2. 河北农业大学动物医学院, 保定 071001;
3. 福成五丰食品有限公司, 三河 065200
2. College of Animal Medicine, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, China;
3. Fucheng Wufeng Food Co., Ltd., Sanhe 065200, China
随着社会经济的快速发展和国民收入水平的提高，牛肉的需求量呈快速增长态势[1-3]。在牛肉市场的带动下肉牛养殖规模化比例不断增长，由此带来的环境问题日趋显现，不仅包括粪污处理问题，还有如二氧化碳、甲烷等温室气体浓度的增加所导致的温室效应[4-5]。2009年丹麦哥本哈根世界气候大会明确提出了温室效应引起的气候恶化已成为21世纪全球面临的最严重挑战之一，如何减少温室气体的排放，共同保护我们赖以生存的家园是当今全世界的共同课题[6]。甲烷是大气中温室气体的重要组成部分，所占比例仅次于水蒸气和二氧化碳，其全球变暖的潜力是二氧化碳的25倍，严重破坏了大气臭氧层[7]。牛、羊等反刍动物产生的甲烷约占大气中甲烷排放总量的15%，其中肉牛甲烷排放量占到所有牛总排放量的64%[8-10]。除了环境问题，甲烷的产生也会伴随着饲料能量的浪费(2%~15%)。因此，减少反刍动物的甲烷排放对保护环境和提高饲料能量利用率具有双重意义[11-12]。
影响反刍动物甲烷排放的因素很多，包括饲粮精粗比、油类、脂肪酸、卤族化合物等[13]。在实际生产中，除了离子载体外并没有其他有效的甲烷抑制剂可供利用，然而出于食品安全方面的考虑，抗生素在动物营养中的应用日益受到限制，利用饲喂策略和生物措施抑制甲烷生成引起了人们的广泛关注[12]。研究表明，饲粮中添加脂类物质可以有效抑制甲烷的产生[14-16]。我国作为棉花种植大国之一，2016年棉花产量为534.3万t，全棉籽产量约为347.3万t。由于全棉籽中含有16.4%的脂肪，其中不饱和脂肪酸占70%。因此全棉籽具有降低甲烷排放的潜力。Grainger等[17]研究发现，用含全棉籽饲粮饲喂奶牛12周以后，减少了奶牛甲烷气体的排放。而王平[18]、荆元强[19]和刘建雷等[20]只研究了含全棉籽饲粮对肉牛和绵羊瘤胃发酵相关指标的影响，没有探讨对甲烷排放的影响，且研究结果不尽一致。国内外关于全棉籽对肉牛甲烷排放、瘤胃微生物区系及碳代谢相关基因表达方面的研究还未见报道，有待进一步研究。本课题组前期研究了全棉籽饲粮对荷斯坦公牛育肥性能、血液生化指标和养分消化率的影响[21], 本试验将进一步研究饲粮中添加不同比例全棉籽对荷斯坦公牛瘤胃发酵与微生物区系、甲烷排放及肝脏碳代谢相关基因表达的影响，探讨全棉籽影响荷斯坦公牛生长和甲烷生成的机理。
1 材料与方法 1.1 试验时间与地点试验于2016年12月至2017年3月在保定市满城县宏达牧业有限公司进行。
1.2 试验材料试验用全棉籽购于新疆喀什，其粗蛋白质含量为23.39%，粗脂肪含量为16.40%，中性洗涤纤维含量为54.89%，酸性洗涤纤维含量为39.84%，钙含量为0.26%, 磷含量为0.63%，游离棉酚含量为0.04%~0.05%。
1.3 试验动物与试验设计试验采用单因素完全随机区组设计，将44头健康、膘情正常、体重[(286±52) kg]相近的荷斯坦公牛，随机分为4组，每组11头，采用散栏饲养。Ⅰ(对照组)、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组公牛分别饲喂含有0、5%、10%和15%全棉籽的饲粮，各组饲粮能量和粗蛋白质水平基本相同，其组成及营养水平见表 1。预试期7 d，预试期结束后再进行1次空腹称重，适当调整试验牛，做到各组牛的平均体重差异不显著(P>0.05)，并以此作为正式试验的初始体重，正试期90 d。
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表 1 饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of diets (DM basis) |
试验牛采用全混合日粮(TMR)饲喂，按组散栏饲养，牛只自由活动。试验期内每日饲喂2次(07:00和18:00)，自由饮水。牛舍每天清扫、清粪，每半月消毒1次，保持牛舍内外的干燥和卫生。
1.5 六氟化硫(SF6)渗透管及牛轭的制备[22] 1.5.1 SF6渗透管的制作1) 制备材料包括液氮罐、扳子、冰袋、SF6气体、渗透管体、管帽、钢网、黑色密封垫、聚四氟乙烯膜等。在饲养试验前3个月开始，制备完成66个渗透管，渗透管由管体、螺帽、圆形钢网、O型密封垫、聚四氟乙烯膜构成。
2) 将组装好的66个渗透管放入液氮中，待管体温度与液氮温度一样时，取出并向渗透管中迅速充入SF6气体，当管壁结晶不再增多时，迅速将管帽封闭严实。并且将充入气体的渗透管放置室温后称重，气体重量大于1 g，即为合格的SF6渗透管。
3) 将合格的SF6渗透管投放到已准备好的恒温水浴槽中，温度设定值为39 ℃，并通入40 mL/min流量的氮气。
4) 按时称量并仔细记录好渗透管的重量，一般隔3 d称量1次。
5) 将最终选定的12个渗透管(P1~P12)数据做线性回归分析(图 1)。
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图 1 SF6渗透管重量与SF6渗透管制成天数的关系 Fig. 1 Relationship between weight and made days of SF6 permeation tube |
选择充入SF6较多的以及释放速率稳定的SF6渗透管，一般来说，当渗透管中SF6气体的剩余量低于170 mg时，释放速率将不再稳定。试验结束时管中剩余气体的量的计算方法如下:
试验结束时剩余的SF6重量(mg)=渗透管投放时剩余的SF6重量(mg)-SF6的渗透速率(mg/d)×渗透管投放天数(d)。
根据对SF6渗透管的选择规定，选出12个合格的SF6渗透管备用，每个SF6渗透管的渗透速率均大于3.0 mg/d，表 2为最终选出的12个SF6渗透管的数据。线性模型见表 3。
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表 2 所选择的SF6渗透管的相关数据 Table 2 Related data of selected SF6 permeation tubes |
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表 3 SF6渗透管渗透速率模型 Table 3 Penetration rate model of SF6 permeation tubes |
牛轭主要是由三型聚丙烯管(PPR)管根据牛的大小，经过截取、热熔机链接等程序制作而成。牛轭制作好后将提前准备好的二通阀(B-14DKM4-S4-A)拧到牛轭上，最后检测其是否合格。采气装置主要由聚四氟乙烯(PTFE)粗管(PFR-T4-047-100)、快插插套(SS-QC4-B-400)、快插插头(SS-QC4-S-200)、四氟乙烯(PTFE)细管(PFR-T2-030-100)、接头(B-200-6-1)、毛细不锈钢管[美国Vici公司，外径1/16 in(1 in=2.54 cm), 内径1/200 in]以及过滤器(B-2F-15)顺次连接制成，制成后再将采气装置固定到公牛的笼头(笼头是指套在牛头上的用来系缰绳挂嚼子的用具，用绳子做成)上。以上部件中牛轭和笼头为本实验室制作，其他部件购于美国Swagelok公司。
1.6 样品的采集与处理 1.6.1 瘤胃液的采集与处理在试验结束前1周，每组选取5头牛，在晨饲2.0 h后，将瘤胃管的一端伸入到牛的瘤胃中进行瘤胃液的采集，每头牛约抽取150.0 mL，并马上用4层无菌粗纱布过滤后收集滤液，分装于10 mL的离心管中，用于测定瘤胃液中各项指标，包括pH，氨态氮(NH3-N)、微生物蛋白(MCP)、挥发性脂肪酸(VFA)浓度及微生物区系。瘤胃液pH现场立即用酸度计测定，测定瘤胃微生物区系的瘤胃液-80 ℃保存，其他瘤胃液置于-20 ℃保存(在用于测定NH3-N浓度的瘤胃液中加入0.1 mL 6 mol/L的盐酸进行固氮)。
1.6.2 气体的采集与处理试验采用SF6示踪气体色谱法测定反刍动物甲烷排放量[23]。于试验结束前20天，每组选出3头生长发育正常、食欲良好、健康的荷斯坦公牛，将已知渗透速率的SF6渗透管投放进牛的瘤胃中，在试验结束前3天进行气体采样，记录好每天采样的开始时间和结束时间，要经常检查设备是否完好无损，确保气体的纯度，收集24 h以后及时更换牛轭。同时，每天收集1管牛舍周围的气体，用于校正甲烷和SF6的浓度。
1.6.3 肝脏的采集与处理在试验结束时，每组选取4头牛，采用活体肝脏取样器(武汉市科立博器材有限公司产品)采集肝脏样品。在荷斯坦公牛的右侧倒数第2~3肋间，肩关节至骼结节中间位置连线的交叉点上，用活体肝脏取样器采取肝组织数次，共采集4 g左右，取出后用生理盐水冲洗干净，将其用无菌剪刀分成2份，一部分置于0.5 mL离心管中加入RNA保存液，另一部分用锡箔纸包好后分装于已标记好的纱布袋中，并立刻放入液氮冻存，随后在-80 ℃超低温冰箱中保存。
1.7 测定的指标及方法 1.7.1 营养成分含量的测定全棉籽和饲粮中粗脂肪、钙和磷含量分别按照国家标准GB/T 6433—2006[24]、GB/T 6436—2002[25]、GB/T 6437—2002[26]中方法进行测定；中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量分别按照国家标准GB/T 20806—2006[27]和农业行业标准NY/T 1459—2007[28]中方法，使用全自动纤维仪(ANKOM-A2000i，美国)进行测定；粗蛋白质含量按照国家标准GB/T 6432—1994[29]中方法，使用全自动凯氏定氮仪(FOSS-8400，丹麦)进行测定。
1.7.2 瘤胃发酵参数的测定瘤胃液pH用UB-7型精密仪测定；采用靛酚蓝比色技术[30]测定瘤胃液NH3-N浓度；采用差速离心法和凯氏定氮法[31]测定瘤胃液MCP浓度；利用Agilent 7890A气相色谱检测仪，采用外标分析法[32]测定瘤胃液VFA浓度。
1.7.3 瘤胃微生物区系的测定分别对细菌16S V4区和古菌的18S V4区进行高通量测序，由北京诺禾致源科技有限公司完成。对测序得到的原始数据进行拼接、过滤后即为有效数据(clean data)，然后对有效数据进行操作分类单元(OTU)聚类和物种分类分析[33]。对OTU进行丰度和α多样性等分析，得到样品内物种丰富度和均匀度信息、不同样品或分组间的共同和特有OTU信息等。
1) OTU分析：利用Uparse软件(Uparse v7.0.1001)对所有样品的全部Effective Tags进行聚类[34]。
2) 样品复杂度分析(α多样性)：使用Qiime软件(Version 1.7.0)计算α多样性指数。
3) 多样品比较分析(β多样性)：用Qiime软件(Version 1.7.0)计算Unifrac距离。使用R软件(Version 2.15.3)绘制主坐标分析(PCoA)图。
1.7.4 气体样品的分析CH4浓度使用美国安捷伦7890A气相色谱仪采用单点校样法进行测定。所需材料：密封气体进样针(美国安捷伦)、1 L气袋(大连化工设计院)、高纯氢气(99.99%)、高纯氮气(99.999%)、甲烷标准气(36.9 mg/L)。分析条件：检测器为氢火焰离子化检测器(FID)，色谱柱为安捷伦GS-GasPro柱，气化室温度200 ℃，柱温60 ℃，检测器温度220 ℃，高纯氮气压力68.95 kPa，氢气流速30 mL/min，空气流速400 mL/min，尾吹25 mL/min，分流比为20 : 1，保留时间1.33 min，手动进样1 mL。
SF6浓度使用美国安捷伦7890A气相色谱仪采用单点校样法进行测定。所需材料：密封气体进样针、1 L气袋、高纯氢气(99.99%)、高纯氮气(99.999%)、SF6标准气(100 mg/L)。分析条件：检测器为电子捕获检测器(ECD)，色谱柱为安捷伦GS-GasPro柱，气化室温度200 ℃，柱温25 ℃，检测器温度250 ℃，高纯氮气压力34.475 kPa，分流比为20 : 1，尾吹25 mL/min，保留时间2.77 min，手动进样1 mL。
1.7.5 肝脏中碳代谢相关基因表达的测定1) 样品总RNA的提取与完整性检测。取50~100 mg肝脏样品，按照TRIzol试剂盒(Ambion，美国)说明书提取肝脏组织中的总RNA，取少量总RNA与染色剂溴化乙锭(EB)(Thermo，美国)混合，用1.2%琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结束后将其放入凝胶成像系统(SIM，美国)内，观察条带是否完整清晰。
2) 反转录。本利用QuantiTect反转录试剂盒(Qiagen，德国)对总RNA进行反转录。将合成的cDNA放入-20 ℃冰箱中储存待测。
3) 荧光定量PCR。本试验所用引物均根据NCBI中已报道的牛基因序列[35]进行设计，由上海生工生物技术有限公司代为合成，详见表 4，以β-肌动蛋白(β-actin)作为内参基因。荧光定量PCR反应体系(20 μL)如下：iQTM SYBR® Green Supermix 10 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，cDNA 5 μL，无核酸酶水1 μL。反应程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s；60 ℃，15 s退火；72 ℃，20 s延伸，40个循环。
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表 4 引物序列 Table 4 Primer sequences |
应用SPSS 19.0统计软件的ANOVA程序进行方差分析，差异显著时用Duncan氏法进行组间的多重比较，试验数据用平均值±标准差表示。
2 结果与分析 2.1 饲粮中全棉籽比例对育肥荷斯坦公牛瘤胃发酵参数的影响由表 5可以看出，各组瘤胃液pH没有显著差异(P＞0.05)，均在正常范围；Ⅳ组的瘤胃液NH3-N浓度比Ⅰ组提高了31.34%(P＜0.05)；Ⅲ和Ⅳ组的MCP浓度分别比Ⅰ组提高了45.45%(P＜0.05)和40.00%(P＜0.05)。随着饲粮中全棉籽比例的增加，VFA中乙酸和丙酸的比例均有上升趋势，且Ⅳ组的乙酸和丙酸比例分别比Ⅰ组提高了2.26%(P＜0.05)和15.20%(P＜0.05)；Ⅳ组丁酸比例比Ⅰ组降低了4.46%(P＜0.05)；乙酸/丙酸随饲粮中全棉籽比例的增加而呈下降趋势，但各组间差异不显著(P＞0.05)。
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表 5 饲粮中全棉籽比例对育肥荷斯坦公牛瘤胃发酵参数的影响 Table 5 Effects of dietary whole cottonseed ratio on rumen fermentation parameters of fattening Holstein bulls |
由表 6可知，从属水平的相对丰度分析，普雷沃氏菌属在瘤胃中占据绝对优势。Ⅳ组的普雷沃氏菌属-1、密螺旋体属-2的相对丰度极显著高于其他组(P＜0.01)；Ⅳ组的琥珀酸弧菌科UCG-002的相对丰度较Ⅰ和Ⅱ组显著升高(P＜0.05)；理研菌科RC9肠道群、普雷沃氏菌科UCG003、瘤胃杆菌属、疣微菌科NK4A214群、纤维杆菌属、未识别的叶绿体和拟杆菌属的相对丰度各组间的差异均不显著(P＞0.05)。
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表 6 瘤胃细菌在属水平上的相对丰度 Table 6 Relative abundances of rumen bacteria at genus level |
瘤胃细菌16S rRNA基因α多样性指数见表 7。反映物种丰富度的ACE指数和Chao1指数以及反映物种多样性的Shannon指数各组间差异均未达到显著水平(P＞0.05)。4个组的覆盖率(Good’s_coverage)均大于98%，表明瘤胃液的测序量是合理的，可以较好地反映瘤胃液中细菌群落种类和结构多样性。物种观测数的范围是1 827.40~2 011.40，表现为Ⅰ组>Ⅱ组>Ⅲ组>Ⅳ组，Ⅳ组显著少于Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组(P＜0.05)。
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表 7 瘤胃细菌群落α多样性指数 Table 7 Alpha diversity indexes of bacterial community in rumen |
由图 2可以看出，基于Weighted Unifrac距离来进行PCoA的第一主成分(PC1)的贡献率为61.65%，第二主成分(PC2)的贡献率为14.92%。样品间距离反映了物种组成结构的相似度，样品间距离越近，说明物种群落的相似度越高，反之，则样品间群落差异越大。由图 2可知，同一组中的样品间的物种群落结构相似度很高，各组瘤胃细菌构成总体上可以分开。
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图 2 基于Weighted Unifrac距离的PCoA Fig. 2 PCoA based on Weight Unifrac distance |
由表 8可知，从属水平的相对丰度分析，Ⅳ组甲烷短杆菌属、甲烷丝状菌属的相对丰度均为最低，分别为78.99%和0.03%，显著低于Ⅰ和Ⅱ组(P＜0.05)；Absconditabacteria_unidentified_SR1的相对丰度以Ⅲ组最高，为0.05%，显著高于Ⅰ组(P＜0.05)；甲烷球形菌属、甲烷微球菌属、甲烷螺菌属的相对丰度各组间均未表现出显著差异(P＞0.05)。
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表 8 瘤胃中产甲烷古菌在属水平上的相对丰度 Table 8 Relative abundances of methanogens in rumen at genus level |
由表 9可知，ACE指数、物种观测数、Shannon指数4组之间均没有显著差异(P＞0.05)，但随着饲粮中全棉籽比例的增加均有下降的趋势。Ⅲ、Ⅳ组的Chao1指数比Ⅰ组降低了7.34%和8.76%，差异显著(P＜0.05)，说明随着饲粮中全棉籽比例的增加，瘤胃中产甲烷古菌群落的丰富度逐渐下降。各组的覆盖率均大于99%，表明测序深度较高，足够反映群落多样性和丰度。
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表 9 瘤胃中产甲烷古菌群落α多样性指数 Table 9 Alpha diversity indexes of methanogens community in rumen |
由表 10可以看出，随着全棉籽比例的增加，甲烷排放量逐渐降低，Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组较Ⅰ组分别降低了8.76%(P＞0.05)、19.48%(P＜0.05)和22.68%(P＜0.05)。
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表 10 饲粮中全棉籽比例对育肥荷斯坦公牛甲烷排放量的影响 Table 10 Effects of dietary whole cottonseed ratio on methane emission of fattening Holstein bulls |
由表 11可以看出，育肥荷斯坦公牛的日增重与甲烷排放量是呈显著负相关(P＜0.05)，甲烷短杆菌属、甲烷丝状菌属的相对丰度与甲烷排放量呈显著正相关(P＜0.05)，而琥珀酸弧菌科UCG-002的相对丰度与甲烷排放量呈极显著正相关(P＜0.01)。
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表 11 甲烷排放量与育肥荷斯坦公牛平均日增重和瘤胃主要甲烷生成菌相对丰度的相关性 Table 11 Correlations between methane emission and ADG, relative abundance of major rumen methane-producing bacteria of fattening Holstein bulls |
由表 12可知，与Ⅰ组相比，饲粮中添加15%的全棉籽后甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶(MUT)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6P)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)的mRNA表达量均呈上调趋势，其中MUT的mRNA表达量极显著提高(P＜0.01)，PEPCK的mRNA表达量显著提高(P＜0.05)。
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表 12 育肥荷斯坦公牛肝脏中碳代谢相关基因的mRNA表达量 Table 12 mRNA expression levels of genes related to carbon metabolism in liver of fattening Holstein bulls |
pH对瘤胃内环境的变化最敏感，其过高或过低都会影响瘤胃微生物的正常生长。当pH在6~7时，瘤胃发酵均可正常进行，而本试验的各组公牛瘤胃液pH在此范围之中，因此，添加全棉籽不会影响荷斯坦公牛瘤胃的正常发酵[36]。王平[18]在肉牛饲粮中添加13%和25%的全棉籽，结果显示对瘤胃液pH无显著影响，与本试验结果一致。瘤胃微生物需要的氮源中有18%~100%是由NH3-N供给的[37]，而且蛋白质在瘤胃消化程度对NH3-N的浓度影响很大。当NH3-N浓度在5~30 mg/dL时，瘤胃微生物可以很好地生长，过高或者过低都不利于其正常生长[38]。本试验中各组公牛瘤胃液NH3-N浓度在9.35~12.28 mg/dL，属于正常范围，并随着饲粮中全棉籽比例的增加而增加，其可能是由于高比例的棉籽经过浸润逆呕，再到口腔充分咀嚼，使反刍时间增加，在瘤胃内滞留的时间延长，一部分氮源分解程度较高，产生的NH3-N也较多，导致NH3-N浓度升高，这与刘建雷等[20]的研究结果一致。MCP是反刍动物最主要的氮源供应者，其浓度的大小可以反映微生物利用NH3-N的能力[39]。本试验中添加10%和15%全棉籽组的瘤胃液MCP浓度显著高于对照组，说明添加全棉籽更有利于MCP的生成。
VFA作为饲粮中碳水化合物发酵最终的产物，为反刍动物提供所需的能量[28]。瘤胃中乙酸、丙酸和丁酸这3种酸占总VFA的95%[40]。本试验中，添加15%全棉籽组的荷斯坦公牛瘤胃液中乙酸和丙酸比例显著高于对照组。由于全棉籽含有较多的纤维，纤维分解菌的数量也随之增多，从而提高了乙酸比例；而丙酸比例之所以提高可能是由于添加全棉籽后增加了荷斯坦公牛的咀嚼时间，促进了淀粉的释放[41]。而丙酸增多了会减少瘤胃内氢气的量，从而降低瘤胃中甲烷的合成量[36]。一般乙酸/丙酸的适宜范围是2.0~3.6[19]，本试验的乙酸/丙酸变化范围是2.98~3.32，在适宜范围内，并且，随着饲粮中全棉籽比例的增加，乙酸/丙酸有下降的趋势。
3.2 饲粮中全棉籽比例对育肥荷斯坦公牛瘤胃细菌群落结构的影响α多样性用于分析微生物群落内多样性[42]，通过单样本的α多样性分析，可以了解样本内的微生物群落的丰富度和多样性。菌群的丰度反映了其适应特定环境并竞争其中可用营养物质的能力，表明其对整个微生物组整体功能的重要性[43]。ACE指数、Chao1指数的高低可反映样品群落内菌群的丰富度，Shannon指数的高低则可反映样品群落内菌群的多样性Shannon指数越高，菌群的多样性越高。本试验结果表明，添加15%全棉籽组的物种观测数显著低于对照组，可能是与全棉籽中含有大量的脂肪酸对菌群有一定的抑制作用有关。
通过对荷斯坦公牛瘤胃细菌16S rRNA基因β多样性分析可知，试验组与对照组呈现明显的聚类现象，各组瘤胃微生物构成具有一定差异，说明添加全棉籽对各组的物种结构组成是有影响的，具体原因还需进一步研究。从属水平的相对丰度分析，普雷沃氏菌属-1为优势菌群，是瘤胃中数量最多的一类细菌，在牦牛[44]、肉牛[45]上均得到相似的结果。普雷沃氏菌属拥有高活性的半纤维素分解菌，并对植物非纤维多糖和蛋白质的降解至关重要[46-47]。其中Ⅳ组的普雷沃氏菌属-1、密螺旋体属-2的相对丰度极显著高于Ⅰ组。普雷沃氏菌科中的普雷沃氏菌属是牛、羊等反刍动物瘤胃和肠道中数量最多的微生物，重点在蛋白质、碳水化合物的降解发酵及肽类物质的吸收中发挥效应，可产生蛋白酶，促进瘤胃内蛋白质的降解，因此，各试验组瘤胃液中MCP浓度比对照组都有所提高可能与普雷沃氏菌有关。而且，普雷沃氏菌的发酵产物主要是乙酸、琥珀酸和丙酸，其中琥珀酸在瘤胃中由微生物酶较快转化为丙酸，降低甲烷排放量[48]。本试验中，随着普雷沃氏菌相对丰度的提高，瘤胃VFA中乙酸和丙酸的比例也增加。密螺旋体属是果胶利用菌，这类瘤胃细菌优势菌群的存在是由于饲粮中含有大量纤维素和碳水化合物。Ⅳ组的琥珀酸弧菌相对丰度显著高于Ⅰ组，而琥珀酸弧菌属中的溶糊精琥珀酸弧菌可以发酵糊精，其发酵后主要产生乙酸与琥珀酸，可抑制甲烷的生成。
3.3 饲粮中全棉籽比例对育肥荷斯坦公牛瘤胃中产甲烷古菌群落结构的影响除嗜酸菌属(Picrophilus)外，己知的瘤胃古菌均为产甲烷古菌，隶属于广古菌门(Euryarchaeota)，其中大部分为氢营养型，利用细菌发酵产生的二氧化碳和氢气生成甲烷气体。有研究表明，在瘤胃中，甲烷短杆菌属和甲烷微菌属为最优势的菌群[49-51]。饲粮类型决定了反刍动物瘤胃微生物优势菌群的类型和数量[52]，可能的机制是改变了瘤胃的发酵类型和瘤胃液的pH等[53]，进而改变了瘤胃微生物菌群的多样性及数量[54]。Hristov等[55]研究表明，饲喂月桂酸的奶牛瘤胃液中，甲烷短杆菌属占总瘤胃古菌的70%，而当其饲喂肉蔻酸及硬脂酸时，瘤胃液中此菌群的比例更是达到92%。从本试验结果可以看出，甲烷短杆菌的相对丰度最高可达93.32%。随着饲粮中全棉籽的增加，甲烷短杆菌的相对丰度显著降低，可能的原因一是由于全棉籽存在棉籽壳，避免了瘤胃微生物对脂肪的氢化作用，降低了瘤胃发酵，提高了胃肠道消化吸收的比例；二是随着饲粮中全棉籽比例的增加，棉酚含量也增加，对微生物的直接毒害作用也可能有所提高。Wang等[56]研究显示，甲烷短杆菌的相对丰度与甲烷排放量呈正相关，因此甲烷短杆菌的相对丰度降低，甲烷排放量也会相应减少，与本试验结果一致。本试验结果还得出，Ⅳ组的Chao1指数显著低于Ⅰ组，说明全棉籽中的棉酚对菌群有一定的毒害作用，降低了菌群的丰富度，具体原因需进一步研究。
3.4 饲粮中全棉籽比例对育肥荷斯坦公牛甲烷排放的影响反刍动物排放的甲烷是重要温室气体之一，对环境危害较大，减少反刍动物甲烷排放既能减缓全球变暖趋势，也能减少饲料能量的浪费。据前人研究表明，降低瘤胃中甲烷的排放量主要有2个途径：一是减少氢的产生量以及降低产甲烷菌的数量；二是通过营养调控反刍动物瘤胃发酵，使其产生更多的丙酸，进而竞争甲烷合成的前体物质氢气和二氧化碳，从而降低甲烷的生成[41]。
目前国内外针对降低反刍动物甲烷排放的方法有很多，例如通过改变饲粮组成比例、植物提取物添加剂、脂类添加剂等。王平[18]研究表明，饲喂全棉籽具有提高瘤胃丙酸浓度的趋势，而且乙酸/丙酸显著降低。Grainger等[17]研究表明，给泌乳牛每日补饲2.61 kg的全棉籽，饲养到12周时甲烷生成量减少了23%。这与本试验采用荷斯坦公牛所得的结果一致，其主要的原因可能就是由于全棉籽含有大量的脂肪酸以及在瘤胃内的氢化作用，促进了丙酸的合成，从而降低了甲烷生成量。
3.5 饲粮中全棉籽比例对育肥荷斯坦公牛肝脏中碳代谢相关基因表达的影响多数哺乳动物组织中发现有甲基丙二酰辅酶A变位酶存在，并以反刍动物的肾脏和肝脏中最为丰富。甲基丙二酰辅酶A变位酶主要催化从三羧酸循环中间物生成丙酸的反应，对丙酸流向、糖异生代谢有着重要的意义。本试验结果表明，饲喂全棉籽极显著提高了MUT mRNA的表达量，有利于丙酸的合成，从而降低甲烷的排放。
PEPCK和G6P是肝脏细胞内参加糖异生过程中起到很重要作用的酶[57]，其活性的上升和下降可引起糖异生的增加和减少，从而导致血糖水平升高和降低[58]。对于反刍动物来说，可以将摄入的纤维通过微生物发酵生成乙酸、丙酸、丁酸，其中丙酸经糖异生途径生成葡萄糖[59]。本试验研究表明，随着全棉籽比例的增加，其糖异生关键酶PEPCK和G6P的mRNA表达量增加，说明添加全棉籽可以促进糖异生的进行，提高丙酸的利用率，从而利用更多瘤胃内的氢气，甲烷菌可利用氢气减少导致甲烷生成量降低。
4 结论在本试验条件下，饲粮中添加15%的全棉籽可有效调控育肥荷斯坦公牛瘤胃发酵及微生物区系，显著降低甲烷排放量以及上调肝脏中碳代谢相关基因的表达。
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