前人研究结果表明,肠道菌群对胃肠道屏障功能、胃肠道发育、肠道神经系统功能和肠道免疫功能等诸多方面产生重要的影响[1-5]。肠道菌群中的厚壁菌门和拟杆菌门占到菌群数量的70%~75%[6-7],并对健全动物肠道功能和平衡生理健康中起到重要作用。芽孢杆菌属于厚壁菌门类,能黏附在猪胃肠道中并与宿主产生良好共生关系[8]。解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)作为芽孢杆菌属,在其培养过程中能产生多种抑制其他真菌和细菌活性的代谢产物[9-10]。伴随全基因组测序工作飞速发展,关于解淀粉芽孢杆菌抑菌基因和抑菌机理的研究正在逐渐深入[11]。解淀粉芽孢杆菌的部分代谢产物对食源性病原体有抑制作用,提示其在益生菌添加剂开发领域的应用前景。本文旨在就解淀粉芽孢杆菌产生抑菌物质、抑菌机理及其在养猪业生产应用方面进行综述。
1 解淀粉芽孢杆菌产生的主要抑菌物质解淀粉芽孢杆菌属革兰氏阳性菌,与枯草芽孢杆菌具有较近的亲缘关系[12]。解淀粉芽孢杆菌可从土壤、植物和部分畜禽肠道分离培养[13-15]。2007年,解淀粉芽孢杆菌FZB42全基因组测序的公布,使其产生抗菌物质的相关研究逐步深入。大量研究显示,解淀粉芽孢杆菌的次级代谢产物含有多种抑制动植物病原菌的物质[16-21],主要包括具有抑菌作用的小肽和蛋白类、聚酮类化合物和非核糖途径形成的脂肽类等。
1.1 小肽和蛋白类Herzner等[22]发现解淀粉芽孢杆菌FZB42可产生的羊毛硫抗生素,是一种含有硫醚氨基酸和甲基羊毛硫氨酸的小肽类抗生素。羊毛硫抗生素对部分食源性病原菌有抑制作用,例如李斯特菌、金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌。Kim等[23]结合硫酸铵沉淀、液相色谱和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)等方法,从解淀粉芽孢杆菌MET0908的发酵产物中分离出一种可以抑制刺盘孢菌的蛋白,该蛋白在80 ℃高温条件下处理20 min后仍具有抑菌效果。Alfonzo等[24]从解淀粉芽孢杆菌AG1菌株的发酵液中分离一种对葡萄孢致病真菌有拮抗作用的抗菌肽,相对分子质量为2 510~3 480,具有一定耐热、酸碱稳定性。Lee等[25]从发酵大豆制品中分离出的解淀粉芽孢杆菌CH86-1具有较强的溶解纤维蛋白能力,采用串联质谱法分离提纯其中的纤维蛋白酶——AprE86-1。解淀粉芽孢杆菌中编码AprE86-1蛋白酶的相关基因与枯草芽孢杆菌具有较高同源性[26],且从微生物中提取的纤维蛋白酶在动物体内具有血栓溶解作用[27]。
1.2 聚酮类化合物Goodson等[28]证实解淀粉芽孢杆菌能够产生聚酮类化合物并探究了其可能机制。聚酮类化合物是由脂肪酸在聚酮合酶(polyketide synthase, PKS)催化下经过类似长链脂肪酸合成途径生成的,是一类结构多样化和生物活性多样化的天然产物。Chen等[29]在植物相关解淀粉芽孢杆菌的研究表明,其产生2种具有生物活性的聚酮类化合物[地非西丁(difficidin)和杆菌溶素(bacilysin)]在防治植株火疫疾病上有作用。现已证实这2种聚酮类化合物的合成是通过在解淀粉芽孢杆菌FZB42的PKS-3基因簇编码聚酮合成酶复合体催化完成。
1.3 脂肽类抑菌物质脂肽类物质是解淀粉芽孢杆菌产生的主要抗菌物质之一,例如表面活性素(surfaction)、伊枯草菌素(iturin)和丰原素(fengycin)等[17, 21, 30-31]。桑建伟等[32]通过PCR检测解淀粉芽孢杆菌BEB17与脂肽类化合物合成相关的多个基因,结合基质协助激光解吸附离子化-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和液相色谱-质谱联用分析,发现了该菌株能产生表面活性素、泛革素和伊枯草菌素3类脂肽类化合物。Arrebola等[33]报道伊枯草菌素A是解淀粉芽孢杆菌PPCB004发挥抑制真菌作用的主要成分。Chen等[34]从深海沉积物中分离的1株解淀粉芽孢杆菌SH-B10,研究发现了2种具有抗真菌的脂肽类:丰原素A和6-Abu丰原素。向亚萍等[35]利用特异性引物对解淀粉芽孢杆菌B1619中3种脂肽类抗生素合成相关基因——表面活性素、伊枯草菌素A和丰原素B进行检测,通过盐酸沉淀、甲醇抽提法等方法得到脂肽类抗生素粗提物。
2 解淀粉芽孢杆菌抑菌机理近年来,国内外研究发现,解淀粉芽孢杆菌的抑菌机制主要包括产生拮抗作用和溶菌作用等方面。
2.1 拮抗作用拮抗作用是通过微生物形成一个不利于病原菌生长的环境条件而间接抑制病原菌的生长,微生物可通过分泌次级代谢产物抑制病原菌生长。例如解淀粉芽孢杆菌通过产生抗生素、细菌素、细胞壁降解酶类和其他抗菌蛋白及挥发性抗菌物质等抗菌成分来抑制病原菌生长繁殖,而其本身不受影响。Stöver等[36]研究发现,解淀粉芽孢杆菌YN-1菌株代谢产物中含有广谱抑菌活性蛋白TasA,可竞争性抑制其他革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的生长。王选等[37]以痢疾杆菌菌株作为病原指示菌,从健康青年牛的粪便中,分离出对痢疾杆菌具有拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌株。解淀粉芽孢杆菌在动物肠道中可通过与病原菌竞争宿主细胞黏附位点,来影响病原菌在肠上皮细胞的定植能力[38]。解淀粉芽孢杆菌在代谢产物中含有机酸,维持偏酸性的胃肠道环境,间接影响潜在致病菌侵染肠上皮细胞,改善肠道健康[39]。
2.2 溶菌作用溶菌作用是解淀粉芽孢杆菌代谢产生的溶菌物质能使菌丝裂解及细胞质消解,或溶解细胞壁和细胞膜。程敏等[40]通过扫描电镜观察,同时结合其他研究者对芽孢杆菌抑制真菌的机制成果推测,得出结论:解淀粉芽孢杆菌及其代谢物对病原菌的抑制作用主是通过破坏菌丝和孢子细胞壁和细胞膜,使细胞内原生质的泄露,导致菌丝和孢子萎缩,使细胞代谢无法正常进行,最终杀死病原菌细胞。有研究报道表明,表面活性素具有极强的生物表面活性剂特性,对真菌、细菌甚至病毒都有良好的抑制效果,在芽孢杆菌次级代谢产物中,表面活性素和伊枯草菌素可通过改变细胞膜通透性,破坏病原菌细胞膜结构而引起细胞死亡[41]。曹广添[38]研究表明, 解淀粉芽孢杆菌的上清中的脂肽类抑菌物质主要通过破坏病原菌的细胞膜来发挥其杀菌作用,试验显示其成分中含有为伊枯草菌素和表面活性素等。付瑞敏等[42]将解淀粉芽孢杆菌BA-16-8所产丰原素和多烯类抗真菌化合物纳他霉素分别与病原菌DNA进行体外结合,结果表明丰原素的抑菌作用除改变病原菌细胞膜通透性以外,还可进入细胞内部作用于核酸,抑制DNA合成和影响其他细胞器的生理作用。
3 解淀粉芽孢杆菌在养猪业中应用解淀粉芽孢杆菌具有抗逆性强、广谱抑菌活力、代谢产物丰富等特点,作为益生菌添加在饲料中,通过抑制病原菌黏附、生物夺氧、拮抗病原菌以及分泌多种消化酶等,营造健康肠道环境,促进饲料转化效率,提高生猪生产水平。Ji等[43]研究发现, 解淀粉芽孢杆菌SC06可通过影响仔猪肠上皮细胞中丝裂原活化蛋白激酶信号传导途径缓解肠毒性大肠杆菌K88诱导的促炎症反应,改善仔猪肠黏膜物理和免疫屏障功能,提示了饲粮中添加解淀粉芽孢杆菌SC06能缓解仔猪腹泻,促进仔猪生长。在育肥猪饲粮中添加解淀粉芽孢杆菌能显著提高小肠绒毛膜高度,增强肠道中厚壁菌门优势地位,有效抑制部分革兰氏阴性致病菌感染,促进肠道微生态平衡,改善肠道微生物屏障功能,促进育肥猪肠道健康[44]。沈勇涛[45]研究发现, 在妊娠母猪饲粮中添加1×107 CFU/g解淀粉芽孢杆菌可改善母猪肠道微生态环境,通过母猪微生态的改善可以影响仔猪肠道微生态,并对初生仔猪建立肠道微生态环境平衡有促进作用,从而提高仔猪生长性能。宁豫昌等[46]从猪肠道内容物中筛选出解淀粉芽孢杆菌MY-6,该菌株能够产生胞外中性丝氨酸蛋白酶,该蛋白酶对于玉米蛋白、大豆蛋白和鱼粉蛋白均有较好的水解能力,尤其是对于内源性蛋白酶分泌不足的断奶仔猪而言,额外补充蛋白酶能够提高饲料转化率,减少营养性腹泻的发生。
4 小结芽孢杆菌属菌种具有在恶劣条件下形成孢子且可在猪肠道中定植,形成菌膜,分泌抑菌代谢产物等特点,可作为益生菌添加剂应用于生猪产业。解淀粉芽孢杆菌与其他芽孢杆菌具有很多共同之处,随着分子生物学的发展,证实了解淀粉芽孢杆菌同样具备开发为益生菌添加剂的潜力。近年来,有学者发现断奶仔猪和育肥猪饲粮中添加解淀粉芽孢杆菌饲料后可以改善其肠道免疫功能,提高饲料转化率。此类研究提示了解淀粉芽孢杆菌在养猪业中作为益生菌的开发价值,对提高猪的肠道健康具有一定意义。目前,国内外针对解淀粉芽孢杆菌应用于养猪业生产的相关研究并不多,不同来源的解淀粉芽孢杆菌菌株的稳定性、安全性以及有效性还尚不明确。针对解淀粉芽孢杆菌在猪肠道微生态环境中的次级代谢产物代谢与宿主互作机制和促进猪的生长机理的研究还有待深入。
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