2. 河南农业大学现代实验技术与管理中心, 郑州 450002;
3. 中国林业科学研究院经济林研究开发中心, 郑州 450003;
4. 河南省种牛遗传性能测定中心, 郑州 450002
2. Advanced Experimental Techniques and Management Centre, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China;
3. Economic Forestry Research and Development Center, Chinese Academy of Forestry Sciences Zhengzhou 450003, China;
4. Henan Genetic Performance Measurement Center for Breeding Cattle, Zhengzhou 450002, China
杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)是传统中药材，其富含黄酮类化合物、绿原酸、木脂素类、环烯醚萜类、苯丙素类等，具有降血糖、降压、抗氧化、抗应激等作用[1]。研究发现，杜仲皮、杜仲叶(Eucommia ulmoides leaves，EUL)以及枝条包含的有效成分和药理作用基本相同[2]。我国有丰富的EUL资源，其可作为茶饮改善肝脏和肾脏的功能[3]，还可作为饲料添加剂应用于畜牧生产中。大量研究发现，EUL不仅提升动物的生产性能、改善肉品质，而且对动物的糖脂代谢、免疫和抗氧化等多方面均有显著的影响[4]。有研究表明，EUL提取物通过促进脂肪细胞对葡萄糖(GLU)的转运和消耗，进而降低血糖含量[5]；也可以通过抑制α-葡萄糖苷酶和葡萄糖转运蛋白发挥显著的抗高血糖的作用[6]。Jin等[7]长期对小鼠灌服EUL提取物可提升血浆胰岛素(INS)含量。另有研究证明，EUL中活性成分绿原酸和黄酮类化合物可以有效抑制肝葡萄糖-6-磷酸转移酶的活性，进而阻碍GLU的生成。目前EUL及其提取物对糖代谢影响的研究及应用多偏重于单胃动物，而反刍动物的研究较少。反刍动物60%以上的GLU来源于肝脏的糖异生，研究EUL对反刍动物糖代谢的作用，更具有特殊的意义。本试验旨在研究饲粮中添加EUL对绵羊血浆中GLU含量及肝脏糖代谢相关基因表达的影响，以期为探究EUL促进绵羊糖代谢的机理提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料EUL采自河南省汝阳县本地种植的杜仲树，由秋季采摘后晒干储存；经分析，风干基础的EUL常规营养成分含量如下:干物质(DM)89.46%、总能(GE)19.47 MJ/kg、粗蛋白质(CP)11.47%、钙(Ca)2.06%、磷(P)0.05%。
1.2 试验设计及饲养管理选取6~8月龄、体重35~40 kg健康的杜泊羊×湖羊♀杂交后代公羊12只，平均分为2组，分别为对照组(CTL组)和EUL组。EUL组在对照组饲粮中添加10%的EUL(干物质基础)。预试期10 d，正试期30 d。参照NRC(2007)肉羊饲养标准配制试验饲粮，其组成及营养水平见表 1，调整各项营养成分至平衡，使营养水平基本一致，由全混合日粮(TMR)混合机(9JSG-5)混合搅拌成TMR。
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表 1 试验饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) |
试验前，对绵羊进行统一驱虫。每日于07:00和17:00各饲喂1次，每次喂料前收集上次的剩料，称重，记录。试验羊自由采食，自由饮水。每天清理水槽，打扫羊舍，确保干净卫生。
1.3 样品采集与处理正试期结束前1天，试验羊于早饲前(07:00)进行颈静脉采血，每只羊用真空抗凝采血管(肝素锂)和真空促凝采血管各采血5 mL，抗凝管离心(2 500 r/min，15 min，湘仪离心机厂，TDZS-WS)分离血浆，促凝采血管4 ℃静置30 min后，离心(1 500 r/min，15 min)，分离血清。将分离的血清和血浆装于EP管中，标记后放入-40 ℃保存，待测。
正试期结束后，禁食24 h，禁水12 h，12只试验绵羊全部屠宰。取适量肝脏组织，锡箔纸包好，标记，一部分立即放入液氮罐中，冷冻保存，待测；另一部分放入-20 ℃冰箱中保存，备用。
1.4 检测指标与处理方法 1.4.1 生长性能指标测定试验羊在正试期初始和结束时，个体空腹称重；试验期间每天记录喂料量和剩料量，计算平均日采食量、平均日增重和料重比。
1.4.2 血液生化指标及激素测定用全自动生化分析仪(Olympus AU640)测定血浆中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)活性及尿素(UREA)和GLU等含量；用酶联免疫法(上海蓝基生物科技有限公司试剂盒)测定血清中INS和胰高血糖素(GC)含量。
1.4.3 肝糖原冰冻切片取-20 ℃肝脏样品，切成约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的组织小块，放在组织支撑器上，滴加冷冻包埋剂后放入冰冻切片机中低温固化处理，然后切成5 μm厚的切片，进行PAS染色。滴加唾液淀粉酶溶液于37 ℃温箱中消化30 min，将切片放入0.5%高碘酸中氧化7 min，流水冲洗5 min，再用蒸馏水洗2次；阴暗避光处用无色品红染色15~20 min；再放入0.5%的偏重亚硫酸钠中洗2次，每次约1 min，流水冲洗5 min，再用蒸馏水冲洗进行Harris苏木精染色2 min；流水冲洗后用0.1%的盐酸乙醇分化液分化处理1 min，水洗温水返蓝，再用流水冲洗放入42 ℃温箱中烘24 h，中性树胶封固。
1.4.4 高通量转录组测定利用高通量转录组RNA-Seq技术对CTL组及EUL组肝脏样品进行测序和差异表达分析(由上海美吉生物医药科技有限公司完成)。用Trizol法提取肝脏组织的总RNA，用Agilent 2100检测RNA质量，Nanodrop 2000定量RNA。对检测合格的总RNA样品构建测序转录组文库并应用Illumina Hiseq Xten测序平台进行测序，每组样本3个重复，以确保分析的准确性。利用Taphat2对过滤后的原始reads进行组装拼接，EdgeR分析得到显著性差异基因，FPKM方法对转录本的表达水平进行计算，并对差异基因进行GO功能富集和KEGG途径分析。
1.4.5 糖代谢相关酶(因子)的mRNA表达量测定实时荧光定量PCR测定肝脏组织中糖代谢相关酶和核转录因子的mRNA表达量。根据GenBank数据库搜索羊的相应基因序列信息，用Primer 6软件设计基因引物，然后委托上海生工合成引物，检测基因与内参基因磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的引物序列见表 2。
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表 2 引物序列 Table 2 Primer sequences |
迅速从液氮中取出肝脏组织，剪取0.5 g左右，用RNAisoPlus提取总RNA，利用紫外分光光度计测定光密度(OD)，计算OD260/280和OD260/230(判断RNA的纯度)。用反转录试剂盒(大连TaKaRa公司，PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser)反转录mRNA为cDNA，使用荧光定量PCR仪(Mastercycler nexus，德国Eppendorf公司)SYBRGreen法检测mRNA表达量，参数设置：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40个循环。
1.4.6 糖代谢相关酶(因子)蛋白表达量测定用蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测上述mRNA表达量差异显著的基因的蛋白表达量。取液氮中绵羊肝脏组织样品约0.1 g，放入到1 mL含1%蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液中，用组织匀浆机匀浆30 s，至肝脏组织完全裂解，冰上静置30 min；4 ℃条件下，12 000×g离心20 min，取中间液相。双金鸡宁酸(BCA)法测定蛋白质浓度，99 ℃孵育10 min，使蛋白质变性。制备十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶(SDS-PAGE)电泳胶，样品蛋白上样60 μg，电压120 V，待蛋白条带进入分离胶后，调至160 V，继续电泳至溴酚蓝移动到距胶底部0.5~1.0 cm，停止电泳。将凝胶湿转到甲醇浸泡5 min的醋酸纤维素膜(PVDF)上，倒入转膜液，4 ℃条件下，电压调至110 V转膜70 min。转膜后，用5%脱脂奶封闭液封闭1 h，然后用TBST洗膜3次，每次5 min。加入用5%脱脂奶按1 : 1 000稀释的一抗，4 ℃孵育过夜。同上洗膜后，加入用5%脱脂奶按1 : 5 000稀释的二抗[辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)]，在室温孵育2 h，洗膜。ECL法显影，用Image J对显影照片中的目的条带进行灰度光密度分析，定量结果。同一样本采用GAPDH作为内参。
1.5 数据统计分析用Excel 2007初步处理测定得到的数据后，采用SPSS 20.0软件进行t检验，以P < 0.05为差异显著，P < 0.01为差异极显著，数据用平均值±均值标准误(mean±SEM)表示。
2 结果 2.1 杜仲叶对绵羊生长性能的影响由表 3可知，与CTL组相比，EUL组的末重显著升高(P < 0.05);平均日增重、平均日采食量升高, 料重比下降，但差异均不显著(P>0.05)。
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表 3 杜仲叶对绵羊生长性能的影响 Table 3 Effects of EUL on growth performance of sheep |
由表 4可知，与CTL组相比，EUL组血浆AST活性、血清INS含量显著升高(P < 0.05)，血浆UREA及GLU含量和血清GC含量显著降低(P < 0.05)。
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表 4 杜仲叶对绵羊糖代谢相关生化指标和激素的影响 Table 4 Effects of EUL on biochemical indexes and hormones related to glucose metabolism of sheep |
PAS染色肝细胞，细胞核呈蓝色，细胞质呈紫红色的，即为肝糖原。由图 1可知，EUL组绵羊肝脏切片中紫红色糖原颗粒的数量和密度较CTL组中明显增多，表明EUL组中肝糖原含量增加。
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A:CTL组肝糖原冰冻切片；B：EUL组肝糖原冰冻切片。切片中紫红色部分为糖原；标尺：50 μm。 A: frozen section of liver glycogen of CLT group; B: frozen section of liver glycogen of EUL group. Fuchsia points in the sections stand for glycogen; scale bar: 50 μm. 图 1 绵羊肝脏组织中糖原的含量和分布 Fig. 1 Glycogen content and distribution in liver tissue of sheep (400×) |
通过分析比较CTL组和EUL组转录组数据，共筛选出546个差异表达基因(FC≥2，P < 0.05)，其中160个基因表达量上调, 386个基因表达量下调。进一步功能分析表明，这些差异基因涉及多种GO分类及KEGG通路。表 5列出与调控糖代谢相关的已知基因，如叉头转录因子1(FoxO1)、环磷酸腺苷应答元件结合蛋白(CREB)等的表达都发生显著变化。对546个差异表达基因进行KEGG通路分析，筛选出差异显著的前20位基因富集的KEGG通路，其中与糖代谢相关的差异表达基因显著富集的通路有FoxO信号通路、INS相关信号通路、环磷酸腺苷信号通路等(表 6)。
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表 5 糖代谢相关的重要基因的表达情况 Table 5 Expression of important genes related to glucose metabolism |
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表 6 与糖代谢相关的差异表达基因显著富集的KEGG通路 Table 6 Significantly enriched KEGG pathways in differentially expressed genes related to glucose metabolism |
采用转录组测序对糖代谢方面的相关差异基因进行分析之后，再利用实时荧光定量PCR方法对与糖代谢相关的基因进行进一步的验证分析。EUL对绵羊肝脏组织胰岛素受体(INSR)、胰岛素受体底物2(IRS2)、胰高血糖素受体(GCGR)mRNA表达量见图 2。从结果可以看出，与CTL组相比，EUL组的INSR和IRS2的mRNA表达量极显著升高(P < 0.01)，GCGR的mRNA表达量极显著降低(P<0.01)。
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INSR:胰岛素受体insulin receptor；IRS2：胰岛素受体底物2 insulin receptor substrate 2; GCGR:胰高血糖素受体glucagon receptor。 *表示EUL组与CTL组差异显著(P < 0.05)；* *表示EUL组与CTL组差异极显著(P < 0.01)。下图同。* means significant difference between EUL and CTL groups (P < 0.05); * * means extremely significant difference between EUL and CTL groups (P < 0.01). The same as below. 图 2 杜仲叶对绵羊肝脏糖代谢相关激素受体及受体底物基因mRNA表达量的影响 Fig. 2 Effects of EUL on mRNA expression levels of hormone receptors and receptor substrate genes related to glucose metabolism in sheep liver |
由图 3可知，与CTL组相比，EUL组肝脏糖酵解关键酶磷酸果糖激酶(PFKL)的mRNA表达量显著升高(P < 0.05)，糖原合成酶2(Gys2)的mRNA表达量极显著升高(P < 0.01)，而丙酮酸激酶(PKLR)的mRNA表达量无显著变化(P>0.05)。
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PFKL:磷酸果糖激酶phosphofructokinase；PKLR:丙酮酸激酶pyruvate kinase；Gys2：糖原合成酶2 glycogen synthase 2。 图 3 杜仲叶对绵羊肝脏糖酵解及糖原合成关键酶基因mRNA表达量的影响 Fig. 3 ffects of EUL on mRNA expression levels of key enzyme genes involved in glycolysis and glycogen synthesis in sheep liver |
EUL对绵羊肝脏糖代谢相关通路基因蛋白激酶A(PKA)、CREB、FoxO1及糖异生相关酶葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)、果糖-1, 6-二磷酸酶1(FBP1)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1(PEPCK1)、丙酮酸羧化酶(PCB)、丙酰辅酶A合成酶3(ACSS3)的mRNA表达量的影响见图 4。从结果可以看出，与CTL组相比，EUL组FBP1、PEPCK1的mRNA表达量显著降低(< 0.05)，CREB、FoxO1、G6Pase和ACSS3的mRNA表达量极显著降低(P < 0.05)，PCB的mRNA表达量差异不显著(P>0.05), EUL组PKA的mRNA表达量有下降趋势但不显著(P>0.05)。
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PKA:蛋白激酶A protein kinase A；CREB：环磷酸腺苷应答元件结合蛋白cAMP response element binding protein；FoxO1:叉头转录因子1 forkhead transcription factor 1；G6Pase:葡萄糖-6-磷酸酶glucose-6-phosphatase；FBP1:果糖-1, 6-二磷酸酶1 fructose-1, 6-bisphosphatase 1；PEPCK1：磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1 phosphoenolpyruvate carboxykinase 1；ACSS3:丙酰辅酶A合成酶3 propionyl-CoA synthetase 3。 图 4 杜仲叶对绵羊肝脏糖异生相关酶/核转录因子基因mRNA表达量的影响 Fig. 4 Effects of EUL on mRNA expression levels of gluconeogenesis related enzymes and nuclear transcription factor genes in sheep liver |
在研究mRNA表达量的基础上，选定mRNA表达量差异显著的4个基因G6Pase、PEPCK1、INSR及FoxO1，对其蛋白表达量进行研究，其Western blot测定结果见图 5。与CTL组相比，EUL组G6Pase、PEPCK1及FoxO1的蛋白表达量极显著下降(P < 0.01)，INSR蛋白表达量升高，但差异不显著(P>0.05), 与mRNA表达水平基本一致。
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INSR:胰岛素受体insulin receptor；FoxO1：叉头转录因子1 forkhead transcription factor 1；G6Pase:葡萄糖-6-磷酸酶glucose-6-phosphatase；PEPCK1：磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1 phosphoenolpyruvate carboxykinase 1；GAPDH：磷酸甘油醛脱氢酶phosphoglyceraldehyde dehydrogenase。 图 5 杜仲叶对绵羊肝脏糖代谢相关因子蛋白表达量的影响 Fig. 5 Effects of EUL on protein expression levels of glucose metabolism related factors in sheep liver |
血液中的GLU是机体重要的能量来源，血清中INS和GC是体内调节血糖水平的主要激素。本试验结果表明，EUL组血清INS含量显著升高，GC含量显著下降，是导致血糖水平显著下降的重要原因。血液中的UREA含量是反映蛋白质利用效率的最有效指标。本试验中，EUL组血浆UREA含量显著降低，表明在能量充足条件下，氨基酸合成蛋白质增多, 并且添加EUL能够为机体提供必需氨基酸促进蛋白质的合成[8]。AST是催化谷氨酸与草酰乙酸之间相互转化的转氨酶，能够催化谷氨酸进入三羧酸循环中氧化供能。在本试验中，EUL组血浆AST含量显著提高说明杜仲叶中的某些成分对肝脏有刺激作用，但其含量在正常范围内，不会引起肝炎症等不良症状。Lee等[9]研究发现，高血糖诱导[注射链脲佐菌素(STZ)]的大鼠糖尿病，饲喂EUL粉及水提取物均可以显著提高血浆INS含量，进而降低GLU含量。Park等[10]研究发现，EUL水提取物处理Ⅱ型糖尿病模型C57BL/KsJ-db/db小鼠，可以显著升高血清INS含量，降低调控糖异生途径的G6Pase和PEPCK1的活性，从而降低GLU含量，改善糖尿病。田吉等[11]研究发现，EUL的50%乙醇提取液能显著降低STZ诱导的小鼠高血糖。本试验中，EUL组血清INS含量显著升高和GLU含量显著下降，与前人的研究结果一致。
3.2 杜仲叶影响绵羊糖代谢的机制反刍动物的糖代谢与单胃动物有明显的不同，单胃动物的GLU主要来自小肠对碳水化合物的分解，而反刍动物的GLU主要来自肝脏的糖异生。为阐明EUL对绵羊机体糖代谢的影响，本研究以肝脏为重点，进行转录组学测序分析，发现EUL组与CTL组在糖代谢相关富集通路方面有显著的变化。在调节糖代谢的过程中，参与血糖调节的激素主要是INS和GC。试验研究表明，血清中的INS能与肝脏细胞膜上的INSR结合，激活INSR, 引起IRS2的酪氨酸磷酸化[12]，进而激活细胞内磷脂酰肌醇-3-羟激酶/蛋白激酶B(PI3K-AKT)信号通路，磷酸化的AKT能影响其下游信号因子，促进糖代谢[13]。本试验中，EUL组显著上调了肝脏组织的INSR和IRS2的mRNA表达量，INSR的蛋白表达量升高，但差异不显著。另有试验研究表明，GC能够结合其受体GCGR，增加环磷酸腺苷水平，活化PKA，进而激活并磷酸化转录因子CREB，进一步调节其下游因子[14]。本试验中，EUL组显著下调GCGR和CREB的mRNA表达量，且PKA的mRNA表达量下调。这说明添加EUL可通过刺激机体INS和GC水平的变化，进而激活INSR及GCGR相关信号通路，来调节肝脏糖代谢。
在糖分解的过程中，PFKL和PKLR是糖酵解途径的关键酶。有研究表明，AKT信号通路的激活，能够促进肝脏PFKL的mRNA表达[15]。本试验结果表明，EUL组显著增强了肝脏中PFKL的mRNA的表达量，但对PKLR的mRNA表达量无显著影响，说明EUL组可提高糖酵解途径中的关键酶PFKL的活性，加速GLU的分解，降低血糖水平。
在糖异生的途径中，G6Pase、PEPCK1、FBP1、PCB均是其重要的限速酶；丙酸是反刍动物糖异生的主要前提物，ACSS3是催化丙酸转化为丙酰辅酶A的限速酶，经转化最终进入三羧酸循环异生糖。研究表明，肝脏糖异生主要受G6Pase和PEPCK1调控[16]。本试验中，G6Pase和PEPCK1的mRNA和蛋白表达量均显著降低，说明G6Pase和PEPCK1是EUL抑制糖异生的主要作用部位。ACSS3是丙酸异生糖途径的重要酶，其mRNA表达量显著降低，表明EUL阻止了丙酸异生糖的途径。在激素水平上，INS可以抑制G6Pase、PEPCK1、FBP1和PCB的转录[17-18]。本试验中EUL组血清INS含量显著升高，说明其对上述酶的抑制增强，也是阻止糖异生途径的重要原因之一。PCB是催化丙酮酸生成草酰乙酸的酶，是三羧酸循环中供给草酰乙酸的主要补充反应。本试验中PCB的mRNA表达量变化不显著，说明EUL对PCB的影响不大，同时也说明INS不是引起GLU含量降低的唯一原因，EUL成分可能直接对糖代谢相关基因产生影响。本试验证明了EUL可在多个位点阻止糖异生途径，已有研究表明，EUL中的绿原酸(CGA)可以特异性抑制G6Pase，下调G6Pase的mRNA表达量[19]，减少肝糖的输出，其他成分对糖代谢的影响还有待进一步深入研究。
在细胞核内，FoxO1是调节糖异生的核转录因子，能调节糖异生相关酶G6Pase和PEPCK1靶基因的转录[20]。在肝癌细胞的试验中，FoxO1的磷酸化，下调G6Pase和PEPCK1的表达，从而抑制了糖异生，降低血糖水平[21]，与前人的研究结果一致。反义寡核苷酸能够特异性抑制小鼠肝细胞FoxO1的mRNA表达，从而显著抑制G6Pase和PEPCK1的表达[22]，进一步证明FoxO1对糖异生的作用。本试验中，EUL组FoxO1的mRNA和蛋白表达量均显著下调，进而抑制糖异生途径。CREB是核内蛋白质，能够调节基因转录，有研究表明磷酸化的CREB能够增强肝脏糖异生基因G6Pase和PEPCK1的表达[23]，进而促进肝脏糖异生。本试验中，EUL组CREB的mRNA表达量极显著下降，进一步验证CREB对糖异生关键酶表达的影响。EUL中的成分是否直接对其产生影响有待进一步研究证明。
Gys2是催化INS介导的肝糖原合成的限速酶，能促进血液中的GLU进入肝细胞内合成糖原以储存能量。有研究表明，INS介导的通路中AKT的激活，能够导致糖原合成酶激酶3(GSK3)磷酸化，进而降低其对Gys2的抑制，促进糖原合成[24-25]；同时，INS也可直接增强Gys2的活性，促进糖原合成[26]。本试验结果表明，EUL组能显著提高Gys2的mRNA表达量以及肝脏糖原的合成。本研究中，EUL组Gys2的mRNA表达量升高和血浆GLU含量降低，可能与INS介导的PI3K/AKT通路和下游信号因子GSK3的磷酸化有关。
4 结论① EUL显著降低绵羊的血浆中GLU含量，增加肝脏糖原含量。
② EUL上调糖酵解相关酶基因的表达，下调糖异生相关酶及调节因子基因的表达。
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