我国是玉米生产大国，玉米秸秆产量巨大，常作为反刍动物的主要粗饲料来源之一。但干玉米秸秆蛋白质含量低、纤维素含量高、适口性差，从而限制了其饲料化利用。目前常使用青贮技术来提高玉米秸秆的饲喂价值。研究表明，将玉米在乳熟期至蜡熟期间刈割，整株玉米青贮优于收获籽实后再用秸秆制作青贮的利用方式，营养价值和消化率更高，适口性更好，经济效益更显著^[1]。然而，全株玉米青贮有氧暴露后极易发生好氧变质^[2]，全混合日粮(TMR)也存在着储存期短、易变质等缺陷。发酵全混合饲粮(FTMR)融合了TMR和青贮技术，更具有优势，其制作原理类似于半干青贮，在发酵过程中不改变饲粮的营养价值，提高饲粮的适口性，缓解能量负平衡，确保较高的采食量、繁殖性能及产奶量^[3-4]。

国卫杰等^[5]探究了不同含水率TMR经过裹包处理15 d后的贮存效果，发现含水率40%、50%的TMR贮存效果较优。徐晓明等^[6]研究了不同含水率的TMR发酵过程中营养成分的变化，结果表明，45%、50%和55%含水率TMR较为适宜，发酵大于16 d且小于70 d为TMR的适宜发酵时间。FTMR制作的关键技术是严格控制含水率及创造厌氧环境^[7]。水分含量过低，原料粗硬，不易压实，好氧细菌大量繁殖使饲粮发霉变质；水分含量过高，特别是植物表面水分含量过高，促使丁酸菌生长繁殖而产生大量丁酸，使饲粮发臭、变黏^[8]。本试验探讨了含水率和发酵时间对全株玉米FTMR发酵品质及养分含量的影响，旨在确定全株玉米FTMR的最佳发酵时间及理想含水率，为FTMR生产及青饲料有效保存提供理论基础，扩大禾本科作物饲料资源的利用与开发。

1 材料与方法 1.1 FTMR制备

试验选用腊熟期全株玉米为主要原料，秸秆部分粉碎长度为2~3 cm，籽粒无破碎，原料颜色为青绿。艾格瑞SH-01便携式数字水分快速测定仪测定水分含量为71%，在保持饲粮精粗比约为3 : 7(干物质基础)的前提下，与干花生秧、混合精料等充分混合，配制成含水率为35%的TMR，其饲粮组成及营养水平如表 1所示。再通过加水调整TMR含水率分别为40%、45%、50%和55%，将这5种含水率的TMR快速装入塑料密封袋内，利用真空泵抽去空气后密封，带回实验室置阴凉暗处保存，制备FTMR。每种含水率FTMR各制备30包，每包约1.2 kg。试验地位于青岛，10月份温度为13~20 ℃，11月份温度为6~13 ℃，12月份温度为0~6 ℃。

1.2 样品采集

在发酵后的第0、10、20、30、40、50、60、70和80天，每种含水率FTMR随机抽取3包，进行感官鉴定并测定pH，然后一部分鲜样冷冻保存待测发酵指标，另一部分按四分法缩至每份300 g左右，置65 ℃烘箱内烘干至恒重测定初水分，用微型植物粉碎机粉碎过40目筛，制成风干样本，置封口袋中保存，待测养分含量。

1.3 测定指标及方法 1.3.1 感官评定

参考青贮饲料的品质鉴定方法^[9]，观察不同发酵时间FTMR的气味、颜色、茎叶结构和质地等感官指标，初步评判FTMR的品质。

1.3.2 养分含量的测定

根据张丽英^[10]介绍的方法采用氧弹式热量计测定能值，计算饲粮消化能；高锰酸钾滴定法测定钙含量；钼黄比色法测定磷含量；水分含量按GB/T 6435—1986方法测定；粗蛋白质(CP)含量按GB/T 6432—1994方法测定；中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量按GB/T 6434—2006方法测定；粗灰分(Ash)含量按GB/T 6438—1992方法测定。

1.3.3 发酵指标的测定

将FTMR冷冻样品解冻后，混合均匀，采用四分法进行缩分。准确称取剪碎的FTMR样品10 g于磨砂锥形瓶中，加入90 mL去离子水，置于4 ℃的冰箱中浸提48 h，每隔6 h搅拌1次，然后进行过滤，滤液用来测定pH、挥发性脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸)以及乳酸含量。

pH使用便携式pH计测定^[11]。挥发性脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸)含量采用Agilent 6890N气相色谱仪测定，进量1 μL，毛细管色谱柱(30.00 m×0.32 mm×0.25 μm)，流量1.5 mL/min，载气为氮气(N₂)，柱压为81.36 kPa，柱温起始温度为150 ℃，保持1 min，以6 ℃/min升到220 ℃，保持15 min，进样口为分流模式，分流比为5 : 1。乳酸含量测定，取5 mL滤液，加入5.0 mL 0.01 mol/L硫酸水溶液进行酸解，放入超声波清洗器中超声提取30 min(超声频率为320 kHz，温度为30 ℃)，取滤液离心(11 180×g，15 min)，上清液经0.22 μm滤膜过滤，取1.0 mL滤液检测^[12]。

1.3.4 霉菌毒素含量测定

取风干样粉碎样5 g，置于50 mL离心管中，加入提取液(乙腈:水=84 : 16，体积比)25 mL，涡旋混匀2 min，置于摇床中提取1 h，提取后用定量滤纸过滤，滤液经过0.22 μm滤膜过滤。采用Agilent 1290 Infinity/6460 UHPLC/MS/MS液质联用仪测定霉菌毒素中玉米赤霉烯酮、呕吐毒素以及黄曲霉毒素B₁含量，进样量为20 μL；柱温为33 ℃，流速为0.2 mL/min；流动相A为乙腈，流动相B为1%甲酸醋酸铵溶液；梯度洗脱程序：0 min 20% A，2 min 50% A，6 min 100% A，8 min 100% A，8.1 min 20% A，10 min 20% A。电喷雾离子源(ESI)，正负离子扫描模式，检测方式为多反应监测，母离子/子离子对均设为单位分辨，驻留时间0.1 s^[13]。

1.4 数据统计与分析

试验数据SPSS 20.0软件进行双因素方差分析，试验数据用平均值±标准差表示，并用Duncan氏法进行多重比较，显著水平为P < 0.05。

2 结果 2.1 不同发酵时间的全株玉米FTMR的感官变化

刚配制好的TMR质地湿润均匀，颜色为绿色，随着发酵时间的延长，颜色逐渐由绿色变为暗褐色，且含水率越高，颜色越深；刚配好的TMR茎叶结构明显、物料清晰，随着发酵时间的延长，茎叶逐渐变软，精料在粗料上附着性良好；刚制好的TMR有明显的全株玉米气味而无酸味，随着发酵时间和含水率的增加，FTMR带有酸香味；发酵至第80天，各组感官指标良好。另外，FTMR发酵初期有涨袋现象，但随着发酵时间的延长，到30 d以后涨袋现象逐渐消失。

2.2 含水率和发酵时间对全株玉米FTMR发酵过程中常规养分含量的影响 2.2.1 含水率和发酵时间对全株玉米FTMR水分含量的影响

由表 2可知，发酵初期各组水分含量提高，除35%、55%组外，其他各组水分含量在发酵第0天分别与第10、20天差异显著(P < 0.05)。发酵50 d后，随着发酵时间的增加，除55%组外，其余各组水分含量趋于稳定(P>0.05)。

2.2.2 含水率和发酵时间对全株玉米FTMR中CP含量的影响

由表 3可知，发酵过程中不同含水率和发酵时间对CP含量无显著影响(P>0.05)。

2.2.3 含水率和发酵时间对全株玉米FTMR中NDF含量的影响

由表 4可知，发酵初期各组NDF含量下降，但到一定时间后基本稳定，除个别时间点外，35%与40%组、45%组、50%与55%组分别在发酵第30、20、10天后与第0天差异显著(P < 0.05)。随着含水率的提高，50%、55%组在发酵第10、60、70、80天的NDF含量显著低于35%组(P < 0.05)，55%组在发酵第20、50天的NDF含量显著低于35%组(P < 0.05)。

2.2.4 含水率和发酵时间对全株玉米FTMR中ADF含量的影响

由表 5可知，各组ADF含量在发酵前10天下降，此后逐渐上升，发酵第30天后达到稳定状态，其中第0天与第30天差异不显著(P>0.05)。不同含水率FTMR在发酵过程中伴随着含水率的变化，ADF含量存在着一定差异，发酵第50天时，35%、40%组ADF含量显著高于45%、55%组(P < 0.05)；发酵第60天时，50%组ADF含量显著高于55%组(P < 0.05)。

2.2.5 含水率和发酵时间对全株玉米FTMR中Ash含量的影响

由表 6可知，在发酵时间的影响下，各组Ash含量呈现上升的趋势，发酵前30天，各组Ash含量上升缓慢，在发酵第30天时快速升高，此后又缓慢增加。40%、45%和50%组在发酵第0天的Ash含量与第30天差异显著(P < 0.05)。在发酵过程中随着含水率的变化，各组Ash含量差异不显著(P>0.05)。

2.3 含水率和发酵时间对全株玉米FTMR发酵过程中发酵指标的影响 2.3.1 含水率和发酵时间对全株玉米FTMR的pH的影响

由表 7可知，各组pH随着发酵时间的增加而下降。各组pH在发酵第10天急剧下降，与第0天差异显著(P < 0.05)，此后35%、40%组pH缓慢下降，45%、50%和55%组则在发酵第30天后缓慢下降或趋于稳定(P>0.05)，其中45%组具有较低的pH。而在不同含水率的影响下，在发酵第0、10、20天，各组pH随含水率的升高而升高，55%组具有较高pH，组间差异不显著(P>0.05)，发酵第30天后的各个时间点，各组pH随着含水率的升高而下降，除发酵第50、70天外，45%、50%和55%组pH均显著低于35%组(P < 0.05)。

2.3.2 含水率和发酵时间对全株玉米FTMR乳酸含量的影响

由表 8可知，FTMR随着发酵时间的增加，各组乳酸含量分别在发酵的第10~50天急剧上升(P < 0.05)，此后各组乳酸含量缓慢上升或保持稳定(P>0.05)。在不同含水率的影响下，中、高含水率的组具有较高的乳酸含量，其中45%组乳酸含量较高；在发酵第40天后，各组乳酸含量趋于稳定。

2.3.3 含水率和发酵时间对全株玉米FTMR的VFA含量的影响

由表 9可知，FTMR在发酵过程中随时间的变化各组乙酸含量变化趋势为：先上升后保持稳定。35%组在发酵过程中乙酸含量随发酵时间增加而增加，但差异不显著(P>0.05)；40%组在发酵第70、80天时与前40天差异显著(P < 0.05)；45%、50%和55%组在发酵第30天乙酸含量迅速升高，显著高于第10、20天(P < 0.05)。在不同含水率的影响下，在发酵第40天，35%组乙酸含量显著低于除40%组外的其余各组(P < 0.05)，在发酵第70天，35%组乙酸含量显著低于除50%组外的其余各组(P < 0.05)，在发酵第80天，35%组乙酸含量显著低于其余各组(P < 0.05)，45%组乙酸含量显著高于35%、40%组(P < 0.05)。

由表 10可知，FTMR在发酵过程中各组丙酸含量随发酵时间增加先上升后保持稳定，除55%组，其余各组在发酵的第40天后的各个时间点差异不显著(P>0.05)；35%、50%组在发酵第10、20天差异显著(P < 0.05)；除45%组外，其余各组在发酵第20、30天差异显著(P < 0.05)。在不同含水率的影响下，35%组在数值上要高于其余各组，并且在发酵第30、70、80天显著高于45%、50%组(P < 0.05)。

由表 11可知，FTMR在发酵过程中，只在发酵第10、20和30天检出丁酸，差异不显著(P>0.05)。

2.4 含水率和发酵时间对全株玉米FTMR霉菌毒素含量的影响

发酵前后各组样品中均未检测到玉米赤霉烯酮、呕吐毒素以及黄曲霉毒素B₁。

3 讨论 3.1 含水率对全株玉米FTMR感观的影响

饲料发酵过程中产生了有机酸，有机酸中的氢取代叶绿素中的镁原子而成为褐色的去镁叶绿素，导致饲料颜色逐渐变为褐色。研究表明，增加发酵袋膜层数可以显著提高发酵袋的气密性^[14]，提高饲料发酵品质。FTMR的水分含量直接影响到饲料发酵的质量，只有控制好水分含量，才能保证获得良好的发酵物并减少营养物质的损失^[15]。本次试验中，低含水率组可能因为水分含量太低抑制了发酵，酸味比高含水率组淡，其中含水率为45%、50%组的FTMR乳酸发酵程度更高，酸味更浓，这与国卫杰等^[5]的研究结果相一致。

3.2 含水率和发酵时间对全株玉米FTMR常规养分含量的影响

本研究表明，含水率对全株玉米FTMR的发酵品质存在明显影响。在发酵过程中，随着发酵时间增加，各组的水分含量呈现先快速上升后趋于稳定的趋势，其中55%组的水分含量变化最大。发酵前期，植物细胞受到机械压榨会排出可溶性碳水化合物，好氧微生物利用这些养分和内部的氧气进行繁殖代谢产生了水，再加上植物细胞的呼吸作用，从而使饲粮含水率升高，随着发酵时间的延长，氧气含量下降，好氧性微生物的活动减弱，乳酸菌适应厌氧环境，活动加强，其代谢产物为乳酸，因此使饲粮的水分含量逐渐趋于稳定^[16]。这与王加启等^[17]的报道基本一致。

CP是饲料中含氮物质的总称，包含各种必需氨基酸，是衡量发酵饲料饲用价值的重要指标^[18]。在整个发酵阶段，各组CP含量有一定的增加，这可能是因为新鲜全株玉米的CP主要是以束缚型的形式存在，而经过发酵之后多以氨基酸的形式存在，蛋白质虽被分解为氨基酸但实际上氮总量并没有减少，加上微生物的合成作用，使得总量有所增加^[19]。徐晓明等^[6]认为中、高含水率的FTMR可以使有害微生物的繁殖得到抑制，使得蛋白质的水解降低。另外，Bilal等^[20]研究得出，一些由蛋白质构成的细菌在发酵过程中不能生长繁殖，变成了饲料的一部分，也增加了CP的含量。

ADF含量由于含水率和发酵时间的增加而呈现递增的趋势，NDF含量在此试验过程中则呈现下降趋势。ADF含量升高其可能原因是水溶性碳水化合物的减少，以及大量干物质的损失使得营养物质含量会相对提高，进而使其含量增加。NDF含量的下降是由于发酵过程产生的有机酸和微生物酶的分解作用可能引起半纤维素的降解使其含量下降。由于不同含水率的FTMR中微生物的种类和数量不同，半纤维素的降解情况也不同。宁婷婷^[21]认为，不同水分含量发酵TMR半纤维素含量的损失情况与含水率有关，其中TMR含水率越高，其半纤维素含量降低幅度越大。整个发酵过程中，NDF含量逐渐下降，这与国卫杰等^[5]、陈雷^[22]、贾春旺等^[23]以及郝薇^[24]对发酵饲粮的研究结果一致。

各组Ash含量随着发酵时间的延长也相应的增多，这是由于在发酵过程中浸出液没有损失，虽然碳水化合物发酵使得干物质有所损失，但是相应增加了营养物质的含量。

3.3 含水率和发酵时间对全株玉米FTMR发酵指标的影响 3.3.1 含水率和发酵时间对全株玉米FTMR的pH的影响

对于常规青贮来说，pH是衡量发酵饲料品质好坏的重要指标之一，适宜的pH可抑制不良微生物的活动，又能降低VFA在青贮料中的含量^[25]，使有机酸处于合适的发酵范围并减少饲粮中营养物质的分解，可以较好的保存饲粮^[26]。但对于半干青贮来说，由于原料中微生物处于生理干燥和厌氧状态，发酵初期好氧微生物繁殖产酸过程要更长，同时乳酸菌在厌氧发酵过程中的生长繁殖也受到一定程度的抑制，乳酸菌繁殖缓慢，生成量只有常规青贮的一半，pH达到4.4~4.6时就可达稳定状态^[27]。另外，Meeske等^[28]认为青贮饲料的干物质含量较高时，pH为4.5左右的饲料仍具有良好的品质，Morgan等^[29]研究得出，青贮玉米的干物质含量提高至360 g/kg，乳酸菌活性被抑制，pH超出正常青贮饲料要求，但饲料仍能得到很好的保存。

本试验中，35%组pH最高，55%组pH最低。水分含量越低，物料酶的活性和微生物的增长率都会降低^[30]，低含水率组可能由于水分含量太低抑制了微生物发酵，所以pH略高，与郝薇^[24]、李成会等^[31]、孙合美等^[32]的研究结果基本一致。

3.3.2 含水率和发酵时间对全株玉米FTMR乳酸含量的影响

有机酸总量及其构成可以反映青贮发酵过程的好坏，乳酸是青贮饲料中最重要的有机酸，所占比例越大越好^[33]。饲料发酵过程中，发酵良好的青贮饲料乳酸含量一般占有机酸总量的60%以上，占干物质的3%~8%^[34]。本试验中，FTMR随着发酵时间的增加，各个发酵组的乳酸含量先急剧上升后缓慢上升，这是由于同型发酵乳酸菌(乳酸乳球菌、戊糖片球菌、琛肠球菌等)在厌氧发酵阶段迅速繁殖，产生大量的乳酸，随着发酵程度的减弱，发酵进入了稳定期，微生物代谢活动保持稳定。在不同含水率的影响下，随含水率的升高乳酸含量也升高，这与宁婷婷^[21]及郝薇^[24]通过测定不同水分含量发酵TMR中的乳酸含量，得出水分含量越高，乳酸含量越高的结论一致。而45%组具有较高的乳酸含量，可能是因为45%的水分含量更有利于乳酸菌的生长。

3.3.3 含水率和发酵时间对全株玉米FTMR的VFA含量的影响

乳酸和乙酸均由乳酸菌发酵产生，同型发酵乳酸菌将葡萄糖和果糖全部转化为乳酸，异型发酵乳酸菌除产生乳酸外, 还会产生乙酸、甘露醇、乙醇以及二氧化碳气体等成分，同型发酵能良好地降低饲料pH，减少干物质损失，提高饲料发酵品质，但有氧气进入发酵体系时，酵母菌和霉菌能利用发酵产物乳酸生长繁殖，从而引起饲料霉变或二次发酵^[35]。异型发酵降低饲料pH效果差，且产生的气体造成了一部分营养损失，但其产物乙酸能作为抑制微生物生长的因子，抑制发酵饲料中的酵母菌和霉菌的生长活动，从而提高饲料的有氧稳定性。

本试验中，乙酸和丙酸含量随发酵时间的增加而增加，但并超过干物质含量的2%，且只有在发酵的第10、20和30天检出丁酸，此后饲料发酵状况良好。

3.4 含水率和发酵时间对全株玉米FTMR霉菌毒素含量的影响

霉菌在青贮中属于好氧性的有害微生物，是引起饲料好氧变质的主要原因^[36]。饲料中对反刍动物危害严重的霉菌毒素主要包括玉米赤霉烯酮、呕吐毒素以及黄曲霉毒素。正常条件下，霉菌仅生存于饲料表层或边缘，发酵过程中的酸性环境和厌氧条件足以抑制霉菌的生长。Cao等^[37]对多种发酵的微生物组成进行研究，结果发现，霉菌仅存在于发酵过程的前期，多数情况下在整个发酵过程中检测不到霉菌的存在。在本试验中未检测到玉米赤霉烯酮、呕吐毒素以及黄曲霉毒素B₁，说明饲粮发酵品质良好。

4 结论

在本试验的条件下，全株玉米FTMR的适宜含水率为45%和50%，发酵时间以大于40 d为宜。