2. 农业部华南水产与畜禽饲料重点实验室, 湛江 524074
2. Key Laboratory of Aquatic, Livestock and Poultry Feed Science and Technology in South China, Ministry of Agriculture, Zhanjiang 524074, China
鱼粉因其蛋白质含量高、含有多种必需氨基酸、容易被吸收等多种优点,目前是水产饲料中主要的蛋白质源。自我国水产饲料行业兴起以来,鱼粉的使用量逐年增加[1]。水产养殖业的快速发展与鱼粉资源的缩减造成鱼粉价格飙升,饲料成本大大增加。一般对虾饲料中鱼粉的用量不低于20%,在配合饲料中降低鱼粉用量后,养殖对虾会出现生长缓慢、抗病力低下等问题[2-3]。因此,寻求在低鱼粉条件下可提高对虾的生长和非特异性免疫力的抗生素替代品成为近年来对虾营养研究的热点[4-5]。
凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)具有生长速度快、盐度适应广、高投入高回报等优点,自引入我国以来养殖规模迅速扩大,现养殖产量已居对虾类第1位[6]。近年来频频发生的病害给对虾养殖产业造成相当大的经济损失,严重阻碍对虾养殖产业发展,主要原因在于养殖密度过大[6]、抗生素的大量使用[7]等。寻找有效的病害防治措施,以期降低损失,提高养殖成功率,并实现降抗甚至是无抗养殖,是目前对虾养殖中亟待解决的关键瓶颈问题。益生菌是指在一定范围内可通过抑制有害微生物生长、补充养分、刺激免疫系统来增进宿主健康的活体微生物制剂[6, 8],益生菌具有无毒副作用、无残留、促进动物生长、提高饲料转化率等诸多优点,是抗生素的良好替代品。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为革兰氏阳性菌,是一类好氧型细菌,具有耐高温、耐胆盐、耐酸性等特性,在极端环境下会产生内源性孢子,在饲料制粒之后也能保持极高的存活率[9-10]。枯草芽孢杆菌在机体内消耗氧气,释放丙酸、乙酸,丁酸等,可创造一个厌氧微酸环境,促进有益厌氧菌生长,抑制有害菌生长,调节肠道微生态平衡,增强抗毒、抗病能力,还可以产生多种消化酶如淀粉酶、蛋白酶等促进饲料降解,提高饲料利用率[10-11]。近几年,枯草芽孢杆菌在水产动物养殖上的应用研究已成为热点。丁贤等[12]、于明超等[13]、Tseng等[14]、Liu等[15]已经证实饲料中添加枯草芽孢杆菌可促进凡纳滨对虾的生长并可机体内提高非特异性免疫酶活性。
目前,枯草芽孢杆菌对凡纳滨对虾影响的研究大多仅限于考察对其生长和饲料利用的影响,而对于枯草芽孢杆菌在低鱼粉饲料条件下对凡纳滨对虾非特异性免疫酶活性与mRNA表达影响的研究则较少。因此,本试验拟在低鱼粉饲料中添加不同比例的枯草芽孢杆菌,探讨其对凡纳滨对虾幼虾生长性能、非特异性免疫酶活性、肝胰腺非特异性免疫酶mRNA表达及抗病力的影响,为枯草芽孢杆菌在低鱼粉饲料中的应用提供理论基础和技术支撑。
1 材料与方法 1.1 饲料配制以红鱼粉、豆粕、花生粕作为配方中的主要蛋白质源,鱼油、大豆油、大豆卵磷脂作为配方中的主要脂肪源,配制鱼粉含量为10%的低鱼粉饲料,其组成及营养水平见表 1。在低鱼粉饲料中分别添加0、0.10%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%和1.25%的枯草芽孢杆菌。试验用枯草芽孢杆菌菌种来源于广东省微生物菌种保藏中心(GIM:1.222),通过复苏扩配成活菌数为1.0×108 CFU/mL的菌液,在加水搅拌环节溶于水中按照试验设计的添加量添加于低鱼粉饲料中。饲料原料经粉碎处理后按配方准确称取使用量。其中,大宗原料先于V型混合机中混合10 min,微量元素等通过逐级扩大法混合均匀,然后以双螺杆挤条机(F-26华南理工大学,广州)加工成直径为1.5 mm的成品料,在烘箱(60 ℃)中静置30 min,风干后分装放于-20 ℃冰箱备用。
养殖试验在广东省湛江市广东海洋大学东海岛海洋生物研究基地进行,试验用凡纳滨对虾虾苗购于湛江粤海虾苗厂。虾苗于室外水泥池暂养30 d后,挑选初始均重为(0.40±0.01) g的健康个体840尾,随机分为7组,每组3个重复,每个重复40尾,以重复为单位养殖于0.3 m3的玻璃纤维钢桶中。养殖周期为8周。试验期间按照体重的8%~10%投喂,每天投喂4次(07:00、11:00、17:00和21:00),根据天气、摄食和生长情况相应调整投喂量,试验前期(前6周)每2 d换水1次,试验后期(后2周)每天换水1次,换水量为总水量的2/3。试验期间,给养殖水体不断充气,使溶解氧浓度达到5~6 mg/L,水温为(30.5±0.8) ℃,盐度为29~31,pH为7.8~8.2,氨氮浓度低于0.03 mg/L。
1.3 哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)攻毒试验养殖试验结束后,每组随机选取30尾虾,分为3个重复,每个重复10尾,进行哈维氏弧菌攻毒试验。攻毒所用哈维氏弧菌菌种由广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室提供。每尾试验鱼肌肉注射哈维氏弧菌(活菌数为1×107 CFU/mL),每尾注射0.1 mL,观察记录攻毒后96 h的死亡鱼数,计算累积存活率(cumulative survival rate)。
1.4 样品采集养殖试验结束后停喂24 h,然后将钢桶中试验虾捞出暂放于小桶中,保证水体溶氧浓度,适度麻醉,操作时减少对虾的痛感。每桶取15尾虾,采用一次性无菌注射器(1 mL)在围心腔抽取虾血,放进1.5 mL的离心管,4 ℃冰箱中过夜后,3 500 r/min离心10 min,取上清液于1.5 mL的离心管中,保存在-80 ℃超低温冰箱中备用;每桶再取10尾虾,用无菌镊子及剪刀取肝胰腺放于装有RNAlater的离心管中,置于-80 ℃超低温冰箱保存,用于测定过氧化氢酶、溶菌酶mRNA的相对表达量。
1.5 指标测定 1.5.1 生长性能计算公式饲料中水分、粗蛋白质、粗脂肪含量的测定参考AOAC(1995)[16],其中水分含量采用105 ℃干燥恒重法测定;粗蛋白质含量采用凯氏定氮法测定;粗脂肪含量采用索氏抽提法测定。
1.5.3 血清中非特异性免疫酶活性测定血清中酚氧化物酶、酸性磷酸酶、过氧化氢酶、碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶活性采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定,具体操作严格按照各试剂盒说明书执行;血清中溶菌酶活性送至南京建成生物工程研究所测定。
1.5.4 肝胰腺中过氧化氢酶、溶菌酶mRNA相对表达量的测定 1.5.4.1 引物设计过氧化氢酶、溶菌酶引物设计参照文献[17-21],引物均由上海英潍捷基贸易有限公司合成,内参基因β-肌动蛋白(β-actin)和目的基因过氧化氢酶、溶菌酶的引物序列见表 2。
采用TRIzol试剂(大连宝生物工程有限公司)提取对虾肝胰腺中的总RNA,具体操作方法严格参照说明书执行。提取完成之后的总RNA用浓度为1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳,在凝胶成像仪上观察其完整性,用Nano Drop 2000c分光光度计(美国Thermo公司)定量检测RNA的OD260 nm和OD280 nm,二者比值在1.8~2.0之间的RNA样品保存于-80 ℃用于后续试验。
采用TaKaRa公司的PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)试剂盒将提取到的总RNA进行反转录,合成cDNA,具体操作严格按照试剂盒说明书执行。
1.5.4.3 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)按照SYBR ®Premix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)试剂(大连宝生物工程有限公司)说明操作,在ABI7500定量PCR仪上进行RT-qPCR。反应体系(20 μL)如下:SYBR ®Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(2×),10.0 μL;PCR Forward Primer(10 μmol/L),0.4 μL;PCR Reverse Primer(10 μmol/L),0.4 μL;RT反应液,2.0 μL;dH2O,6.8 μL。目的基因mRNA表达结果采用2-ΔΔCt法[22]计算,以相对表达量表示。
1.6 数据处理与分析试验数据用SPSS 16.0软件进行统计分析,先对数据作单因素方差分析(one-way ANOVA),如有显著性差异(P < 0.05),则采用Duncan氏法进行多重比较,试验数据用“平均值±标准差”表示。
2 结果与分析 2.1 低鱼粉饲料中添加枯草芽孢杆菌对凡纳滨对虾幼虾生长性能的影响由表 3可知,低鱼粉饲料中添加不同比例的枯草芽孢杆菌对凡纳滨对虾幼虾的存活率无显著影响(P>0.05)。增重率与特定生长率随枯草芽孢杆菌添加量的增加呈先上升后下降趋势,二者在添加量为0.75%时有最高,除0.10%组外的各添加组均显著高于对照组(P < 0.05);枯草芽孢杆菌添加量为0.75%时,饲料系数最低,显著低于其他各组(P < 0.05),对照组饲料系数最高,显著高于除0.10%组外的各添加组(P < 0.05);而蛋白质效率的变化规律则与饲料系数相反,以0.75%组最高,显著高于其他各组(P < 0.05),以对照组最低,显著低于除0.10%组外的各添加组(P < 0.05)。以增重率为判断依据,根据折线模型(图 1)得出,低鱼粉饲料(鱼粉含量为10%)中添加0.73%的枯草芽孢杆菌可促进凡纳滨对虾幼虾的生长。
由表 4可知,血清酸性磷酸酶、过氧化氢酶、酚氧化物酶和溶菌酶活性随枯草芽孢杆菌添加量的增加先升高后降低,分别在添加量为1.00%、1.00%、0.50%和0.75%时获得最高值,同时各添加组血清酸性磷酸酶、过氧化氢酶和溶菌酶活性均显著高于对照组(P < 0.05),除0.10%组外的各添加组血清酚氧化物酶活性显著高于对照组(P < 0.05)。各添加组血清碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶活性均显著高于对照组(P < 0.05),且二者均在枯草芽孢杆添加量为0.75%有最高值。
由图 2和图 3可知,肝胰腺中过氧化氢酶和溶菌酶mRNA相对表达量随枯草芽孢杆菌添加量的增加呈先升高后下降趋势,均在添加量为1.00%时达到最大值,各添加组肝胰腺中过氧化氢酶mRNA相对表达量均显著高于对照组(P < 0.05),0.50%、0.75%、1.00%和1.50%组肝胰腺中溶菌酶mRNA相对表达量显著高于对照组(P < 0.05)。
由图 4可知,经哈维氏弧菌攻毒96 h后,凡纳滨对虾幼虾的累积存活率随枯草芽孢杆菌添加量的增加先升高后趋于稳定,具体表现为0.50%、0.75%、1.00%和1.50%组显著高于对照组(P < 0.05),0.10%和0.25%组与对照组差异不显著(P>0.05)。
近年来,降低水产饲料中鱼粉的使用量而又不影响饲料营养价值方面的研究逐渐增多[23]。枯草芽孢杆菌是饲料添加剂中常用的益生菌,对水产动物等具有促进生长的作用[24]。本试验结果表明,在低鱼粉饲料中添加适量枯草芽孢杆菌可显著提高凡纳滨对虾幼虾的增重率、特定生长率,并显著降低饲料系数。在枯草芽孢杆菌添加量为0.75%时,凡纳滨对虾幼虾的增重率、特定生长率均显著高于对照组,饲料系数显著低于对照组。以增重率为判断依据,通过折线模型可知,促进凡纳滨对虾幼虾生长的饲料中枯草芽孢杆菌的适宜添加量为0.73%。上述结果表明,在低鱼粉饲料中添加适量的枯草芽孢杆菌能能更好地促进凡纳滨对虾幼虾的健康生长。这与丁贤等[12](活菌数为1.2×109 CFU/g,添加量为1.0%、3.0%时较佳)、于明超等[13](活菌数为1×109 CFU/g,添加量为0.3%时最佳)、柴鹏程等[25](添加量为1×107 CFU/g时最佳)、张春晓等[26](活菌数为2×109 CFU/g,添加量为600 mg/kg时最佳)得出的枯草芽孢杆菌对凡纳滨对虾有促生长作用的结果类似。
枯草芽孢杆菌促进凡纳滨对虾幼虾生长,可能与其创造酸性环境、抑制有害菌生长、调节肠道微生态平衡、产生多种消化酶等作用有关[10-11]。另外,从本试验结果看,枯草芽孢杆菌添加量过高反而抑制凡纳滨对虾幼虾生长,可能是过量的枯草芽孢杆菌会抑制其他有益菌生长,造成肠道有益菌群生态失衡,从而导致凡纳滨对虾生长缓慢,更深层次的原因还有待深入研究。
3.2 低鱼粉饲料中添加枯草芽孢杆菌对凡纳滨对虾幼虾血清非特异性免疫酶活性及肝胰腺非特异性免疫酶mRNA表达的影响酚氧化酶、溶菌酶活性是检测凡纳滨对虾免疫力的重要指标[27-33]。本试验中,凡纳滨对虾幼虾血清酚氧化酶、溶菌酶活性随枯草芽孢杆菌添加量的增加呈先升高后降低趋势,分别在添加量为0.50%和0.75%达到最大值,说明添加枯草芽孢杆菌对血清中酚氧化酶、溶菌酶活性起到积极促进作用,这与谢佳磊等[36]研究得出的枯草芽孢杆菌(5×109 CFU/kg)对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)血清溶菌酶和酚氧化酶活性影响的结果相似。
超氧化物歧化酶、过氧化氢酶能够有效地除自由基、活性氧,防止生物分子方面的损伤,起到免疫抗病作用[34-38]。本试验中,各添加组血清过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性均显著高于对照组,且在枯草芽孢杆菌添加量为1.00%时二者达到最大值,表明低鱼粉饲料中添加适量枯草芽孢杆菌可提高血清中过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性,这与张春晓等[26]、胡毅等[39]以枯草芽孢杆菌饲喂凡纳滨对虾后所得结果相似。
酸性磷酸酶和碱性磷酸酶对于生物体内物质可以快速的摄取与转运[38],是机体免疫抗病不可缺少的重要免疫酶[40-41]。本试验结果表明,低鱼粉饲料中添加枯草芽孢杆菌能够有效地提高血清酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的活性,提高机体免疫力,这与王苓等[42]得出的添加芽孢杆菌(1×109 CFU/kg)对凡纳滨对虾血清非特异性免疫酶活性影响的结果一致。
本试验中,各添加组血清非特异性免疫酶活性均较对照组有所提高,但其峰值不一样,可能是由于枯草芽孢杆菌对不同非特异性免疫酶的活性促进作用效价范围不一致所导致。
过氧化氢酶具有防止自由基形成、维持免疫系统平衡、保护个体组织免受病毒侵害的重要作用[43];溶菌酶可以辅助判断机体非特异性免疫机能[44]。研究这2种酶mRNA的表达情况可以探讨凡纳滨对虾幼虾相关非特异性免疫酶活性与其mRNA表达的关系以及枯草芽孢杆菌的作用方向,为更深层次的研究做铺垫。本试验中,各添加组凡纳滨对虾幼虾肝胰腺中过氧化氢酶和溶菌酶mRNA的相对表达量均高于对照组,且均在添加量为1.00%最高,这与血清中这2种酶活性变化的趋势基本一致,枯草芽孢杆菌提高凡纳滨对虾幼虾非特异性免疫力可能是通过上调相关基因的表达而实现的。由此可以得出,添加枯草芽孢杆菌能够提高凡纳滨对虾肝胰腺中非特异性免疫酶mRNA的表达,这与丁晶等[45]、张盛静等[17]饲喂凡纳滨对虾含有芽孢杆菌的饲料时得出的试验组溶菌酶mRNA相对表达量显著高于对照组的研究结果相同。
3.3 低鱼粉饲料中添加枯草芽孢杆菌对凡纳滨对虾幼虾抗病力的影响凡纳滨对虾养殖过程中,病害是造成其养殖成功率低的主要原因,对虾存活率的多少是其抗病力的外在直观体现,哈维氏弧菌是凡纳滨对虾致病率比较高的有害菌之一[46]。本试验中,在养殖试验结束后,凡纳滨对虾幼虾肌肉注射哈维氏弧菌,观察记录96 h后的累积存活率。结果发现,凡纳滨对虾幼虾的累积存活率随着枯草芽孢杆菌添加量的增加先增加然后在较高的水平上保持稳定,说明添加芽孢杆菌能够有效地提高凡纳滨对虾幼虾的抗病力,这与沈文英等[47]以白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)感染凡纳滨对虾的研究结果相似。枯草芽孢杆菌可提高凡纳滨对虾幼虾的抗病力可能与芽孢杆菌细胞壁的主要成分肽聚糖有关,肽聚糖可刺激水产动物免疫因子活性提高[48],进而提高其抗病力。
4 结论综上所述,在低鱼粉饲料中添加适量的枯草芽孢杆菌可促进凡纳滨对虾幼虾生长,提高非特异性免疫力和抗病力。以增重率为判断依据,通过折线回归模型分析得出低鱼粉饲料(鱼粉含量为10%)中添加0.73%的枯草芽孢杆菌(活菌数为1.0×108 CFU/mL)时促生长效果最佳。
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