仔猪早期断奶会引起免疫抑制、代谢紊乱(比如脂代谢紊乱)、肠胃功能紊乱(腹泻)和生长性能下降[1-2]。研究人员发现，抗生素和高锌能有效缓解仔猪的断奶应激。但是，抗生素会导致细菌耐药性，对人体健康和环境也有一定影响[3-4]；高剂量的锌添加到动物饲粮中不容易被消化，从而通过粪便排出，加重环境污染[5]。目前，多个国家对饲粮中的锌剂量已经出台政策限制。因此，如何合理使用锌以及寻找代替抗生素替代品已成为如今研究热门。据已知的方法，使用纳米氧化锌是一种可替代氧化锌的方法。研究表明，纳米氧化锌比传统氧化锌对仔猪断奶应激更有效果[6]。与传统氧化锌对比，纳米氧化锌更容易吸收并且吸收快，而且能够提高断奶仔猪日增重、降低腹泻率[7]。此外，王彬等[8]发现，仔猪饲粮中添加纳米氧化锌能够增加其血清高密度脂蛋白(HDL)含量，促进脂代谢。凹凸棒土，简称凹土，于2011年正式被允许添加到饲料中[9]，有着无毒、无味、无刺激性以及廉价易得的特点。凹土的表面呈多孔状、比表面积大，并且有阳离子可交换的特性，此外对部分阳离子、抗生素等具有良好的吸附效果[10-13]。
肝脏是动物体内重要的中枢器官，参与机体的能量代谢，与动物整体健康有着密切关系，此外肝脏也是重要的免疫器官。而仔猪早期断奶会引起免疫抑制和代谢紊乱，所以仔猪的肝脏脂代谢和肝脏免疫功能的研究很有必要。在我们前期的研究中发现，在饲粮中添加适量凹土纳米氧化锌可提高断奶仔猪生长性能，降低其腹泻率；显著降低血清甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)含量，提高血清HDL含量，能够促进脂肪代谢[14]。本文在前期研究饲粮添加凹土纳米氧化锌对断奶仔猪血清生化指标和器官指数的影响基础上，进一步研究凹土纳米氧化锌对断奶仔猪肝脏脂代谢以及免疫功能的影响，并与添加抗生素的试验组效果进行对比，从而为纳米氧化锌与凹土的结合体作为绿色新型健康饲料添加剂提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 试验设计本试验选取21日龄体重相近[(6.30±0.51) kg]的健康“杜×长×大”断奶仔猪210头(由苏州市太仓金诸农业发展有限公司提供)，随机分成7组，分别为对照组(CON组，基础饲粮)、抗生素组(ANT组，基础饲粮+100 mg/kg 50%喹乙醇+150 mg/kg 15%金霉素+50 mg/kg 10%硫酸黏菌素)、氧化锌组(ZO组，基础饲粮+3 000 mg/kg氧化锌)、纳米氧化锌组(NZO组，基础饲粮+800 mg/kg纳米氧化锌)、低凹土纳米氧化锌组(LA-ZO组，基础饲粮+700 mg/kg凹土纳米氧化锌)、中凹土纳米氧化锌组(MA-ZO组，基础饲粮+1 000 mg/kg凹土纳米氧化锌)和高凹土纳米氧化锌组(HA-ZO组，基础饲粮+1 300 mg/kg凹土纳米氧化锌)。预试期3 d，正试期9 d。试验基础饲粮参照NRC(2012)仔猪营养需要标准并结合生产实践配制，其组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
本试验所用氧化锌(白色粉末状)、纳米氧化锌(白色粉末状，纯度≥99%，平均粒径45 nm)和凹土纳米氧化锌(凹土纳米氧化锌由80%纳米氧化锌和20%凹凸棒土组成。LA-ZO组：560 mg/kg纳米氧化锌+140 mg/kg凹凸棒土；MA-ZO组：800 mg/kg纳米氧化锌+200 mg/kg凹凸棒土；HA-ZO组：1 040 mg/kg纳米氧化锌+260 mg/kg凹凸棒土。纳米氧化锌理化特性同上；凹土主要成分为硅酸盐，双层链状结构，纯度为85%，由扬州大学化工学院提供；50%喹乙醇、15%金霉素、10%硫酸黏菌素由扬州大学饲料厂提供(本试验所用硫酸黏菌素和喹乙醇使用时间符合中华人民共和国农业部公告中使用标准，且以上材料仅限于试验研究使用，旨在替代抗生素的使用)。
1.3 样品采集试验结束进行采样，采样前12 h停止饲喂，每个重复随机选取2头断奶仔猪进行称重，然后使用二氧化碳(CO2)让仔猪窒死，打开仔猪腹腔，采集肝脏组织并存贮于2 mL冻存管。随后样品保存于液氮中，后移至-80 ℃保存待测。
1.4 测定指标及方法 1.4.1 脂代谢相关指标测定从-80 ℃中取出肝脏样品，称取约260 mg肝脏样品，按1 : 9(质量体积比)比例加入生理盐水制成匀浆，随后混匀离心(3 000 r/min，10 min)，收集的上清液用二喹啉甲酸(BCA)法测总蛋白(TP)含量，再用试剂盒测定TC、TG、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量。测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，严格按照试剂盒说明书操作规程执行。
1.4.2 细胞因子含量测定从-80 ℃中取出肝脏样品，称取约260 mg肝脏样品，按1 : 9(质量体积比)比例加入生理盐水制成匀浆，随后混匀离心(3 000 r/min，10 min)，收集的上清液待测。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测肝脏中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-4(IL-4)和白细胞介素-10(IL-10)的含量，通过标准曲线计算不同样品中的细胞因子含量。试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，严格按照试剂盒说明书操作规程执行。
1.4.3 细胞因子和脂代谢相关基因表达测定从-80 ℃取出肝脏样品，使用TRNzol提取样品的总RNA，测定纯度(Applied BiosystemsTM 7500)，RNA质量通过琼脂糖凝胶电泳鉴定。将合格的RNA反转录为cDNA，存放于-80 ℃中待测，具体方案根据TaKaRa试剂盒说明书(TaKaRa RR047A)进行。通过NCBI PubMed得到所需引物，引物序列见表 2。特异性引物由金维智生物科技有限公司(GENEWIZ，苏州)合成。以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参，对目的基因进行相对定量分析。使用2-ΔΔCT方法计算目的基因的相对表达量。反转录和荧光定量试剂盒均购于TaKaRa生物技术有限公司，操作步骤严格按照说明书执行。
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表 2 引物序列 Table 2 Primer sequences |
数据经Excel 2010软件初步处理，再用SPSS 19.0对试验数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan氏法进行多重比较，以P < 0.05为差异显著，0.05≤P＜0.10为有显著趋势。
2 结果与分析 2.1 凹土纳米氧化锌对断奶仔猪肝脏细胞因子含量的影响由表 3可知，LA-ZO组仔猪肝脏中TNF-α含量显著低于ZO、MA-ZO和CON组(P < 0.05)；相比CON和NZO组，LA-ZO和MA-ZO组仔猪肝脏中IL-4含量显著提高(P < 0.05)；且相比CON组，LA-ZO、MA-ZO和HA-ZO组仔猪肝脏中IL-1β含量有下降的趋势(0.05≤P < 0.10)。
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表 3 凹土纳米氧化锌对断奶仔猪肝脏细胞因子含量的影响 Table 3 Effects of attapulgite nano zinc oxide on cytokine contents in liver of weaned piglets |
由表 4可知，NZO和LA-ZO组仔猪肝脏中TNF-α的表达量显著低于CON组(P < 0.05)；此外，NZO、LA-ZO、MA-ZO和HA-ZO组仔猪肝脏中IL-4的表达量相对CON组有提高的趋势(0.05≤P < 0.10)。
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表 4 凹土纳米氧化锌对断奶仔猪肝脏中细胞因子相关基因表达的影响 Table 4 Effects of attapulgite nano zinc oxide on related gene expression of cytokines in liver of weaned piglets |
由表 5可知，LA-ZO和MA-ZO组仔猪肝脏中LDL-C含量显著低于CON和ANT组(P < 0.05)，LA-ZO和NZO组仔猪肝脏中TC含量显著低于CON、ANT和ZO组(P < 0.05)，其余脂代谢产物含量各组间没有显著差异(P>0.05)。
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表 5 凹土纳米氧化锌对断奶仔猪肝脏中脂代谢产物含量的影响 Table 5 Effects of attapulgite nano zinc oxide on lipid metabolite contents in liver of weaned piglets |
由表 6可知，LA-ZO、MA-ZO和ANT组仔猪肝脏中脂肪酸合成酶(FAS)表达量显著低于CON、ZO和NZO组(P < 0.05)；且LA-ZO组仔猪肝脏中激素敏感脂肪酶(HSL)表达量显著高于CON、ANT和ZO组(P < 0.05)。
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表 6 凹土纳米氧化锌对断奶仔猪肝脏中脂代谢相关基因表达的影响 Table 6 Effects of attapulgite nano zinc oxide on related gene expression of fat metabolism in liver of weaned piglets |
肝脏是动物体内重要的器官，对动物的免疫功能起到重要的作用。前人研究发现肝脏具有特殊的免疫环境，其中含大量的免疫细胞对于外来的病毒或者毒素等通过免疫应答来清除[15]。此外，肝脏能够分泌多种细胞因子，通过控制炎症因子的动态平衡来维持的或者增强机体非特应性免疫防御[16]。根据细胞因子的功能可以分为抗炎细胞因子和促炎细胞因子[17]。TNF-α和IL-1β已被证实是促炎细胞因子[18]；IL-4和IL-10是通过Toll样受体4(TLR4)、核因子-κB(NF-κB)和其他信号通路调节免疫反应以维持肠道健康的抗炎因子[19-20]。本文试验结果发现，在断奶仔猪饲粮中添加700 mg/kg凹土纳米氧化锌，肝脏中促炎细胞因子TNF-α含量显著低于ZO组和CON组；同时相比CON和NZO组，LA-ZO和MA-ZO组肝脏中抗炎因子IL-4含量显著提高；LA-ZO、MA-ZO和HA-ZO组肝脏中的促炎因子IL-1β含量较对照组有下降的趋势。此外，Hu等[21]研究发现，生物机体的炎症因子的动态平衡失调是腹泻发生的重要原因。我们前期研究发现饲粮中添加凹土纳米氧化锌可以显著降低断奶仔猪的腹泻率[14]，这可以佐证凹土纳米氧化锌能够促进肝脏促炎因子含量下降，并且使得抗炎因子含量上升，提高仔猪肝脏免疫功能，并且不会打破机体内Th1/Th2平衡。
Roselli等[22]研究发现，氧化锌能够下调炎症因子TNF-α的表达，从而缓解产肠毒素大肠杆菌(ETEC)感染细胞的炎症情况。Chen等[23]的研究结果表明，凹土能够通过下调TLR4通路中IL-1β和干扰素-γ(IFN-γ)的mRNA表达，进而提高断奶仔猪的肠道免疫功能。本试验中，在断奶仔猪饲粮中添加纳米氧化锌和700 mg/kg凹土纳米氧化锌，肝脏中促炎因子TNF-α的表达量显著低于CON组，这与Roselli等[22]的研究结果相吻合。Hu等[24]研究也表明，利用沸石负载氧化锌饲喂断奶仔猪，在断奶后第7天降低了空肠黏膜中TNF-α和IFN-γ的mRNA表达水平，缓解了仔猪断奶应激。根据研究报道，饲粮中添加100 mg/kg剂量纳米氧化锌促进爱拔益加(AA)肉鸡白细胞介素-6(IL-6)的基因表达[25]。本试验结果发现，饲粮中添加纳米氧化锌和凹土纳米氧化锌，仔猪肝脏中抗炎因子IL-4的表达量相对CON组有提高的趋势，这与前人的试验结果相类似。此外，肝脏中细胞因子TNF-α和IL-4的含量与其基因表达的结果相吻合，这更一步证明凹土纳米氧化锌能够促进仔猪肝脏免疫。此外，在本试验中，相对ZO组，LA-ZO组肝脏的促炎因子TNF-α含量以及TNF-α表达量显著下降。这些结果暗示了饲粮中添加凹土纳米氧化锌对断奶仔猪肝脏免疫提高的效果更佳。
3.2 凹土纳米氧化锌对断奶仔猪肝脏脂代谢的影响肝脏是能量代谢的中枢器官，在脂肪生成、糖异生和脂质分解代谢中起重要作用[26]。事实上，能量和脂质代谢之间的平衡在维持肝功能方面很重要[27]。脂质代谢与整体健康密切相关，它还为整个生物体提供能量生成基质[28]。因此，肝脏是研究机体脂代谢的合适靶器官，通过肝脏中脂代谢产物含量以及相关基因表达的变化可以了解机体脂代谢情况。TC是一种能够合成多种类固醇的脂，机体内TC的含量能够反映动物对脂质的代谢和吸收状况[29]，而LDL-C被认为是导致心血管疾病的重要因素[30]，当TC和LDL-C的含量升高时会大大提高动物机体心血管疾病的发生。有研究表明，纳米氧化锌对动物的脂代谢有影响[31]。在我们前期的研究发现，饲粮中添加凹土纳米氧化锌可显著降低血清中TC和TG的含量，提高血清中HDL的含量，一定程度上促进脂代谢。本试验中，饲喂700 mg/kg凹土纳米氧化锌和800 mg/kg纳米氧化锌能够有效降低断奶仔猪肝脏中TC和LDL-C含量，这进一步佐证纳米氧化锌和凹土纳米氧化锌能够降低促进仔猪肝脏脂代谢，与我们前期的研究结果相符合。
王福[32]研究发现，高锌能够促使仔猪肝脏脂代谢，并且上调了肝脏硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)的转录水平。有研究报道，FAS促进脂肪酸的合成，脂肪酸可被酯化成甘油三酯，可能导致动物体内脂肪沉积，FAS的表达与体内脂肪合成和脂质浓度密切相关[33-34]。熊文中等[35]研究发现，FAS与胴体和体脂以及猪脂肪组织中胴体脂肪的百分比有关。HSL在许多器官中表达，例如脂肪组织、肾上腺、肝脏、心脏、平滑肌和骨骼肌，并且在脂肪组织和心脏中具有最高活性。它是影响体脂代谢的关键酶和限速酶[36-37]。HSL对动物脂肪沉积和瘦肉率有重要影响[38]。本试验结果中，饲喂添加700 mg/kg凹土纳米氧化锌的仔猪肝脏FAS表达量显著下降，HSL表达量显著上升，这证明凹土纳米氧化锌能够降低仔猪体内脂肪沉积，促进脂代谢。前人研究报道，当FAS表达量上升的时候，猪体内TG含量会显著增加，体内沉积而肥胖[35]。在我们前期的研究中，饲粮添加700 mg/kg凹土纳米氧化锌显著降低仔猪血清中TG含量[14]，且本试验中FAS表达量下降与前人研究相吻合。本试验中，LA-ZO组肝脏TC含量和FAS表达量显著低于ZO组，而HSL表达量显著高于ZO组；同时LA-ZO组肝脏FAS表达量显著低于NZO组。这代表了饲粮中添加凹土纳米氧化锌对断奶仔猪脂代谢的改善优于ZO组和NZO组。这也有可能因为凹土具有很好的控释性，有利于仔猪对锌的吸收从而影响仔猪肝脏脂代谢。
综合本试验结果，凹土纳米氧化锌对断奶仔猪肝脏免疫以及脂代谢具有促进作用，同时与我们前期研究可知，饲粮中添加凹土纳米氧化锌能够促进脂代谢，促进生长，降低仔猪腹泻率等[14]。因此，我们推测凹土纳米氧化锌能够提高了仔猪对外界的病毒等免疫能力以及肝脏的代谢功能，从而改善了仔猪断奶早期生长，提高仔猪机体的健康状况。在本试验中添加700 mg/kg凹土纳米氧化锌效果最佳，但是在本试验中其为最低添加量，那么更低添加量是否能够也有相同饲喂效果，需要我们进一步的试验探究。此外，由于动物机体内环境情况复杂，凹土纳米氧化锌是改善仔猪肝脏免疫和脂代谢的关键因素之一，其对断奶仔猪的具体作用仍需要进一步地研究。
4 结论饲粮中添加凹土纳米氧化锌可显著提高断奶仔猪肝脏中IL-4含量，降低TNF-α的含量及mRNA表达量；同时还能够降低肝脏中TC和LDL-C的含量，降低FAS表达量，提高HSL表达量，从而改善仔猪肝脏免疫功能, 促进脂代谢。由本试验结果可得，断奶仔猪饲粮中添加700 mg/kg凹土纳米氧化锌一定程度上有利于断奶仔猪肝脏免疫功能和脂代谢。
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