锌是一种重要的营养素，因其是众多酶的组成成分或活性中心分子而参与许多生化代谢过程，从而对动物生长发育、免疫健康和产品品质等具有重要的影响。研究表明，锌缺乏可加剧肠道炎症反应，而补充外源锌可在一定程度上起到缓解作用。Suwendi等[1]在结肠炎模型的体内外试验中发现，缺锌可加剧葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎，提高脂多糖(LPS)诱导的肠系膜白细胞中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的产量。Peterson等[2]研究发现，LPS可导致小鼠空肠白细胞入侵，而轻微缺锌则会加重该反应，同时缺锌提高了血浆中白细胞介素(IL)-6和IL-10的水平。Pyle等[3]研究发现，锌通过依赖锌转运蛋白ZIP8下调人巨噬细胞IL-10的表达，提高TNF-α、IL-6和IL-8的表达，以此限制病原菌扩散，加速早期炎症反应进程。
一些研究显示锌离子有信号转导功能，可参与核转录因子-κB(NF-κB)的活化[4]。然而，越来越多的文献证实锌的主要功能是负向调节NF-κB信号通路。锌指蛋白A20，又称肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(TNFAIP3)，最初作为人脐静脉内皮细胞中的一种肿瘤坏死因子诱导基因所编码的蛋白。A20是一种负调控NF-κB的锌指蛋白，是炎症信号转导过程中的中心调节因子，它可通过泛素化修饰抑制通过肿瘤坏死因子受体和Toll样受体(TLR)激活的NF-κB信号通路，进而抑制炎症反应[5-7]。在本实验室的早期研究中也发现存在锌营养调节免疫炎症反应也改变A20表达的相关性[8]。锌指蛋白A20在维持肠道上皮完整性和改善肠道健康方面发挥着重要作用。Kolodziej等[9]试验表明，A20基因敲除鼠肠道通透性显著增加；而A20转基因小鼠可有效抵制LPS诱导的肠道紧密连接蛋白——闭锁蛋白(occludin)的损失和肠道通透性的升高。Vereecke等[10]研究表明，A20缺乏的小鼠肠上皮细胞对结肠炎的易感性增加。Weng等[11]研究发现，A20的过表达可限制肠上皮促炎因子IL-8的产生。
为了进一步明确锌指蛋白A20在锌营养调节炎症反应过程中的作用，本研究通过对体外培养的鸡肠上皮细胞进行A20基因的沉默和过表达，并通过感染LPS激发炎症反应，探讨锌在调控肠上皮炎症反应的分子机制。
1 材料与方法 1.1 肠上皮细胞的分离培养与鉴定体外培养鸡小肠上皮细胞并进行肠上皮细胞的鉴定。选择18胚龄的种蛋用于细胞培养试验。
1.2 LPS感染模型的建立 1.2.1 LPS最佳作用剂量鸡肠上皮细胞培养72 h后，培养基中分别加入0、10、100、1 000 ng/mL大肠杆菌(Escherichia coli，血清型O55 : B5，用完全培养基配制)，对照组加入等量的完全培养基，每个处理3个重复。培养6 h后收集上清液，利用放射免疫检测法测定IL-1β、IL-8和TNF-α的产量；同时，提取各处理肠上皮细胞的RNA，采用实时荧光定量PCR方法测定IL-1β、IL-8和TNF-α的基因表达水平，探讨LPS的最佳作用剂量。
1.2.2 LPS最佳作用时间将最佳的LPS剂量处理鸡肠上皮细胞，培养0、3、6、9 h(每个处理3个重复)后收集上清液并提取肠上皮细胞的RNA，测定IL-1β、IL-8和TNF-α的产量和基因表达，探讨LPS的最佳作用时间。
1.3 锌对LPS诱导鸡肠上皮细胞炎症反应的影响鸡肠上皮细胞细胞培养72 h后，加入0、25、50、100 μmol/L锌(硫酸锌，Z0251，Sigma，每个处理3个重复)，培养12 h后，弃去培养基，换入新鲜的完全培养基。同时，加入10 ng/mL LPS，培养6 h后收集细胞上清液并提取肠上皮细胞的RNA，测定IL-1β、IL-8、TNF-α的产量以及IL-1β、IL-8、TNF-α、NF-κB p65、TLR4和A20的基因表达，探讨锌的最佳作用剂量。
1.4 锌与A20基因沉默对LPS诱导鸡肠上皮炎症反应的影响 1.4.1 A20基因沉默模型在鸡肠上皮细胞中培养24 h后，将细胞分为5组，每个组分别加入等量的培养基、1×107的阴性siRNA慢病毒以及1×107的3种A20-siRNA慢病毒，每组3个重复，感染10 h后，更换培养基，继续培养3 d后，收集细胞上清液并提取肠上皮细胞的RNA，测定IL-1β、IL-8、TNF-α的产量以及IL-1β、IL-8、TNF-α和A20的基因表达以及A20的蛋白表达，探讨最佳的A20基因干扰序列。
1.4.2 A20基因沉默对LPS诱导鸡肠上皮细胞炎症反应的影响在鸡肠上皮细胞中培养24 h后，将细胞分为3组。其中第1组为对照组，加入等量的培养基；第2组在细胞培养3 d后，添加LPS；第3组先添加1×107 A20-siRNA(选用最佳作用效果的A20-siRNA)，感染3 d后，添加LPS，每组3个重复。在添加LPS后6 h收集细胞上清液和肠上皮细胞，测定IL-1β、IL-8、TNF-α的产量以及IL-1β、IL-8、TNF-α的基因表达，探讨A20基因沉默对LPS感染肠上皮细胞的影响。
1.4.3 锌与A20基因沉默对LPS诱导鸡肠上皮炎症反应的影响鸡肠上皮细胞感染A20-siRNA(选用最佳作用效果的A20-siRNA)3 d后，在培养基中加入25 μmol/L锌(硫酸锌)或等量的完全培养基，培养12 h后，体外添加LPS，继续培养6 h后，收集上清液和肠上皮细胞，提取RNA和蛋白，测定IL-1β、IL-8、TNF-α的产量以及IL-1β、IL-8、TNF-α、NF-κB p65、TLR4和A20的基因表达，测定核因子κB抑制蛋白(IκB)α、A20、磷酸化NF-κB p65和NF-κB p65的蛋白表达等。试验分组见表 1，每个组6个重复。
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表 1 试验分组 Table 1 Experimental groups |
分离培养肠上皮细胞，在细胞培养48 h后分别按照MOI=30、100、300和1 000进行病毒感染，感染6 h后弃去含病毒培养基，换上新鲜的完全培养基，继续培养36 h后置于荧光显微镜下观察感染效果，确定最佳MOI。
1.5.2 A20基因过表达模型在鸡肠上皮细胞培养48 h后，将细胞分为3组，每个组分别加入等量的培养基、最佳MOI的空白对照腺病毒以及最佳MOI的A20腺病毒，每组3个重复，感染6 h后，更换培养基，继续培养36 h后，提取肠上皮细胞的RNA，测定IL-1β、IL-8、TNF-α和A20的基因表达，构建A20基因过表达模型。
1.5.3 A20基因过表达对LPS诱导肠上皮细胞炎症反应的影响在鸡肠上皮细胞中培养48 h后，将细胞分为3组。其中第1组为对照组，加入等量的完全培养基；第2组在细胞培养42 h后，添加LPS；第3组先添加最佳MOI的A20腺病毒，感染6 h后继续培养36 h，再添加LPS，每组3个重复。在添加LPS后6 h收集肠上皮细胞并提取RNA，测定IL-1β、IL-8、TNF-α和A20的基因表达，探讨A20基因过表达对LPS感染肠上皮细胞的影响。
1.5.4 锌与A20基因过表达对LPS诱导鸡肠上皮细胞炎症反应的影响鸡肠上皮细胞感染最佳MOI的A20腺病毒6 h，再换入新鲜的完全培养基继续培养36 h后，在培养基中加入25 μmol/L锌(硫酸锌)或等量的完全培养基，培养12 h后，体外添加LPS，继续培养6 h后，收集肠上皮细胞，提取RNA，测定IL-1β、IL-8、TNF-α、NF-κB p65、TLR4和A20的基因表达。试验分组见表 2，每个组3个重复。
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表 2 试验分组 Table 2 Experimental groups |
试验数据采用SPSS 19.0进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，以P < 0.05为差异显著，以P < 0.01为差异极显著，差异显著则采用Duncan氏法进行多重比较。采用一般线性模型(GLM)进行2×2主效应分析。
2 结果与分析 2.1 鸡肠上皮细胞的鉴定小肠组织在培养72 h后显微镜下可观察到小肠上皮细胞呈单层“铺路石”状生长，并铺满培养板底部70%以上，且边界清晰，互不重叠。免疫荧光结果(图 1)显示，钙黏附蛋白E(E-cadherin)在单层上皮细胞的链接上呈强阳性表达，表明所培养的细胞为上皮细胞。
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图 1 钙黏附蛋白E在鸡胚肠上皮细胞的分布 Fig. 1 Distribution of E-cadherin in chicken embryo intestinal epithelial cells (400×) |
由图 2可知，相比对照组，体外添加10 ng/mL LPS 6 h后鸡肠上皮细胞IL-8、IL-1β和TNF-α的基因表达水平和细胞上清液中IL-8和TNF-α的产量显著提高(P < 0.05)；但随着LPS剂量的增加，IL-8、IL-1β和TNF-α的基因表达水平和蛋白产量并未显著提高(P>0.05)。
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数据柱标注不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。图 3、图 4、图 5和图 6同。 Data columns with different small letter superscripts mean significant difference (P < 0.05). The same as Fig. 3, Fig. 4, Fig. 5 and Fig. 6. 图 2 LPS对鸡肠上皮细胞炎症反应的影响 Fig. 2 Effects of LPS on inflammatory response in chicken intestinal epithelial cells (n=3) |
由图 2可知，相比对照组，体外添加10 ng/mL LPS作用3 h后，肠上皮细胞IL-1β的基因表达水平和培养基上清液中IL-8的蛋白产量显著提高(P < 0.05)；相比对照组，LPS作用6 h后，IL-8和IL-1β的基因表达水平以及IL-8和TNF-α的蛋白产量都显著提高(P < 0.05)；然而，相比LPS作用6 h，LPS作用9 h后IL-1β的基因表达水平和TNF-α的蛋白产量显著降低(P < 0.05)。由此可见，LPS诱导鸡肠上皮细胞炎症反应的最佳剂量和时间分别是10 ng/mL和6 h。
2.3 锌对LPS诱导鸡肠上皮细胞炎症反应的影响由图 3可知，体外添加25、50或100 μmol/L锌作用12 h后均可缓解LPS诱导的鸡肠上皮细胞IL-8、IL-1β和TNF-α的基因表达上调和蛋白分泌增加以及TLR4的转录激活(P < 0.05)；但体外添加100 μmol/L锌并不能缓解LPS诱导的NF-κB p65转录激活(P>0.05)。体外添加25 μmol/L锌较正常对照组可显著提高锌指蛋白A20的基因表达水平(P < 0.05)，但较LPS对照组无显著差异(P>0.05)。由此可见，体外添加25 μmol/L锌可显著改善LPS诱导的鸡肠上皮细胞的炎症反应。
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图 3 锌对LPS诱导鸡肠上皮细胞炎症反应的影响 Fig. 3 Effects of zinc on LPS-induced inflammatory response in chicken intestinal epithelial cells (n=3) |
由图 4可知，相比对照组，3种A20-siRNA可显著提高鸡肠上皮细胞IL-8和IL-1β的基因表达水平(P < 0.05)，也可导致培养基上清液中的IL-8和IL-1β产量的显著增加(P < 0.05)；但只有A20-siRNA-1和A20-siRNA-3可显著升高TNF-α的基因表达水平和蛋白产量(P < 0.05)，其中，A20-siRNA-1的干扰效果最佳。A20-siRNA-1干扰细胞后，A20的蛋白表达显著降低。
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图 4 A20-siRNA条件的摸索 Fig. 4 Exploration of A20-siRNA conditions (n=3) |
由图 5可知，相比对照组，A20-siRNA-1感染鸡肠上皮细胞72 h后，可显著提高鸡肠上皮细胞添加LPS后IL-8和IL-1β的基因表达水平以及IL-1β和TNF-α的蛋白产量(P < 0.05)。由此可见，LPS诱导鸡肠上皮细胞炎症反应可能是通过抑制A20的转录实现的。
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图 5 A20基因沉默对LPS诱导鸡肠上皮细胞炎症反应的影响 Fig. 5 Gene silencing of A20 on LPS-induced inflammatory response in chicken intestinal epithelial cells (n=3) |
由图 6可知，相对完全培养基组，添加锌可显著上调A20的蛋白表达；A20-siRNA-1感染鸡肠上皮细胞72 h后，A20的基因和蛋白表达显著下调(P < 0.05)，NF-κB p65的基因表达水平显著提高(P < 0.05)，IL-8、IL-1β和TNF-α的基因表达水平以及IL-1β和TNF-α的蛋白产量显著升高(P < 0.05)。锌可一定程度缓解A20基因沉默诱导的IL-1β和TNF-α基因表达上调以及IL-8和TNF-α蛋白产量增加(P < 0.05)。
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图 6 锌与A20基因沉默对LPS诱导鸡肠上皮炎症反应的影响 Fig. 6 Effects of zinc and gene silencing of A20 on LPS-induced inflammatory response in chicken intestinal epithelial cells (n=6) |
由图 7可知，通过siRNA技术对A20基因沉默后，胞浆中磷酸化NF-κB p65蛋白表达显著上调并转移至核内，胞浆中磷酸化的IκBα的蛋白表达显著增加，而NF-κB p65的蛋白表达显著下调。此外，细胞上清液中加锌可提高胞质中NF-κB p65的蛋白表达，降低胞质中磷酸化NF-κB p65的蛋白表达，提高胞核中磷酸化NF-κB p65的蛋白表达；但是A20基因沉默后加锌不能改善胞浆中NF-κB信号通路相关蛋白的表达。由此可见，锌可以通过A20-NF-κB p65信号通路缓解LPS诱导的鸡肠上皮细胞炎症反应。
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图 7 锌与A20基因沉默对LPS诱导鸡肠上皮炎症反应相关蛋白表达的影响 Fig. 7 Effects of zinc and gene silencing of A20 on LPS-induced inflammatory response related protein expression in chicken intestinal epithelial cells (n=4) |
由图 8可知，随着MOI的提高，细胞的感染率逐渐提高，MOI=1 000时感染效率达到最大。就细胞死亡率而言，各处理间差异不大，但随着MOI的提高，肠上皮细胞离散程度加剧。本次试验证实了腺病毒对肠上皮细胞感染的高效率，并初步确定最佳MOI为1 000。
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数据柱标注不同小写字母表示差异极显著(P < 0.01)。图 9同。 Data columns with different letter superscripts mean extremely significant difference (P < 0.01). The same as Fig. 9. 图 8 A20基因过表达模型的建立 Fig. 8 Construction of A20 gene overexpression model (n=3) |
由图 8可知，相对空白对照组，感染空白腺病毒和A20腺病毒可极显著提高IL-1β和IL-8的基因表达水平(P < 0.01)。而相对空白腺病毒组，感染A20腺病毒可极显著提高A20的基因表达水平(P < 0.01)，且可极显著降低IL-1β和IL-8的基因表达水平(P < 0.01)，表明腺病毒感染可造成鸡肠上皮细胞的炎症反应，而A20基因过表达可抑制这种炎症反应。
由图 9可知，在鸡肠上皮细胞感染A20腺病毒后，可极显著提高A20的基因表达水平(P < 0.01)，而且极显著降低了添加LPS导致的IL-1β、IL-8和TLR4基因表达水平的上升(P < 0.01)，但对TNF-α、NF-κB p65的基因表达水平无显著影响(P>0.05)。
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图 9 A20基因过表达对鸡肠上皮细胞炎症反应的影响 Fig. 9 Effects of A20 gene overexpression on inflammatory response in chicken intestinal epithelial cells (n=3) |
由表 3可知，A20腺病毒感染可极显著提高鸡肠上皮细胞A20的基因表达水平(P < 0.01)。锌添加组IL-1β的基因表达水平显著低于未添加锌组(P < 0.05)，而锌添加与否对IL-8、TNF-α基因表达水平的影响无显著差异(P>0.05)。A20腺病毒感染组IL-1β、IL-8和TNF-α的基因表达水平显著低于空白病毒感染组(P < 0.05)。锌与A20腺病毒二者间的互作可显著影响IL-1β和TNF-α的基因表达水平(P < 0.05)，表现为非A20过表达的情况下，添加锌可显著降低IL-1β的基因表达水平(P < 0.05)、显著提高TNF-α的基因表达水平(P < 0.05)，而在A20过表达的情况下，添加锌对IL-1β的基因表达水平无显著影响(P>0.05)、显著降低TNF-α的基因表达水平(P < 0.05)。锌添加组NF-κB p65的基因表达水平显著上调(P < 0.05)，A20腺病毒感染组TLR4的基因表达水平显著降低(P < 0.05)。
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表 3 锌与A20基因过表达对LPS诱导鸡肠上皮细胞炎症反应的影响 Table 3 Effects of zinc and A20 gene overexpression on LPS-induced inflammatory response in chicken intestinal epithelial cells (n=3) |
转录因子NF-κB是由一系列负责炎症反应、先天性和适应性免疫的转录因子家族组成的；当NF-κB信号通路激活时，会引起一系列的级联反应和泛素化修饰，促使其亚基NF-κB p65转移至核内，启动促炎因子的转录，进而导致炎症反应。如图 10所示，锌指蛋白A20是NF-κB信号通路的抑制因子，它可通过其N-末端的脱泛素因子和C-末端E3泛素连接酶的锌指域干扰NF-κB通路中的各个因子如肿瘤坏死因子相关因子6(TRAF6)、受体相互作用蛋白1(RIP1)和核因子-κB必需调制蛋白(NEMO)等的泛素化修饰，进而导致下游抑制性κB蛋白激酶(IKK)的激活和IκB的磷酸化，以致p65/p50移位至细胞核内，促使炎症反应的发生[12]。LPS又名内毒素，可直接或间接抑制免疫细胞的功能，进而紊乱免疫系统的发育，它已被证明是通过激活NF-κB通路诱导炎症反应的最为典型的因子之一。研究发现，LPS可以抑制T细胞的增殖，提高促炎因子的释放[13]，并且可以激活脾脏以及肠道等组织或细胞的NF-κB信号通路，诱导促炎基因如IL-8的转录[14]。LPS有助于炎性细胞因子的产生，是因为TLR4和NF-κB p65的转录上调导致了下游信号通路的激活。在本试验中，相对于完全培养基对照组，LPS上调了A20的基因表达水平，这可能是由于炎症因子产生过多因而需要更多的抑制因子A20来维持机体的稳态；然而，先通过将A20基因进行慢病毒感染试验后，炎症反应较LPS注射组更为明显。Wang等[15]研究发现，LPS可诱导肠上皮细胞A20的表达；而对刚出生的小鼠饲喂抗生素后，A20的表达显著降低，肠道炎症反应强度增加。Shembade等[16]和Wertz等[17]指出，A20可调节NF-κB通路抑制炎症反应并维持机体的免疫稳态。
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TNF：肿瘤坏死因子tumor necrosis factor；TNF-RⅠ：肿瘤坏死因子受体1 tumor necrosis factor receptor 1；TRADD：肿瘤坏死因子1受体相关死亡域蛋白tumor necrosis factor receptor 1-associated death domain protein；TRAF2/5：肿瘤坏死因子受体相关因子2/5 tumor necrosis factor receptor associated factor 2/5;RIP1:受体相互作用蛋白1 receptor-interacting protein 1；cIAP1/2:细胞凋亡抑制蛋白1和2 cellular inhibitor of apoptosis protein 1 and 2；Ubc5：范素结合酶5 ubiquitin-conjugating enzyme 5；TAB 2/3:转化生长因子β活化的激酶1结合蛋白2/3 transforming growth factor-β-activated kinase 1-binding protein 2/3；TAK1:转化生长因子β活化激酶1 transforming growth factor β-activated kinase 1；NEMO:核因子-κB必需调制蛋白NF-κB essential modulation protein；IKK1/2:抑制性κB蛋白激酶1/2 inhibitory κB protein kinase 1/2；LUBAC:线性泛素链组装复合体linear ubiquitin chain assembly complex; Ub:泛素ubiquitin；ITCH:痒同源物E3泛素蛋白连接酶itchy homolog E3 ubiquitin protein ligase；TAX1BP1：Tax1结合蛋白1 Tax1-binding protein 1；RNF11:环指蛋白11 ring finger protein 11；LPS:脂多糖lipopolysaccharide；TLR4:Toll样受体4 Toll like receptor 4;MyD88:髓样分化因子88 myeloid differentiation primary response 88;TRAF6:肿瘤坏死因子受体相关因子6 tumor necrosis factor receptor associated factor 6;Ubc13/H5:范素结合酶13/组蛋白H5 ubiquitin-conjugating enzyme 13/histone H5；IκBα：核因子κB抑制蛋白α NF-κB inhibitor protein α。 图 10 A20调节NF-κB信号通路机制 Fig. 10 Mechanisms of NF-κB signaling pathway regulated by A20 |
有研究表明，锌可通过调节细胞的A20基因表达，并降低促炎细胞因子的基因表达。在锌指蛋白A20的结构中，锌与4个胱氨酸和组氨酸以不同排列形成稳定的四面体结构。锌可通过提高A20的表达增强免疫技能。Prasad等[18]发现，补充锌可通过上调负反馈调节因子A20导致炎性细胞因子的下调，以抑制NF-κB活化。Morgan等[6]研究证实，锌通过调节A20的水平影响NF-κB途径。Yan等[7]证明锌补充通过诱导A20介导的NF-κB经典信号通路的抑制来预防大鼠腹主动脉瘤形成。Wu等[19]研究发现锌指蛋白A20可通过抑制TNF-α、NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65的表达以及提高IL-10的表达缓解LPS诱导的肺部炎症反应。
在本研究中，当感染A20基因腺病毒后，A20的基因表达水平显著升高，促炎细胞因子表达量下降；当感染A20基因siRNA病毒后，A20的基因和蛋白表达显著下调，IκBα磷酸化作用加强，NF-κB p65磷酸化并大量转移至核内，以致促炎细胞因子的基因表达和蛋白分泌显著增加，然而，IL-8和TNF-α的蛋白产量与LPS注射对照组无显著差异。因此，一方面可能还有别的信号因子在此过程中发挥着重要作用，另一方面抗炎的细胞因子在维持炎症反应的平衡中也至关重要。据Bhoj等[20]报道，NF-κB通路的激活一方面受到IκBα的结合而不能进入核内启动炎症因子的转录；另一方面，NF-κB通路中各个蛋白的泛素化修饰会受到头帕肿瘤综合征蛋白(CYLD)和A20的抑制；此外，NF-κB通路的激活有助于A20基因的转录，而A20又可影响IκB的活性，最终调节促炎和抗炎的平衡。在本试验中也发现A20基因沉默后，锌可降低炎性细胞因子的基因表达，这可能是锌还经其他信号通路也参与了炎症细胞因子的调节，只不过其他途径的作用强度相对较弱。锌可通过A20-NF-κB信号通路缓解LPS诱导的炎症反应，机制在于锌可通过提高A20和过氧化物酶体增殖物激活受体α的水平抑制NF-κB介导的TNF-α和IL-1β等炎症因子的产生，并且锌通过影响A20的表达，改变了NF-κB和DNA的结合能力，降低了IKKα/NF-κB信号通路的激活和氧化应激，进而可以抑制炎症细胞因子的产生[5, 21]。
4 结论锌可通过上调A20蛋白表达缓解LPS诱导的鸡小肠上皮细胞NF-κB信号通路的激活和炎症反应的产生。
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