动物营养学报    2019, Vol. 31 Issue (5): 2088-2097    PDF    
合生素替代抗生素对断奶仔猪生长性能、肠道黏膜形态与免疫性能及结肠微生态的影响
温晓鹿 , 王丽 , 杨雪芬 , 高开国 , 蒋宗勇 , 胡友军     
广东省农业科学院动物科学研究所, 畜禽育种国家重点实验室, 农业部华南动物营养与饲料重点实验室, 广东省动物育种与营养公共实验室, 广东省畜禽育种与营养研究重点实验室, 广州 510640
摘要: 本试验旨在研究合生素替代抗生素对断奶仔猪生长性能、肠道黏膜形态、空肠黏膜免疫因子含量和结肠内容物微生物组成的影响。选取72头21日龄的健康杜×长×大三元杂阉公猪,按体重分为3组,每组6个重复,每个重复4头仔猪。抗生素组饲喂添加抗生素的饲粮,试验组分别添加500(0.05%)、1 000 mg/kg(0.10%)的合生素替代抗生素。试验期为28 d,分为2个阶段(第1~14天和第15~28天)。结果表明:1)各组间不同阶段的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F/G)和腹泻频率均没有显著差异(P>0.05),但0.05%合生素组第1~14天的平均日增重与抗生素组相比有提高的趋势(P=0.07)。2)0.05%、0.10%合生素组空肠绒毛高度显著高于抗生素组(P < 0.05);十二指肠、空肠、回肠隐窝深度各组之间无显著差异(P>0.05)。3)0.05%、0.10%合生素组空肠黏膜中白细胞介素-4(IL-4)的含量显著高于抗生素组(P < 0.05);空肠黏膜中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(INF-γ)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)的含量各组之间无显著差异(P>0.05)。4)与抗生素组相比,0.05%合生素组结肠内容物中乳酸杆菌和双歧杆菌的数量显著增加(P < 0.05),0.10%合生素组结肠内容物中双歧杆菌的数量显著增加(P < 0.05);结肠内容物中总细菌和大肠杆菌的数量各组之间无显著差异(P>0.05)。由此可见,饲粮中添加合生素替代抗生素不会降低断奶仔猪的生长性能,还可控制腹泻,提高空肠绒毛高度和免疫性能,维持肠道微生态平衡,其适宜添加量为0.05%。
关键词: 合生素    断奶仔猪    生长性能    肠道黏膜免疫    肠道黏膜形态    肠道微生态    
Effects of Synbiotics Substitution of Antibiotics on Growth Performance, Intestinal Mucosal Morphology, Immune Performance and Colonic Microbial Ecosystem of Weaned Piglets
WEN Xiaolu , WANG Li , YANG Xuefen , GAO Kaiguo , JIANG Zongyong , HU Youjun     
Guangdong Key Laboratory of Animal Breeding and Nutrition, Guangdong Public Laboratory of Animal Breeding and Nutrition, State Key Laboratory of Livestock and Poultry Breeding, Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science in South China of Ministry of Agriculture, Institute of Animal Science, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China
Abstract: The present study was conducted to investigate the effects of synbiotics substitution of antibiotics on growth performance, intestinal mucosal morphology, jejunal mucosal immune immunological cytokine contents and colon contents microbial composition of weaned piglets. A total of 72 Duroc×Landrace×Yorkshire weaned piglets were allotted randomly to 3 groups with 6 replicates and 4 piglets per replicate. The groups consisted of antibiotic group received diet supplemental antibiotics, and experiment groups were fed the diet supplemented with 500 (0.05%) and 1 000 mg/kg (0.10%) synbiotics, respectively. The whole trial lasted for 28 days, which was divided into two stages (days 1 to 14 and days 15 to 28). The results showed as follows: 1) there were no significant differences in average daily weight gain (ADG), average daily feed intake (ADFI), feed/gain (F/G) and diarrhea frequency in each stage among all groups (P>0.05), but there was an increase trend for ADG on days 1 to 14 of piglets in 0.05% synbiotics group compared with antibiotic group (P=0.07). 2) The villus height of jejunum in 0.05% and 0.10% synbiotics groups was significantly higher than that in antibiotic group (P < 0.05), but there was no significant difference in crypt depth of duodenum, jejunum and ileum among all groups (P>0.05). 3) Compared with antibiotic group, the interleukin-4 (IL-4) content in jejunum mucosa of piglets in 0.05% and 0.10% synbiotics groups was significantly increased (P < 0.05). The contents of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interferon-γ (INF-γ), interleukin-1β (IL-1β) and interleukin-6 (IL-6) in jejunum mucosa of piglets were not significantly different among all groups (P>0.05). 4) Compared with antibiotic group, the populations of Lactobacilli and Bifidobacterium in colonic contents of piglets in 0.05% synbiotics group were significantly increased (P < 0.05), the population of Bifidobacterium in colonic contents of piglets in 0.10% synbiotics group was significantly increased (P < 0.05). There were no significant differences in the populations of total bacteria and Escherichia coli in colonic contents of piglets among all groups (P>0.05). In conclusion, dietary synbiotics substitution of antibiotic not only does not decrease the growth performance of piglets, but also can control the diarrhea, increase the jejunal villus height, improve the immunity performance, and maintain the intestinal microbial ecosystem balance; the suitable dosage is 0.05%.
Key words: synbiotics    weaned piglets    growth performance    intestinal mucosal immune    intestinal mucosal morphology    intestinal microbial ecosystem    

仔猪断奶后由于受到饲粮、环境和心理等多种因素改变的影响,易发生肠道免疫系统功能性紊乱[1]。断奶应激会破坏仔猪肠道微生态平衡,导致肠道屏障功能障碍,从而使仔猪生长停滞,严重危害仔猪健康[2-3]。虽然抗生素可以有效缓解仔猪断奶应激引发的腹泻,提高仔猪的生长性能,但由于近年来抗生素的耐药性以及抗生素残留问题越来越受到社会的重视,寻找合适的抗生素替代品是畜牧业发展亟待解决的问题。合生素又称合生元,是指益生菌(probiotics)与益生元(prebiotics)结合使用的生物制剂,其特点是同时发挥益生菌和益生元的作用,通过促进外源性活菌在动物肠道中定植,改善动物肠道菌群的组成,调节消化道微环境,提高免疫能力,从而达到改善宿主健康的目的[4-5]。本试验旨在研究饲粮中添加由低聚果糖和复合益生菌制成的合生素替代抗生素对断奶仔猪生长性能、肠道黏膜形态、空肠黏膜免疫因子含量和结肠内容物微生物组成的影响。

1 材料与方法 1.1 试验设计

试验选取72头体重相近的21日龄杜×长×大三元杂交断奶仔猪,按体重分成3组,分别为抗生素组、0.05%合生素组、0.10%合生素组,每组6个重复,每个重复4头仔猪。每个重复的仔猪饲养在同一栏内。试验期为28 d,分为2个阶段(第1~14天和第15~28天)。基础饲粮营养水平参考我国《猪饲养标准》(NY/T 65—2004)中5~10 kg、10~20 kg断奶仔猪营养需要量设定,其组成及营养水平见表 1。各组分别饲喂在基础饲粮基础上添加抗生素或合生素的饲粮。各组饲粮营养水平一致。其中,抗生素组第1~14天饲粮中添加20 mg/kg硫酸抗敌素、70 mg/kg金霉素、30 mg/kg杆菌肽锌,第15~28天饲粮中添加50 mg/kg效高素;0.05%合生素组第1~14天和第15~28天饲粮中均添加500 mg/kg(0.05%)合生素;0.10%合生素组第1~14天和第15~28天饲粮中均添加1 000 mg/kg(0.10%)合生素。合生素由纳豆芽孢杆菌(1×109 CFU/g)、灭火干酪乳酸杆菌(1×108个/g)和低聚果糖(10%)组成。

表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis)
1.2 饲养管理与样品采集

试验期间仔猪自由采食、饮水,每天分别于08:00与16:00各饲喂1次。试验第29天称重结束后每个重复选取1头与平均体重相近的仔猪颈静脉采集抗凝血10 mL,3 000 r/min、4 ℃离心10 min后分装血浆,-80 ℃保存。采血后的仔猪颈静脉注射戊巴比妥钠溶液麻醉后屠宰。取仔猪的空肠中段肠段、结肠中段内容物放入EP管并转移到液氮迅速冷冻,之后转移到-80 ℃保存;然后取十二指肠、空肠中段以及回肠末端各取2 cm肠段经磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗后,放入4%的中性甲醛进行固定。

1.3 指标检测 1.3.1 生长性能

试验期间准确记录每天每栏的采食量,并分别在试验第1、15、29天早上对仔猪进行空腹称重,计算试验第1~14天、第15~28天、第1~28天的平均日增重、平均日采食量和料重比。

1.3.2 腹泻评分

粪便评分和腹泻频率参照谢全喜等[6]方法:每天早上和下午喂料前,观察仔猪粪便,对仔猪粪便进行评分,2分、3分记为腹泻。评分依据见表 2,以栏为单位统计仔猪腹泻频率。

表 2 粪便评分标准 Table 2 Fecal score standard
1.3.3 肠道黏膜形态

将固定好的肠段进行石蜡包埋,切片厚度6 μm,然后苏木精-伊红(HE)染色,采用ScionImage图像分析处理系统拍照,每个样品观察3张不连续的切片,每个样品测量10个绒毛高度和隐窝深度,取平均值,并计算绒毛高度/隐窝深度(V/C)。

1.3.4 空肠黏膜免疫细胞因子含量

空肠黏膜细胞免疫因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(INF-γ)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-6(IL-6)的含量采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定,测定试剂盒购自上海联硕生物科技有限公司,具体操作方法见试剂盒说明书。

1.3.5 结肠内容物微生物组成

采用实时荧光定量PCR法检测结肠内容物中微生物组成,具体操作参考焦金真等[7]的方法。采用QIAamp® DNA Stool Handbook试剂盒提取结肠内容物总细菌DNA,用ND-1000核酸和蛋白质分析仪检测DNA的浓度,再经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测其纯度。

将提取的总细菌DNA分别和不同浓度总细菌、大肠杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌标准质粒进行定量PCR检测,将标准质粒浓度和Ct值做回归分析,绘制标准曲线。然后将样品Ct值带入回归方程计算得到目标菌属DNA拷贝数,结果用每克内容物中细菌拷贝数的常用对数表示lg(拷贝数/g)。PCR所用引物见表 3

表 3 细菌的特异性引物序列 Table 3 Specific primer sequences for bacteria
1.4 数据统计与分析

试验数据采用Excel 2010进行整理,采用SAS 8.1软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),并采用Duncan氏法进行多重比较,P<0.05时为差异显著。结果以平均值±标准误表示。

2 结果与分析 2.1 合生素替代抗生素对断奶仔猪生长性能的影响

表 4可知,与抗生素组相比,饲粮中添加0.05%和0.10%的合生素替代抗生素对断奶仔猪第1~14天、第15~28天和全期(第1~28天)的平均日增重、平均日采食量和料重比均没有显著影响(P>0.05),但添加0.05%合生素有提高仔猪第1~14天平均日增重的趋势(P=0.07)。0.05%和0.10%合生素组之间各生长性能指标均没有显著差异(P>0.05)。

表 4 合生素替代抗生素对断奶仔猪生长性能的影响 Table 4 Effects of synbiotics substitution of antibiotics on growth performance of weaned piglets
2.2 合生素替代抗生素对断奶仔猪腹泻的影响

表 5可知,与抗生素组相比,饲粮中添加0.05%和0.10%合生素替代抗生素对断奶仔猪各阶段的腹泻频率和粪便评分均没有显著影响(P>0.05)。

表 5 合生素替代抗生素对断奶仔猪粪便评分和腹泻频率的影响 Table 5 Effects of synbiotics substitution of antibiotics on fecal score and diarrhea frequency of weaned piglets
2.3 合生素替代抗生素对断奶仔猪肠道黏膜形态的影响

表 6可知,与抗生素组相比,0.05%合生素组、0.10%合生素组空肠绒毛高度显著提高(P<0.05),0.05%合生素组空肠绒毛高度/隐窝深度显著提高(P<0.05)。各组间十二指肠、回肠的绒毛高度、隐窝深度、绒毛高度/隐窝深度没有显著差异(P>0.05)。

表 6 合生素替代抗生素对断奶仔猪肠道黏膜形态的影响 Table 6 Effects of synbiotics substitution of antibiotics on intestinal mucosa morphology of weaned piglets
2.4 合生素替代抗生素对断奶仔猪空肠黏膜免疫细胞因子含量的影响

表 7可知,0.05%合生素组和0.10%合生素组空肠黏膜中IL-4的含量显著高于抗生素组(P<0.05);饲粮中添加0.05%或0.10%的合生素替代抗生素对断奶仔猪空肠黏膜免疫细胞因子TNF-α、INF-γ、IL-1β、IL-6的含量均没有显著影响(P>0.05)。

表 7 合生素替代抗生素对断奶仔猪空肠黏膜细胞免疫因子含量的影响 Table 7 Effects of synbiotics substitution of antibiotics on immunological cytokine contents in jejunum mucosa of weaned piglets
2.5 合生素替代抗生素对断奶仔猪结肠内容物微生物组成的影响

表 8可知,0.05%合生素组和0.10%合生素组结肠内容物中双歧杆菌的数量显著高于抗生素组(P<0.05),0.05%合生素组结肠内容物中乳酸杆菌数量显著高于抗生素组(P<0.05);各组之间结肠内容物中总细菌和大肠杆菌数量没有显著差异(P>0.05)。

表 8 合生素替代抗生素对断奶仔猪结肠内容物微生物组成的影响 Table 8 Effects of synbiotics substitution of antibiotics on microbial composition in colonic contents of weaned piglets
3 讨论 3.1 合生素替代抗生素对断奶仔猪生长性能和腹泻的影响

随着农业部对抗生素禁用速度的加快,各大养殖和饲料企业均在试图寻找抗生素的替代产品。合生素是益生元跟益生菌的组合,其特点是能同时发挥两者的益生作用。研究表明饲粮添加合生素可显著改善断奶仔猪的生长性能,降低腹泻频率,替代抗生素后能起到较好的效果[4, 8]。Liang等[9]在断奶仔猪饲粮中添加合生素(由低聚木糖、低聚壳聚糖、枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌组成)替代硫酸黏菌素后断奶仔猪的生长性能没有发生显著变化。张仕安等[10]报道添加0.05%的合生素显著提高仔猪的日增重,降低仔猪的腹泻率和粪便评分,从而提高养殖的经济效益,其他研究也有类似报道[11-15]。本研究中,饲粮中添加0.05%和0.10%的合生素替代抗生素后,对断奶仔猪全期的生长性能和腹泻频率均没显著影响,表明0.05%和0.10%的合生素均可达到抗生素的应用效果,保证断奶仔猪正常生长、控制腹泻。这可能与合生素中干酪乳杆菌、纳豆芽孢杆菌和低聚果糖的互作有关。低聚果糖和乳酸菌可促进肠道中有益菌的生长,改善仔猪的肠道形态,促进仔猪的免疫发育,从而缓解仔猪的断奶应激,提高生长性能[16-17]。纳豆芽孢杆菌在生长的过程中能分泌蛋白酶,可改善肠道环境,促进营养物质吸收[18]。从试验数据看,0.10%合生素的效果略低于0.05%合生素,可能是由于益生菌浓度过高消耗饲粮中的营养成分,降低了饲粮的利用效率。

3.2 合生素替代抗生素对断奶仔猪肠道黏膜形态的影响

小肠是动物消化吸收营养物质的主要部位,营养物质主要被小肠绒毛吸收,小肠绒毛形态结构的完整程度体现了动物肠道健康状况[19-20]。良好的绒毛可以很大程度上提高营养物质吸收的表面积,促进小肠消化吸收[21]。断奶应激会破坏仔猪小肠绒毛结构的完整性,降低营养物质的消化率,导致仔猪腹泻,降低生长性能。有研究报道,果寡糖和复合微生态制剂替代金霉素能有效提高断奶仔猪十二指肠、空肠的绒毛高度以及绒毛高度/隐窝深度,降低肠道pH,促进营养物质的消化吸收[22];乳果糖和植物乳杆菌组成的合生素显著提高了仔猪回肠绒毛高度/隐窝深度[23]。也有研究发现低聚果糖降低仔猪盲肠的隐窝深度[24]。此外,低聚果糖在改善生长肥育猪肠道黏膜形态上也有一定效果[25-26]。本试验中,饲粮中添加0.05%和0.10%的合生素替代抗生素均显著提高了仔猪空肠绒毛高度,且0.05%合生素组绒毛高度/隐窝深度较抗生素组显著提高,与上述研究结果相似,表明合生素有利于改善仔猪肠道黏膜形态,效果优于抗生素。这可能是因为合生素中的低聚果糖通过提高仔猪肠道内容物中挥发性脂肪酸的浓度改善了肠道黏膜形态,挥发性脂肪酸特别是丁酸能促进肠道上皮细胞的分裂增殖[27-28]。乳酸杆菌通过吸附于肠道内壁防止大肠杆菌分泌的肠毒素对肠绒毛造成破坏[29]。0.10%合生素组各肠段绒毛高度/隐窝深度低于0.05%合生素组的原因可能是外来菌浓度太高,打破了原有的微生态平衡,在维持肠道黏膜形态上没有低浓度的合生素效果好。

3.3 合生素替代抗生素对断奶仔猪空肠黏膜免疫因子含量的影响

肠道不仅是消化吸收营养物质的器官,还是体内最大的免疫器官。肠道黏膜免疫系统包括弥散免疫细胞和肠淋巴组织,其分泌各种免疫细胞因子维持肠道稳态[30]。IL-1β、IL-6和TNF-α是促炎性细胞因子,其在炎症过程中起到促发炎症的作用[31-32]。促炎性细胞因子与病原菌诱导的紧密连接蛋白的改变相关,过量表达损伤肠道屏障功能及完整性,导致仔猪腹泻[33]。IL-4可激活静止期的B细胞,在激活局部及全身抗体应答中起关键作用[34]。INF-γ能够通过促进IL-2生成,进而发挥其黏膜免疫的功能。Dong等[35]报道,在断奶仔猪饲粮中添加纳豆芽孢杆菌显著提高血浆中球蛋白的含量,增强免疫性能。Le Bourgot等[36]研究发现,在母猪饲粮中添加低聚果糖能显著提高仔猪回肠中INF-γ和IL-4的表达。本研究结果表明,饲粮中添加0.05%和0.10%的合生素替代抗生素均显著提高了断奶仔猪空肠黏膜中IL-4的含量,提示合生素可以增强断奶仔猪的免疫性能。这可能与肠道中短链脂肪酸和乳酸杆菌有关[37],肠黏膜免疫细胞因子受肠道微生物和其发酵能力的影响,丁酸促进淋巴细胞分泌IL-4、IL-10[38-40]

3.4 合生素替代抗生素对断奶仔猪结肠内容物微生物组成的影响

健康仔猪肠道中有益菌和有害菌处在一个动态平衡状态,断奶应激会导致仔猪肠道微生态失衡,大肠杆菌等致病菌数量增加,有益菌数量减少,造成仔猪腹泻。乳酸杆菌和双歧杆菌是仔猪肠道中的优势菌群,对维持肠道微生态平衡起到关键作用。Shim等[16]研究报道,断奶仔猪饲粮添加低聚果糖、益生菌或两者组成的合生素均能降低仔猪结肠中大肠杆菌的数量,增加结肠、回肠中双歧杆菌的数量。金燕飞[41]研究发现,纳豆芽孢杆菌能一定程度上抑制仔猪肠道中大肠杆菌的生长,促进双歧杆菌和乳酸杆菌的生长。李丽等[4]研究显示,饲粮中添加合生素(由地衣芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、低聚木糖和甘露寡糖组成)显著降低了断奶仔猪盲肠中大肠杆菌的数量,提高了乳酸杆菌的数量。本研究表明,饲粮中添加0.05%和0.10%的合生素替代抗生素均显著提高结肠内容物中双歧杆菌和乳酸杆菌的数量,0.05%和0.10%合生素组之间没有显著差异,与以上的研究结果一致,这可能是因为合生素中的乳酸杆菌和果糖促进了双歧杆菌和乳酸杆菌的生长[42]。低聚果糖为非消化类多糖,在小肠中不能被动物消化吸收,到达大肠后可被双歧杆菌、乳酸杆菌选择性利用,而不能被肠杆菌和真菌利用[43];纳豆芽孢杆菌可以消耗肠道中的氧气促进厌氧菌的生长,抑制需氧菌的生长,同时还可以分泌纳豆激酶抑制肠道腐败菌的生长[26]

4 结论

本试验条件下,饲粮中添加合生素替代抗生素对断奶仔猪的生长性能没有显著影响,并能有效控制腹泻,提高肠道黏膜免疫性能,改善空肠黏膜形态,提高结肠内容物中双歧杆菌和乳酸杆菌的数量。合生素可有效替代抗生素应用于断奶仔猪饲粮,其适宜的添加量为0.05%。

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