蓝藻酸解产物中赖氨酸含量为3.02%,蛋氨酸含量为0.99%,蛋氨酸与半胱氨酸含量总和为1.98%,均大于肉仔鸡配合饲料标准中不同生长阶段的需求量,表明本研究中的蓝藻酸解产物具有较高的营养性,可作为优质的蛋白质饲料。Unger等[17]报道,动物对精氨酸、蛋氨酸和赖氨酸3者的营养需要是相互关联的。本试验蓝藻酸解产物中精氨酸含量较高,且畜禽易缺乏而常添加的赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸含量较高,同时精氨酸与赖氨酸含量的比值为1.12,这与Van Nguyen等[18]报道的饲粮中精氨酸与赖氨酸的比值为1.1时效果最好的结果相近。本试验只是蓝藻酸解产物的氨基酸组成进行了探讨,至于其营养性,有待进一步研究。
3.2 蓝藻酸解产物的微囊藻毒素、重金属残留和饲用安全性蓝藻酸解产物作为饲料利用,人们最担心的是微囊藻毒素残留问题。在迄今鉴定的80多种微囊藻毒素中,微囊藻毒素-LR是最常见和毒性最大的同类物。目前,在微囊藻毒素限量方面,世界卫生组织(WHO)和中国都制定了饮用水中微囊藻毒素-LR的限量标准(1.0 μg/L)[11],而没有饲料中微囊藻毒素的限量标准。本试验结果表明,蓝藻经18 h酸解后,微囊藻毒素-LR的含量小于1 μg/kg,低于饮用水限量标准。因此,在考虑微囊藻毒素充分降解时,以18 h作为酸解时间最好。虽然酸解14 h产物中微囊藻毒素-LR、微囊藻毒素-RR的含量高于饮用水限量标准,但是根据小鼠LD50、小鼠骨髓PCE微核率、小鼠精子致畸性结果可知,蓝藻经14 h酸解后其产物已达无毒级别且氨基酸总量最高,因此在生产上可以采用14 h酸解。虽然蓝藻酸解产物的微囊藻毒素含量达到无毒要求,但作为动物饲料还应考虑微囊藻毒素-LR总量的控制问题。由于没有关于饲料中微囊藻毒素含量以及动物每日可允许摄取量的研究,因此只能根据WHO规定的人体每日可允许摄入的微囊藻毒素-LR量(≤0.04 μg/kg BW)的标准[19]进行推算:畜禽每日可允许摄入蓝藻酸解14 h产物20 g/kg BW,可摄入蓝藻酸解18 h产物42.5 g/kg BW,由于蓝藻酸解物作为畜禽蛋白质饲料的添加量一般不会超过30%,因此饲料中微囊藻毒素-LR的总量远低于限量标准。同样方法推算,蓝藻酸解产物作为鸡、鱼等饲料原料时,其微囊藻毒素-LR总量同样是安全的。此外,人们还会担心重金属残留问题,蓝藻中重金属和环境区域有关,本研究中的蓝藻原料来自太湖十八湾,其酸解产物中重金属含量都低于饲料中重金属限量,至于其他湖区或其他湖泊蓝藻作为饲料利用,其重金属含量有待进一步研究。
4 结论蓝藻酸解14 h产物的氨基酸总量超50%且畜禽易缺乏而常添加的赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸含量较高;蓝藻经酸解14 h以上,产物中微囊藻毒素-LR含量接近饮用水限量标准,经急性毒理评价为无毒、无致突变性和精子致畸性。取样区域内蓝藻酸解14 h产物中重金属砷、铅、汞、铬的含量均远低于相关国家标准的限量。因此,蓝藻蛋白质资源饲料化利用具有可行性,但需要进一步研究其慢性毒理和营养性。
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