功能性多糖具有来源广泛、无毒、无残留、无耐药性等特点，因此，将其开发作为新型饲料添加剂，对于减少抗生素使用、提升畜产品品质、提高动物生产性能并促进畜牧业的健康可持续发展具有重要的意义。大量的研究表明，功能性多糖是良好的免疫调节剂，对特异性和非特异性免疫均具有增强作用，其具体作用机制包括激活免疫细胞(淋巴细胞、巨噬细胞等)、促进细胞因子释放、激活补体系统、促进抗体生成等[1-4]。小麦麸皮中除含有一定数量的淀粉、蛋白质、脂肪外，还含有46%左右的非淀粉多糖(non-starch polysaccharides，NSP)[5]，包括果胶多糖、纤维素多糖以及由阿拉伯木聚糖、混合链β-葡聚糖、葡甘露聚糖、半乳聚糖、木聚糖等组成的非纤维素多糖[6]。研究表明，麸皮多糖具有诸多生物活性，包括免疫调节[7-8]、抗氧化[9]和益生作用[10]等。Shen等[7]报道，利用无水乙醇提取小麦麸皮中的多糖，将不同剂量的(50、100、200 mg/kg BW)的麸皮多糖灌胃给免疫抑制小鼠，均能提高其免疫力。微生物发酵技术在饲料行业中的应用日益广泛，其主要目的是通过利用微生物发酵的方式来提高发酵产品的有效物质含量和品质。Zhao等[11]和Manini等[12]研究均发现微生物发酵麸皮中阿拉伯木聚糖等活性成分含量能够得到明显提高。本课题组前期研究发现，利用枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌固态发酵小麦麸皮，获得的发酵麸皮多糖具有一定的抗炎[13-14]和抗氧化活性[15]。
肠道菌群作为肠道重要的组成部分，与营养物质代谢、肠道屏障功能和免疫应答等密切相关[16-17]。肠道菌群与宿主间存在广泛的免疫互作，免疫系统可以通过细胞免疫和体液免疫等途径，在多种免疫效应因子的共同作用下，影响肠道菌群的分布和组成，而肠道菌群的代谢产物也可以影响机体免疫系统[18]。在上述研究的基础上，本试验拟探讨发酵麸皮多糖对大鼠组织细胞因子含量及盲肠菌群结构的影响，以期为将发酵麸皮多糖作为饲料添加剂应用于动物生产，改善畜禽机体健康提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 发酵麸皮多糖的制备参照史俊祥[13]的方法制备发酵麸皮多糖。以小麦麸皮为原料，配以豆粕粉、玉米粉，比例为80.46 : 9.32 : 10.22；使用枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌混菌发酵，比例为6.7 : 3.3；接种量10.4%，添加0.1%尿素，发酵温度35.4 ℃，时间52.7 h，料水比1 : 1。发酵结束后，将发酵底物在45 ℃烘48 h，粉碎。与蒸馏水1 : 20混合后80 ℃水浴提取30 min，离心弃沉淀，上清液加入4倍体积的95%乙醇，静置过夜，离心收集沉淀，干燥沉淀后即为发酵麸皮多糖，经测定，其含量可达130.21 mg/g。
1.2 试验设计与饲养管理试验动物为75只21日龄的健康断奶雄性SD大鼠，购于内蒙古医科大学实验动物中心，生产许可证号为SCXK(蒙)2015-0001，使用许可证号为SYXK(蒙)2015-0001。将75只大鼠按体重相近的原则随机分为3个组，每组5重复，每个重复5只。对照组、低剂量组和高剂量组分别灌胃0、100、200 mg/kg BW发酵麸皮多糖。饲养期21 d，每日定时灌胃发酵麸皮多糖溶液1 mL，对照组灌胃等量生理盐水。所有大鼠均饲喂同一商品饲粮(购于江苏协同医药生物工程有限公司，其主要营养水平如下：水分含量10%、粗蛋白质含量18%、粗脂肪含量4%、粗纤维含量5%、粗灰分含量8%、钙含量1.0%~1.8%、总磷含量0.6%~1.2%、赖氨酸含量0.82%、蛋氨酸+半胱氨酸含量5.3%)。试验在内蒙古农业大学动物科学学院进行，常规饲养管理，自由采食、饮水。
1.3 样品采集试验结束当天，每个重复随机选取1只鼠，乙醚致晕，断颈处死，剖开腹腔，收集空肠、肝脏和脾脏组织及盲肠食糜，液氮速冻后将样品存于-80 ℃冰箱中待测。
1.4 免疫相关指标的测定取适量空肠、肝脏和脾脏组织，加磷酸盐缓冲液(PBS，0.01 mol/L，pH 7.4)制备10%组织匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清液用于免疫相关指标的测定。组织中白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量测定试剂盒均购于武汉基因美生物科技有限公司，所有操作均遵循说明书进行。
1.5 Illumina-HiSeq测序分析 1.5.1 盲肠食糜微生物总DNA的提取利用Power Fecal® DNA提取试剂盒(MoBio Carlsbad, 美国)提取大鼠盲肠食糜样品中微生物的总DNA，具体提取步骤参照试剂盒说明书进行。利用1%琼脂糖凝胶电泳和Nano Drop 8000原子分光光度计检测DNA的纯度和浓度，所提取的DNA于-20 ℃保存备用。
1.5.2 16S rDNA的扩增针对16S rDNA的V3~V4区，合成带有Barcode的特异引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，进行PCR扩增。扩增体系为：15 μL的5×Phusion Master Mix(New England Biolabs, 美国), 1 μL的DNA模板, 各1 μL的上、下游引物，最终体积30 μL。PCR反应条件为：98 ℃预变性30 s；98 ℃变性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，进行30个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR产物使用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，使用Qiagen®胶回收试剂盒进行回收纯化(Qiagen, 德国)，根据PCR产物浓度等量混样后进行文库构建。
1.5.3 文库构建和上机测序使用TruSeq®建库试剂盒进行文库构建，具体步骤参照试剂盒说明书进行。对构建好的文库进行Qu-bit@ 2.0 Fluorometer (Thermo Scientific)和Agilent Bioanalyzer 2100 System评价。构建文库合格后，使用Illumina-HiSeq PE250平台测序。
1.5.4 生物信息学分析各样品数据截去Barcode和引物序列后，使用FLASH(V1.2.7)[19]进行拼接，参照Qiime(V1.7.0)[20]进行质量控制，进一步通过UCHIME软件[21]和Gold数据库比对检测嵌合体序列，并最终去除其中的嵌合体序列[22]，得到最终的有效序列。
利用Uparse软件(v7.0.1001)[23]对所有样品的有效序列以97%的一致性进行操作分类单元(operational taxonomic unit，OTU)聚类，用Mothur软件与SILVA[24]的SSUrRNA数据库[25]进行物种注释分析(设定阈值为0.8~1.0)，在门、属水平下统计每个样品的菌群组成。各样品的数据经过均一化处理后，使用R软件绘制稀释曲线以评估测序深度，采用Qiime软件进行alpha多样性和beta多样性分析。
1.6 统计分析数据使用SAS 9.2软件进行单因素方差分析，并进行Duncan氏法多重比较检验，试验结果均以平均值和均方根误差(SEM)表示，P < 0.05表示差异显著。
2 结果与分析 2.1 发酵麸皮多糖对大鼠空肠组织中细胞因子含量的影响由表 1可知，低剂量组大鼠空肠组织中IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α的含量较对照组分别提高了16.95%、10.27%、4.88%和7.11%，但均未表现出显著差异(P>0.05)；而高剂量组空肠组织中上述细胞因子的含量较对照组均略有降低(P>0.05)，且TNF-α的含量显著低于低剂量组(P < 0.05)。
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表 1 发酵麸皮多糖对大鼠空肠组织中细胞因子含量的影响 Table 1 Effects of fermented wheat bran polysaccharides on cytokine contents in jejunum tissue of rats |
由表 2可知，低剂量组大鼠肝脏组织中IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α的含量与对照组相比总体呈现上升的趋势，分别提高了13.12%、7.58%、6.17%和10.08%，但无显著差异(P>0.05)；高剂量组大鼠肝脏组织中IL-1β、IL-2和IL-6的含量与对照组相比呈现下降趋势，其中IL-2的含量显著低于对照组和低剂量组(P < 0.05)。
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表 2 发酵麸皮多糖对大鼠肝脏组织中细胞因子含量的影响 Table 2 Effects of fermented wheat bran polysaccharides on cytokine contents in liver tissue of rats |
由表 3可知，灌胃低剂量发酵麸皮多糖后，大鼠脾脏组织中IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α的含量呈现升高的趋势，其中TNF-α含量显著高于对照组(P < 0.05)；灌胃高剂量发酵麸皮多糖后，大鼠脾脏组织中IL-1β、IL-2和IL-6的含量呈现降低的趋势，其中IL-6的含量显著低于低剂量组(P < 0.05)。
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表 3 发酵麸皮多糖对大鼠脾脏组织细胞因子含量的影响 Table 3 Effects of fermented wheat bran polysaccharides on cytokine contents in spleen tissue of rats |
通过对16S rDNA的V3~V4区进行双端测序，对照组、低剂量组和高剂量组分别获得原始序列56 023、62 852和62 603条，其中有效序列分别为49 606、61 400和61 271条。如图 1所示，以97%的一致性将有效数据聚类成为OTU，共获得767个OTU，对照组、低剂量组和高剂量组OTU数分别是657、662和681个，其中共有的是561个，约占总量的73%。由图 2可知，随着测序量的深入，稀释曲线趋于平坦，表明本试验测序数据量合理。
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C1：对照组；T1：低剂量组；T2：高剂量组。图 3同。 C1: control group; T1: low dose group; T2: high dose group. The same as Fig. 3. 图 1 OTU维恩图 Fig. 1 Venn diagram of OTU |
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C1.1、C1.2、C1.3、C1.4、C1.5为对照组样本；T1.1、T1.2、T1.3、T1.4、T1.5为低剂量组样本；T2.1、T2.2、T2.3、T2.4、T2.5为2高剂量组样本。下图同。 C1.1, C1.2, C1.3, C1.4 and C1.5 represented the samples in control group; T1.1, T1.2, T1.3, T1.4 and T1.5 represented the samples in low dose group; T2.1, T2.2, T2.3, T2.4 and T2.5 represented the samples in high dose group. The same as below. 图 2 稀释曲线 Fig. 2 Rarefaction curve |
由表 4可知，3组盲肠食糜的测序覆盖率为99.74%~99.76%。灌胃不同剂量发酵麸皮多糖后，大鼠盲肠菌群Shannon、Chao1和ACE指数表现出提高的趋势，但与对照组相比均差异不显著(P>0.05)。
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表 4 发酵麸皮多糖对大鼠盲肠菌群alpha多样性的影响 Table 4 Effects of fermented wheat bran polysaccharides on alpha diversity of caecal microflora of rats |
图 3显示，主成分因子1(PC1)的贡献率为15.31%，主成分因子2(PC2)的贡献率为10.21%。各组的5个样本均聚集在一起，且3个组之间的样本离散清晰。不同组间菌群结构具有一定的差异，灌胃发酵麸皮多糖影响了大鼠盲肠菌群结构。
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图 3 主成分分析图 Fig. 3 PCA profile |
如图 4所示，各组大鼠盲肠食糜中的优势菌门均为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)，三者之和所占比例在99.10%~99.67%，但各组大鼠盲肠食糜中优势菌门的相对丰度存在差异。对照组大鼠盲肠食糜中厚壁菌门的相对丰度较低，为49.68%，而拟杆菌门的相对丰度较高，为46.33%。与对照组相比，灌胃100和200 mg/kg BW发酵麸皮多糖均显著提高了大鼠盲肠食糜中厚壁菌门的相对丰度(P < 0.05)，分别提高至69.63%和71.56%，并显著降低了拟杆菌门的相对丰度(P < 0.05)，分别降低至27.01%和25.08%，但低剂量组和高剂量组之间差异不显著(P>0.05)。
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Others：其他；Fusobacteria:梭杆菌门; Saccharibacteria：糖杆菌门；Verrucomicrobia：疣微菌门；Actinobacteria：放线菌门；Deferribacteres：脱铁杆菌门；Tenericutes：软壁菌门；Cyanobacteria：蓝细菌门；变形菌门：Proteobacteria；拟杆菌门：Bacteroidetes；厚壁菌门：Firmicutes。 图 4 门水平上盲肠菌群分布图 Fig. 4 Distribution diagram of caecal microflora at phylum level |
由表 6可知，各组大鼠盲肠食糜中的优势菌属均为普氏菌属9(Prevotella_9)、毛螺菌科NK4A136类群(Lachnospiraceae_NK4A136_group)、未分类瘤胃菌科(Ruminococcaceae_unclassified)、瘤胃球菌属1(Ruminococcus_1)、瘤胃菌科UCG-005(Ruminococcaceae_UCG-005)、拟普雷沃菌属(Alloprevotella)、普雷沃氏菌科NK3B31类群(Prevotellaceae_NK3B31_group)、粪球菌属1(Coprococcus_1)、布劳特氏菌属(Blautia)，它们之和所占比例在32.11%~43.54%，但各组大鼠盲肠食糜中优势菌属的相对丰度存在差异。与对照组相比，低剂量组和高剂量组大鼠盲肠食糜中Prevotella_9的相对丰度均显著降低(P<0.05)，而低剂量组与高剂量组之间差异不显著(P>0.05)；低剂量组大鼠盲肠食糜中Ruminococcus_1的相对丰度和高剂量组大鼠盲肠食糜中Coprococcus_1的相对丰度均显著高于对照组(P<0.05)。
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表 6 盲肠菌群在属水平的显著性分析 Table 6 Significance analysis of caecal microflora at genus level |
大量研究表明，功能性多糖主要是通过促进免疫器官生长[26-27]、诱导免疫细胞成熟、分化和增殖[28]、激活补体系统[29]以及刺激免疫细胞(T细胞、B细胞、巨噬细胞)分泌细胞因子[30]等途径实现免疫调节作用。IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α是调节机体免疫功能的重要细胞因子。IL-1β由单核/巨噬细胞产生，具有促进T细胞和B细胞分化增殖和造血的作用。IL-2的主要作用是促进自然杀伤(NK)细胞和B细胞分化增殖，从而促进免疫球蛋白的产生。IL-6可以促进淋巴细胞的分化增殖，调节细胞免疫应答。TNF-α最主要的功能是参与机体防御反应，具有免疫调节及抗肿瘤的作用。Shen等[7]体外试验表明，麸皮多糖作为一种天然免疫调节剂，可以增强巨噬细胞的活性，促进TNF-α的分泌，其体内试验表明，灌胃100和200 mg/kg BW麸皮多糖可以通过提高免疫抑制小鼠血清IL-2和IFN-γ含量来提高其免疫力。与上述研究结果相似，本试验发现，灌胃100 mg/kg BW发酵麸皮多糖在一定程度上提高了大鼠各组织中IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α的含量，表明发酵麸皮多糖既能促进大鼠T细胞产生IL-2，也能促进单核/巨噬细胞产生IL-1β、IL-6和TNF-α。由此推断，低剂量发酵麸皮多糖能促进T细胞和单核/巨噬细胞增殖，提高组织中IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α的含量，有效增强大鼠免疫功能。然而，高剂量组大鼠组织中IL-1β、IL-2和IL-6的含量与对照组相比整体呈现下降的趋势，灌胃高剂量的发酵麸皮多糖可能会对大鼠的免疫功能产生负面效应，这与Shen等[7]研究得出的结论不同，可能是不同方法所得麸皮多糖的结构类型、理化性质、得率和活性有差异，有待进一步研究。
动物肠道内存在大量且组成复杂的菌群，通过影响膳食纤维消化、蛋白质代谢、短链脂肪酸形成和矿物质吸收等，调控动物机体营养物质代谢和免疫稳态[31]。已有大量学者使用实时荧光定量PCR和菌落计数法研究了功能性多糖对肠道菌群的影响，发现功能性多糖可增加肠道中双歧杆菌和乳酸菌等有益菌的数量，同时减少大肠杆菌和梭状芽孢杆菌等有害菌的数量，从而改善机体健康状况[32-34]。高通量测序技术克服了传统方法的局限性，可以比较客观、全面、快速地分析微生物群落的结构组成。已有研究发现，摄食功能性多糖可调整肠道菌群多样性和相对丰度，从而改善机体健康。例如，赵秋芳[27]利用高通量测序技术研究了中草药黑附片多糖对免疫抑制小鼠盲肠菌群多样性的影响，结果发现，灌胃黑附片多糖可显著提高反映菌群alpha多样性的Shannon和Chao1指数，提高脾脏组织中细胞因子IL-6和TNF-α mRNA的相对表达量，发挥免疫调节作用；王雪等[35]的研究显示，灌胃长根菇多糖组小鼠Shannon、Chao1和ACE指数提高，肠道菌群的丰富度增加。与前人的研究结果相似，本试验中，灌胃发酵麸皮多糖21 d后，大鼠盲肠食糜菌群Shannon、Chao1和ACE指数均有所增加，在一定程度上提高了大鼠肠道菌群的多样性和丰富度。本试验中大鼠盲肠食糜中的优势菌门为厚壁菌门和拟杆菌门，这与其他研究中报道的动物肠道中的优势菌门为厚壁菌门和拟杆菌门的结果相一致[36-38]。灌胃发酵麸皮多糖影响了大鼠盲肠菌群组成结构，在门水平上，显著增加了厚壁菌门的相对丰度，显著降低了拟杆菌门的相对丰度；在属水平上，显著降低了拟杆菌门中Prevotella_9的相对丰度，显著增加厚壁菌门中Ruminococcus_1和Coprococcus_1的相对丰度，表明发酵麸皮多糖改变了大鼠盲肠菌群的组成结构。功能性多糖影响动物肠道菌群结构组成已在其他研究中被广泛报道。赵秋芳[27]研究显示，黑附片多糖可显著增加小鼠盲肠食糜中厚壁菌门的相对丰度，但对拟杆菌门的相对丰度无显著影响；增加乳杆菌属(Lactobacillus)、粪球菌属(Coprococcus)、颤螺菌属(Oscillospir)、Candidatus Arthromitus等的相对丰度，降低拟杆菌属(Bacteroides)、普氏菌属(Prevotella)、梭菌属(Fusobacterium)、粪杆菌属(Faecalibacterium)等的相对丰度；王雪等[35]研究发现，长根菇多糖可提高昆明小鼠盲肠厚壁菌门相对丰度，降低拟杆菌门相对丰度，提高Allobaculum、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、Lactobacillus和瘤胃球菌属(Ruminococcus)的相对丰度。
在正常情况下，肠道菌群可以刺激动物机体在肠道中生成更多的免疫效应细胞，进而增加细胞因子的分泌，使机体免疫系统处于一种适度的活跃状态，以此对病原菌保持有效的免疫作用[39]。本试验中发现灌胃发酵麸皮多糖后大鼠盲肠食糜中短链脂肪酸产生菌Ruminococcus_1和Coprococcus_1的相对丰度显著提高。Du等[40]研究发现，与野生型小鼠相比，microRNA-146a缺陷型小鼠肠道中Blautia、Ruminococcus_1和Coprococcus_1等短链脂肪酸产生菌的相对丰度较高，其对单增李斯特菌感染抵抗力较强。赵秋芳[27]在小鼠脏器指数与肠道菌群的相关性分析结果中发现，随着小鼠盲肠中Coprococcus相对丰度的增加，胸腺指数也增加，它们之间呈显著正相关关系，该研究表明黑附片多糖主要通过改变免疫抑制小鼠的肠道菌群结构，进而提高小鼠的免疫力。Ruminococcus_1和Coprococcus_1都属于短链脂肪酸产生菌，其代谢产物短链脂肪酸可以作用于单核/吞噬细胞、淋巴细胞等免疫细胞，通过影响细胞因子释放、免疫趋化反应、促进免疫细胞增殖等参与免疫调节，在肠道抵御致病菌的过程中发挥作用[41-42]。本研究中发酵麸皮多糖能够增加大鼠空肠、肝脏及脾脏组织中细胞因子的含量，这可能表明发酵麸皮多糖可以通过促进短链脂肪酸产生菌的增殖，提高肠道内短链脂肪酸的含量，进而促进细胞因子的分泌，增强大鼠的免疫力。
4 结论① 本试验条件下，低剂量(100 mg/kg BW)发酵麸皮多糖有提高空肠、肝脏及脾脏组织中细胞因子IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α含量的趋势，而高剂量(200 mg/kg BW)发酵麸皮多糖会抑制空肠、肝脏及脾脏组织中细胞因子的分泌。
② 灌胃高、低剂量的发酵麸皮多糖均降低了大鼠盲肠食糜菌群中Prevotella_9的相对丰度，升高了Ruminococcus_1和Coprococcus_1的相对丰度，对盲肠菌群结构产生了影响。
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