蜂花粉是蜜蜂采集的有花植物的雄性生殖细胞,包含孕育生命所需的全部营养,有“完全营养库”的美誉[1-2],其营养成分包括蛋白质、脂类(主要为不饱和脂肪酸)、碳水化合物、多种维生素、微量元素等[3]。油菜是我国普遍种植的油料作物,油菜蜂花粉也成为我国最富产的花粉之一。近年来有许多关于油菜花粉化学成分分析以及其蜂花粉的免疫调节、抗疲劳、抑制肿瘤、抗氧化和抑制前列腺增生等生理药理作用方面的研究[4-6]。芦花鸡不仅外形美观、肉质鲜美,又因其优良的蛋品质而深受消费者的喜爱。但作为我国的地方鸡品种,芦花鸡的产蛋量和产蛋率一般较低。本试验以不同产蛋期的芦花鸡为研究对象,基于油菜蜂花粉的多种生理作用,比较饲粮添加不同水平油菜蜂花粉对芦花鸡生产性能、蛋品质和血清指标的影响,以期在蛋鸡饲养管理工作中寻求有利于地方鸡品种产蛋性能提高和优良蛋品质保持的绿色饲料添加剂,为蜂产品的开发和利用提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验设计试验1:选用32周龄(产蛋高峰期)、体型基本一致、产蛋率为70%左右的芦花鸡384只,随机分为4个组,每组4个重复,每个重复24只鸡。试验2:选用64周龄(产蛋后期)、体型基本一致、产蛋率为50%左右的芦花鸡60只,随机分为4个组,每组5个重复,每个重复3只鸡。对照组饲喂基础饲粮,试验组饲喂在基础饲粮中分别添加0.5%、1.0%和1.5%油菜蜂花粉的试验饲粮。产蛋高峰期和产蛋后期的基础饲粮参照NRC(1994)配制,分别见表 1和表 2。油菜蜂花粉为山东蒙阴生产,色泽纯正,干燥而无结块。饲养试验分别在济宁大唐百日鸡养殖场和山东农业大学动物科技学院试验站进行。
试验鸡采用2层阶梯式笼养,每个笼子3只鸡。每天定时(06:00、12:00)饲喂2次,自由采食和饮水,自动控制光照时间为16.5 h/d,鸡舍内温度为25~34 ℃。常规免疫,其他均按鸡场常规管理进行。试验1基础饲粮预饲2周,正试期为8周;试验2基础饲粮预饲2周,正试期为6周。
1.3 样品采集与指标测定 1.3.1 生产性能试验期间,试验1和试验2均记录每天每个重复的产蛋数、产蛋重,统计每周每个重复的采食量,计算料蛋比、产蛋率、平均蛋重和平均日采食量。
1.3.2 蛋品质试验1分别于第4周和第8周取样,每个重复随机抽取5个鸡蛋,每组采集20个鸡蛋进行蛋品质测定;试验2分别于第2周、第4周和第6周取样,每个重复随机抽取3个鸡蛋进行蛋品质测定。使用蛋壳强度测试仪(EFG-050型,日本Robotmation公司)检测蛋壳强度;使用蛋壳厚度测量仪(ETG-1061型,日本Robotmation公司)检测蛋壳厚度;使用游标卡尺检测蛋形指数;使用电子天平检测蛋黄重量、蛋壳重量;使用色差仪(CR-10型,日本Konica Minolta公司)检测蛋壳颜色(包括蛋壳亮度和颜色);使用多功能蛋品质检测仪(EMT-5200型,日本Robotmation公司)检测蛋黄颜色、哈氏单位和蛋白高度。
1.3.3 繁殖性能试验1于试验期间进行人工授精,分别于第3周、第4周、第7周、第8周每周连续收集6 d的种蛋,以重复为单位标记并孵化。记录每个重复的产蛋总数、合格种蛋数和入孵蛋数。入孵后进行2次照蛋,第5~6天时检查记录无精蛋并剔除;第11天左右时验出死胚蛋,并且在孵化完成时记录每个重复的出雏数。统计每个重复的繁殖性能指标,计算种蛋合格率、受精率、孵化率(受精蛋孵化率和入孵蛋孵化率)。
试验结束时,每个重复随机选取3只芦花鸡,翅静脉采血3~5 mL,将血液常温倾斜静置待血清析出,3 000 r/min离心15 min,取血清于-20 ℃保存备检。试验1血清用于脂代谢指标和抗氧化指标检测,使用全自动生化分析仪(7170A型,日本HITA-CHI公司)测定血清葡萄糖(GLU)、总胆固醇(TCHO)和甘油三酯(TG)含量;使用试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定血清总抗氧化能力(T-AOC)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。试验2血清用于免疫指标检测,使用试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定血清免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)和白细胞介素-2(IL-2)含量。
1.4 统计分析所有试验数据经Excel 2003初步处理后,利用SPSS 22.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),Tukey’s法进行多重比较。P<0.05表示差异显著,试验数据以“平均值±标准误”表示。利用Excel 2003绘制散点图进行回归分析,R2接近于1说明拟合效果较好。
2 结果 2.1 饲粮添加油菜蜂花粉对芦花鸡生产性能的影响 2.1.1 饲粮添加油菜蜂花粉对产蛋高峰期芦花鸡生产性能的影响饲粮添加油菜蜂花粉对产蛋高峰期芦花鸡生产性能的影响见表 3(试验1)。由表可知,与对照组相比,饲粮添加0.5%、1.0%和1.5%油菜蜂花粉对产蛋高峰期芦花鸡的产蛋率、平均日采食量、平均蛋重和料蛋比均无显著影响(P>0.05)。
饲粮添加油菜蜂花粉对产蛋后期芦花鸡生产性能的影响见表 4(试验2)。由表可知,与对照组相比,1.0%油菜蜂花粉添加组产蛋后期芦花鸡的产蛋率显著升高(P < 0.05);饲粮添加0.5%、1.0%和1.5%油菜蜂花粉对产蛋后期芦花鸡的平均日采食量、料蛋比和平均蛋重均无显著影响(P>0.05)。
2.2 饲粮添加油菜蜂花粉对芦花鸡蛋品质的影响 2.2.1 饲粮添加油菜蜂花粉对产蛋高峰期芦花鸡蛋品质的影响饲粮添加油菜蜂花粉对产蛋高峰期芦花鸡蛋品质的影响见表 5和表 6(试验1)。由表 5可知,第4周时,1.5%油菜蜂花粉添加组产蛋高峰期芦花鸡的蛋壳黄度(b*)值显著高于对照组(P < 0.05);由表 6可知,第8周时,1.5%油菜蜂花粉添加组产蛋高峰期芦花鸡的蛋黄颜色显著高于对照组(P < 0.05);整个试验期间,饲粮添加油菜蜂花粉对产蛋高峰期芦花鸡的蛋白高度、哈氏单位、蛋壳厚度、蛋壳强度、蛋黄比率、蛋白比率和蛋形指数均无显著影响(P>0.05)。
饲粮添加油菜蜂花粉对产蛋后期芦花鸡蛋品质的影响见表 7、表 8和表 9(试验2)。由表可知,第4周和第6周时,1.0%油菜蜂花粉添加组产蛋后期芦花鸡的蛋壳黄度值显著低于对照组(P < 0.05);饲粮添加0.5%、1.0%和1.5%油菜蜂花粉对产蛋后期芦花鸡的蛋白高度、哈氏单位、蛋壳厚度、蛋壳强度、蛋黄比率、蛋白比率和蛋形指数均无显著影响(P>0.05)。
2.3 饲粮添加油菜蜂花粉对产蛋高峰期芦花鸡繁殖性能的影响饲粮添加油菜蜂花粉对产蛋高峰期芦花鸡繁殖性能的影响见表 10(试验1)。由表可知,饲粮添加油菜蜂花粉对产蛋高峰期芦花鸡的种蛋合格率、受精率、受精蛋孵化率和入孵蛋孵化率均无显著影响(P>0.05)。
2.4 饲粮添加油菜蜂花粉对芦花鸡血清指标的影响 2.4.1 饲粮添加油菜蜂花粉对芦花鸡血清脂代谢指标的影响饲粮添加油菜蜂花粉对芦花鸡血清脂代谢指标的影响见表 11。由表可知,与对照组相比,饲粮添加0.5%、1.0%和1.5%油菜蜂花粉对芦花鸡血清葡萄糖含量无显著影响(P>0.05);1.5%油菜蜂花粉添加组芦花鸡的血清总胆固醇含量显著降低(P < 0.05);0.5%和1.0%油菜蜂花粉添加组芦花鸡的血清甘油三酯含量显著降低(P < 0.05)。
2.4.2 饲粮添加油菜蜂花粉对芦花鸡血清抗氧化指标的影响饲粮添加油菜蜂花粉对芦花鸡血清抗氧化指标的影响见表 11。由表可知,与对照组相比,1.0%和1.5%油菜蜂花粉添加组芦花鸡的血清丙二醛含量显著降低(P < 0.05);1.5%油菜蜂花粉添加组芦花鸡的血清总抗氧化能力显著升高(P < 0.05);0.5%和1.0%油菜蜂花粉添加组芦花鸡的血清总超氧化物歧化酶活性显著升高(P < 0.05)。
2.4.3 饲粮添加油菜蜂花粉对芦花鸡血清免疫指标的影响饲粮添加油菜蜂花粉对芦花鸡血清免疫指标的影响见表 11。由表可知,与对照组相比,0.5%和1.5%油菜蜂花粉添加组芦花鸡的血清免疫球蛋白G含量显著升高(P < 0.05);1.0%油菜蜂花粉添加组芦花鸡的血清免疫球蛋白A含量显著升高(P < 0.05);饲粮添加油菜蜂花粉对芦花鸡的血清白细胞介素-2含量无显著影响(P>0.05)。
3 讨论 3.1 饲粮添加油菜蜂花粉对芦花鸡生产性能的影响产蛋量的高低是评定蛋鸡生产性能的一个十分重要的指标。蛋鸡的产蛋量具有较高的遗传力,我国地方鸡品种产蛋量一般较低,屠云洁等[7]比较不同品系芦花鸡的生产性能,发现汶上芦花鸡的高峰期产蛋率仅为73%。本试验研究发现,饲粮添加不同水平油菜蜂花粉对产蛋高峰期芦花鸡的产蛋率无显著影响,但可使产蛋后期芦花鸡的产蛋率升高,且1.0%添加水平效果显著。需要指出的是,在芦花鸡产蛋后期,饲粮添加油菜蜂花粉使产蛋率提高的同时并没有对平均日采食量产生显著影响,因而相应油菜蜂花粉添加组的料蛋比会降低。从长远上看,饲粮添加油菜蜂花粉可以有效提高芦花鸡产蛋末期产蛋的持续性,进而改善其生产性能。这可能与蜂花粉所含激素样物质及参与动物繁殖相关的下丘脑-腺垂体-性腺轴的调控过程有关,进而在一定程度上促进蛋鸡卵泡的发育和成熟,抑制卵泡闭锁的发生,促进排卵[8]。杨开等[9]通过优化油菜花粉甾醇的纯化工艺,得到纯度达(93.73±1.06)%的油菜花粉甾醇提取物,且分析其主要含47.35%的豆甾醇、32.36%的菜油甾醇以及15.18%的β-谷甾醇。王龙昌等[10]研究发现,植物甾醇能使产蛋后期蛋鸡的血清雌二醇含量显著升高。雌二醇可提高血钙、血脂和机体蛋白质含量,以适应卵泡发育和蛋壳形成的需要。王珏等[11]研究显示,饲粮添加1.5%蜂花粉可显著提高蛋鸡的产蛋率和甲状腺的功能和活性,有利于蛋白质的合成,进而提高蛋鸡的生产性能。
蛋重受遗传、性成熟阶段、年龄、某些药剂及营养等多方面因素的影响。其中饲粮中亚油酸、能量和蛋白质水平是主要的营养因素[12]。进入产蛋后期的蛋鸡较易因采食量过高而导致脂肪的大量沉积,体重过肥进而使产蛋率下降。本试验结果显示,饲粮添加不同水平油菜蜂花粉对不同产蛋期芦花鸡的平均蛋重、料蛋比和平均日采食量均无显著影响。
3.2 饲粮添加油菜蜂花粉对芦花鸡蛋品质的影响蛋黄的色素沉积很大程度上依赖于类胡萝卜素的数量和种类,而家禽自身不能合成这些色素物质,需从饲粮中摄入。杨雨鑫等[13]将富含胡萝卜素(100~550 mg/kg)的苜蓿草粉添加到蛋鸡饲粮中,结果显示,苜蓿草粉添加组的蛋黄颜色均极显著高于对照组,且蛋黄颜色随苜蓿草粉添加水平的增加呈上升趋势。这表明高水平的类胡萝卜素被蛋禽吸收后沉积于蛋黄中,加深了蛋黄颜色。杨寒冰等[14]对4种花粉成分进行分析,结果显示,油菜花粉中胡萝卜素的含量为0.19 mg/kg。本试验结果显示,1.5%油菜蜂花粉添加组产蛋高峰期芦花鸡(第8周)的蛋黄颜色显著高于对照组,这与王珏等[15]研究1.5%饲料级复合花粉对罗曼褐壳蛋鸡蛋品质影响的结果相一致,可能与蜂花粉中所含的胡萝卜素有关。
蛋壳颜色常常被消费者作为衡量蛋品质的指标,具有一定的偏向性。鸡群的生产水平一致性以及品种的纯度在一定程度上均可通过蛋壳颜色的均匀度来反映,蛋色均匀度高说明该品种的蛋色沉着好,生产性能较为一致[16]。本试验的蛋壳颜色采用Lab色度系统从蛋壳亮度(L*)、红度(a*)和黄度值3个方面进行评价。蛋壳亮度值越大,颜色越偏向白色,反之偏向黑色。蛋壳红度值为红绿色品,+a*表示红色方向,-a*表示绿色方向。蛋壳黄度值为黄蓝色品,+b*为黄色方向,-b*为蓝色方向。本试验结果表明,对于产蛋高峰期和产蛋后期芦花鸡,饲粮添加1.5%和1.0%油菜蜂花粉对蛋壳黄度值的不同偏向影响显著,从而改善蛋壳颜色。
3.3 饲粮添加油菜蜂花粉对芦花鸡繁殖性能的影响种蛋合格率、受精率和孵化率通常被用来表征蛋鸡的繁殖性能。受精情况一定程度上受限于精液品质和人工授精技术等因素,蛋的大小、结构以及蛋壳的厚度、强度等均不同程度影响着种蛋的孵化效果。胚胎正常生长发育与种蛋中的营养成分密切相关,这些营养供应源于种鸡饲粮及新陈代谢。种鸡的营养缺乏、过量以及各种营养成分之间的互作对孵化率和胚胎发育具有重要影响[12]。本试验研究结果表明,饲粮添加不同水平油菜蜂花粉并未对芦花鸡的种蛋合格率、受精率以及孵化率产生显著影响,或因受试芦花鸡的孵化率已处于最佳水平,生长繁殖状态相对稳定。
3.4 饲粮添加油菜蜂花粉对芦花鸡脂代谢的影响研究指出,多不饱和脂肪酸(PUFAs)能够参与降血脂调节,多不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸(SFAs)含量比值超过1的天然食品对防治心血管病、降血脂有积极作用[17]。李璐等[18]在优化油菜花粉总脂肪酸提取工艺的基础上进一步对提取物进行醇洗除杂,经该新工艺处理后,分析得出油菜花粉中总脂肪酸的质量分数高达60%左右。高丽娇等[19]对4种花粉中的脂肪酸类成分的测定结果表明,油菜花粉中的α-亚麻酸含量极高,占总脂肪酸的46.93%。另外,测得油菜花粉中饱和脂肪酸含量为31.22 mg/g,不饱和脂肪酸(UFA)含量达59.84 mg/g,其中多不饱和脂肪酸占60.82%。可知多不饱和脂肪酸的含量高于饱和脂肪酸的含量,其比值大于1,这意味着其降血脂作用可能会十分显著。
解大建等[20]在研究油菜花粉对大鼠血清胆固醇、甘油三酯和脂肪酸含量的影响时发现,油菜花粉具有阻止膳食诱致血清胆固醇和甘油三酯含量升高的作用。涂文利[21]采用超临界二氧化碳萃取法制备油菜花粉萃取物,得到以α-亚麻酸为主的不饱和脂肪酸油脂,且该萃取物可通过增加高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和卵磷脂(LCAT)含量,促进胆固醇的转运代谢和排出,抑制3-羟甲基-3-戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶活性,减少胆固醇体内合成,提高二十二碳六烯酸(DHA)含量,进而发挥降血脂作用。陈小夏等[22]研究也表明,油菜花粉提取物具有调血脂作用,包括显著降低高脂血大鼠血清总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量,提高高密度脂蛋白胆固醇含量,降低总胆固醇/高密度脂蛋白胆固醇等。本试验结果表明,饲粮添加1.5%油菜蜂花粉可显著降低芦花鸡的血清总胆固醇含量,添加0.5%和1.0%油菜蜂花粉可显著降低血清甘油三酯含量,进一步验证了蜂花粉调节血脂的功能。
孙岩等[23]研究油菜蜂花粉黄酮体外降糖活性,结果显示,当油菜蜂花粉总黄酮含量达到一定值后,黄酮类物质在抑制α-葡萄糖苷酶活性中起主要作用。本试验结果并未发现饲粮添加油菜蜂花粉会对芦花鸡血糖含量产生显著影响,初步推测可能与受试鸡的健康状况以及油菜蜂花粉的添加水平有关。
3.5 饲粮添加油菜蜂花粉对芦花鸡抗氧化能力的影响研究表明,蜂花粉具有一定的抗氧化活性[24-25],有关其作用机理的研究表明,蜂花粉总黄酮对羟基自由基(·OH)、超氧阴离子自由基(O2-·)、二苯代苦味酰基(DPPH)自由基皆有清除作用,是蜂花粉抗氧化的主要活性物质[26],且黄酮类化合物含量与其抗氧化活性呈正相关,即黄酮类化合物含量越高,其抗氧化活性越强[27]。研究表明,油菜蜂花粉总黄酮含量在12.5~100.0 μg/mL[28]。张红城等[29]对6种不同蜂花粉中总黄酮含量及抗氧化能力的比较中发现,油菜蜂花粉中黄酮类成分的含量最高,对DPPH自由基的抑制作用也最强。杨佳林等[30]对蜂花粉酚类化合物中黄酮醇的抗氧化能力进行了研究,采用薄层层析(TLC)-DPPH技术对油菜花粉乙醇提取物及其酸解液中抗氧化成分进行了追踪,得到槲皮素(比移值为0.59)含量为0.40 mg/g、山奈酚(比移值为0.71)含量为3.98 mg/g的乙醇提取物的酸解产物,表明该酸解液的DPPH自由基清除力更强,抗氧化能力更高。
此外,徐响等[31]对8种常见蜂花粉油脂的抗氧化活性和类胡萝卜素含量进行了评价,结果显示,油菜花粉油脂有较高的抗氧化活性,且油脂抗氧化活性与类胡萝卜素含量呈正相关,这也说明了蜂花粉油脂中的类胡萝卜素类物质可能是其抗氧化活性的主要成分之一。杨开等[9]还发现油菜花粉总甾醇提取物对DPPH自由基、2, 2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸(ABTS)自由基和超氧阴离子自由基的清除率分别为(80.75±2.50)%、(72.22±2.85)%和(85.45±1.98)%,具有一定的抗氧化能力。杨晓萍等[32]发现以油菜蜂花粉为原料提取制备的油菜花粉多糖(RPP)可通过增强机体抗氧化能力而抑制肿瘤生长,具体表现为荷瘤小鼠的血清超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性增强,血清乳酸脱氢酶活性和丙二醛含量降低。
由此可见,蜂花粉中丰富的营养成分为其抗氧化作用的发挥提供了充足的物质基础。本试验将不同水平油菜蜂花粉添加至芦花鸡的基础饲粮中,探究其体内抗氧化功能,结果显示,与对照组相比,1.5%油菜蜂花粉添加组芦花鸡的血清总抗氧化能力显著升高,0.5%和1.0%油菜蜂花粉添加组芦花鸡的血清总超氧化物歧化酶活性显著升高,且1.0%和1.5%油菜蜂花粉添加组芦花鸡的血清丙二醛含量显著降低,说明饲粮添加油菜蜂花粉能够使芦花鸡的抗氧化能力得到加强。
3.6 饲粮添加油菜蜂花粉对芦花鸡免疫功能的影响研究表明,花粉多糖可以通过活化对肿瘤细胞有强杀伤力的巨噬细胞、淋巴T细胞和B细胞,产生淋巴因子和抗体,间接发挥抗肿瘤作用[33-35]。王博[36]以油菜蜂花粉为材料,采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法检测其对结肠癌细胞HCT116和肿瘤细胞HT29的作用,发现其对2种细胞的体外增殖具有良好的抑制作用,且抑制效果与蜂花粉多糖的浓度有关。研究表明,在家禽饲粮中添加蜂花粉,可促进胸腺、腔上囊的早期发育,延缓腔上囊退化,增强脾的免疫应答反应[37]。付越等[38]发现蜂花粉添加组海蓝褐蛋鸡的脾脏指数和外周血T细胞转化率均升高,且发病率降低。
本试验通过对血清中免疫相关的免疫球蛋白和淋巴因子含量进行评价,发现饲粮添加不同水平油菜蜂花粉对血清白细胞介素-2含量无显著影响,但可以不同程度地升高血清免疫球蛋白G、免疫球蛋白A含量,说明饲粮添加油菜蜂花粉可以一定程度上增强机体的免疫力。
3.7 饲粮中油菜蜂花粉的适宜添加水平就饲粮中油菜蜂花粉添加水平与其产生显著影响的各指标间分别进行回归分析,其中以油菜蜂花粉添加水平与产蛋率和血清甘油三酯含量之间拟合效果较好,构建的回归模型分别为:y=-25.050x2+40.009x+36.305,R2=0.919 9;y=7.370x2-14.061x+23.560,R2=0.940 5。进一步求得最适添加水平分别为0.80%和0.95%,即饲粮中油菜蜂花粉添加水平为0.80%~0.95%时效果较好。
4 结论饲粮添加油菜蜂花粉不仅可以提高产蛋后期芦花鸡的生产性能,还可以促进蛋黄色素沉积,加深蛋黄颜色;同时,油菜蜂花粉还具有降血脂、提高抗氧化能力和增强免疫的作用。油菜蜂花粉可以作为绿色饲料添加剂应用于芦花鸡生产中,以添加水平为0.80%~0.95%时效果较好。
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