2. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 动物营养学国家重点实验室, 北京 100193
2. State Key Laboratory of Animal Nutrition, Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China
随着高产母猪的选育和母猪营养技术的改善，虽然增加了母猪的产活仔数，但也增加了每窝低初生重仔猪的数量[1]。由于每头母猪带仔数量有限，因此以人工乳饲喂作为母乳饲喂的替代饲养体系的需要也在日益增加[2]。目前评定人工乳对哺乳仔猪影响的研究所采用的饲喂模式差异较大且饲喂效果也存在一定差异。一部分研究采用大于或等于每天12次以上的饲喂频次[2-3]，其他研究采用每天6次左右的饲喂频次[4-5]。研究表明，间断饲喂(每天饲喂6次)与连续饲喂(每分钟每千克体重进食167 μL)相比能显著提高哺乳仔猪生长性能和瘦肉沉积[6-7]。本课题组前期的研究发现，降低饲喂频率能显著改善生长育肥猪生长性能并提高骨骼肌蛋白质合成相关蛋白的表达[8]。骨骼肌作为机体最大的组织，其生长和蛋白质沉积能力决定着哺乳仔猪的生长性能[9]。前人研究发现，短期间断饲喂相对连续饲喂能显著提高新生仔猪骨骼肌和内脏器官的蛋白质合成能力[10]。但目前关于饲喂频率是否影响哺乳仔猪生长性能和骨骼肌蛋白质合成尚不清楚，有待研究。
骨骼肌蛋白质沉积主要受到正向和反向的级联信号调控。正向信号为胰岛素和胰岛素样生长因子1(IGF1)信号通路，通过结合相应的受体[胰岛素受体(INSR)或胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)]，激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)[11]。反向信号为肌肉生长抑制素，通过结合相应受体产生一系列级联信号抑制肌肉生长和蛋白质沉积[12]。胰岛素和IGF1激活mTOR后，可磷酸化其下游靶蛋白，真核起始因子和核糖体蛋白S6(RPS6)，进而启动翻译和蛋白质合成[13]。基于此，推测饲喂频率可能通过调控蛋白质合成信号进而影响哺乳仔猪生长性能和骨骼肌生长。因此，本研究旨在通过比较饲喂6次和饲喂12次仔猪骨骼肌蛋白质沉积及其相关基因表达差异，揭示饲喂频率对哺乳仔猪骨骼肌生长的影响及分子机制，为人工乳饲喂哺乳仔猪制定合理饲喂模式提供参考依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物与试验设计试验所用仔猪从4头体况接近、胎次相近和产期一致的“长×大”二元母猪所产“杜×长×大”新生仔猪中选取。每头母猪选取体重接近的2头新生公猪和2头新生母猪，待采食初乳36 h后断奶，随后用人工乳以奶瓶饲喂的方式进行采食训练36 h。于4日龄时，16头仔猪按体重和性别配对成8对，每对仔猪随机分配到每天饲喂6次组(M6组)和每天饲喂12次组(M12组)，每组8头猪。M6组仔猪于4日龄开始试验，M12组仔猪于5日龄开始试验。试验期为21 d。
1.2 试验饲粮与饲养管理饲粮为人工乳，由代乳粉加水配制而成，按照代乳粉:水=1 : 4的比例加40 ℃温开水，充分溶解混匀。代乳粉参照前人研究结果[14]进行配制，饲粮组成及营养水平见表 1。所有仔猪单笼饲养于代谢笼中。试验前对圈舍及代谢笼进行冲洗、干燥和全面消毒。试验全期温度控制在28~32 ℃，相对湿度控制在60%左右。每天饲喂时间在06：00—24：00，M6组仔猪每3.0 h饲喂1次，M12组仔猪每1.5 h饲喂1次。M6组仔猪全期自由采食，并记录每天采食量，记录干物质采食量。M6组仔猪前1天的采食量等分为12份于第2天饲喂M12组配对仔猪。试验期间未对仔猪使用任何抗生素类药物。
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表 1 饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the diet (DM basis) |
于各组的试验第8天、第15天和第22天清晨，对仔猪进行称重，记录每周末重。
1.3.1 血液样品采集于各组试验的第22天清晨称重结束后，对仔猪进行前腔静脉采血，并将血液转入含肝素钠的真空采血管中缓慢混匀，3 500 r/min离心10 min制备血浆，吸取上清液于0.5 mL EP管中，置于-20 ℃保存待测。
1.3.2 肌肉分离、胴体分割和肌肉样品采集血液样品采集结束后，对仔猪进行麻醉屠宰，打开腹腔，移除所有内脏，并迅速剥离左侧和右侧胴体第1胸椎至最后胸椎间的背最长肌以及臀部的半腱肌，剔除肌肉表面异物并进行称重。待肌肉称重后，采集右侧胴体最后胸椎的背最长肌装于冻存管中，经液氮速冻后，于-80 ℃冰箱保存待测。右侧胴体参照Rehfeldt等[15]方法分成腰段、颈段和腿部，在4 ℃下放置36 h后进一步分离成瘦肉、脂肪、骨和皮，并进行称重。
1.4 测定指标与方法 1.4.1 生长性能根据各组仔猪初始体重、干物质采食量和每周末重计算每周和全期的平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。
1.4.2 肌肉重量和胴体组成使用电子秤对左侧和右侧胴体的背最长肌和半腱肌称重，并计算2种肌肉的总重。将右半侧胴体分为腰段、颈段和腿部，进一步分离为骨骼、皮肤、肌肉和脂肪4种组织。参照农业行业标准NY/T 825—2004计算瘦肉率与肥肉率，并稍作调整。公式如下：
瘦肉率(%)＝[瘦肉重(kg)+右侧背最长肌重(kg)+右侧半腱肌重(kg)]/[瘦肉重(kg)+脂肪重(kg)+骨重(kg)+皮重(kg)+右侧背最长肌重(kg)+右侧半腱肌重(kg)]×100；
肥肉率(%)＝脂肪重(kg)/[瘦肉重(kg)+脂肪重(kg)+骨重(kg)+皮重(kg)+右侧背最长肌重(kg)+右侧半腱肌重(kg)]×100。
1.4.3 血浆胰岛素和IGF1含量采用北京诚林生物科技有限公司的酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒测定血浆胰岛素和IGF1含量，测定步骤按照说明书操作进行。
1.4.4 背最长肌蛋白质合成基因mRNA表达量测定总RNA提取采用Bio-Rad Aurum Total RNA Fatty and Fibrous Tissue Kit (Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，美国)进行提取。RNA纯度和浓度使用NanoDrop ND-1000(Nanodrop Technologies，Thermo Scientific，Wilmington，DE，美国)测定。采用ImProm-Ⅱ cDNA synthesis kit(Promega，Madison，WI，美国)进行cDNA合成。
实时荧光定量PCR测定背最长肌蛋白质合成相关基因，包括：INSR、IGF1、IGF1R、mTOR、RPS6、真核细胞翻译起始因子4E(EIF4E)、核心蛋白聚糖(DCN)、卵泡抑素(FST)、肌肉生长抑素(MSTN)、ⅡB型活化素受体(ACVR2B)和Ⅰ型活化素受体样激酶5(ALK5)。荧光定量PCR反应体系为10 μL：2 μL cDNA，2 μL无RNA酶水，上、下游引物各0.5 μL(5 μmol/L)和5 μL 2×KAPA SYBR FAST qPCR Kit Master Mix。反应条件为：预变性95 ℃ 3 min，40个循环变性/退火/延伸(95 ℃ 20 s，60 ℃ 40 s)和熔解曲线过程(70 ℃至90 ℃，每5 s上升0.5 ℃)。以TATA盒结合蛋白(TBP)、拓扑异构酶Ⅱβ(TOP2B)和肌动蛋白(ACTB)作为内参基因，并用qBase软件中的geNorm计算内参基因的平均表达稳定值(M)，确保内参基因选择的正确性，同时计算每个样本的校正参数(normalization factor)，用来计算目的基因的mRNA相对表达量。基因引物序列见表 2。
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表 2 基因引物序列 Table 2 Primer sequences of genes |
以猪只为试验单元(n=8)对数据进行统计分析，数据表示为平均值±标准差(mean±SD)。所有数据采用SAS 9.0软件进行正态性检验，符合正态分布的数据采用配对t检验进行显著性分析，非正态分布的数据采用wilcoxon两样本秩和检验进行显著性分析。以P < 0.05视为差异显著，0.05≤P < 0.10视为有趋势。
2 结果 2.1 试验全期采食量及饲喂频率对哺乳仔猪生长性能的影响如图 1所示，试验第1天到第7天，采食量随日龄的变化较小且组内变异小；试验第7天以后，采食量随日龄的增加而增加且组内变异变大。本试验采用配对设计，2组的采食量相同。
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图 1 试验期采食量 Fig. 1 Feed intake over test period |
如图 2所示，饲喂频率对试验第1周和第2周时仔猪的体重没有显著影响(P>0.05)；试验第3周时，M6组仔猪体重显著高于M12组(P < 0.05)。
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*：组间差异显著(P < 0.05)。 *:significant difference between groups (P < 0.05). 图 2 饲喂频率对试验期哺乳仔猪体重的影响 Fig. 2 Effects of meal frequency on body weight of suckling piglets over test period |
如表 3所示，饲喂频率对仔猪第1周ADG和F/G均没有显著影响(P>0.05)；与M12组相比，M6组仔猪第2周、第3周和试验全期的ADG显著提高且F/G显著降低(P < 0.05)。
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表 3 饲喂频率对哺乳仔猪平均日增重和料重比的影响 Table 3 Effects of meal frequency on average daily gain and feed to gain ratio of sucking piglets |
如表 4所示，与M12组相比，M6组仔猪胴体瘦肉率显著提高(P < 0.05)；饲喂频率对仔猪胴体肥肉率没有显著影响(P>0.05)。增加饲喂频率显著降低了背最长肌和半腱肌的重量(P < 0.05)。饲喂频率对仔猪血浆胰岛素和IGF1含量没有显著影响(P>0.05)。
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表 4 饲喂频率对哺乳仔猪胴体组成、肌肉重量和血浆激素含量的影响 Table 4 Effects of meal frequency on carcass composition, muscle weight and plasma hormones contents of sucking piglets |
如表 5所示，饲喂频率对仔猪背最长肌INSR、DCN、FST和MSTN mRNA表达量没有显著影响(P>0.05)。与M12组相比，M6组仔猪背最长肌IGF1 mRNA表达量有提高的趋势(P=0.05)；M6组仔猪背最长肌IGF1R、mTOR、RPS6、EIF4E mRNA表达量显著提高, 而ACVR2B和ALK5 mRNA表达量显著降低(P < 0.05)。
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表 5 饲喂频率对哺乳仔猪背最长肌蛋白质合成基因mRNA表达量的影响 Table 5 Effects of meal frequency on mRNA expression of genes related to protein synthesis in longissimus muscle of sucking piglets |
在早产婴儿和低初生重婴儿上的研究指出，间隔饲喂相较于连续性饲喂可促进婴儿的生长[16-17]。猪上的研究表明，整个哺乳期间隔饲喂相较于连续性饲喂可显著提高试验第9天后的体重，提高全期日增重并降低料重比[6]。本研究结果表明，与M12组相比，M6组可显著提高末重和全期ADG并降低F/G，本研究结果与前人研究结果基本一致，说明降低饲喂频率可改善哺乳仔猪全期生长性能。
3.2 饲喂频率对哺乳仔猪胴体组成、肌肉重量和血浆激素含量的影响前人研究发现，与连续饲喂相比，短期间隔饲喂可促进哺乳仔猪骨骼肌蛋白沉积[18]。Gazzaneo[19]发现，采食-禁食循环可促进猪骨骼肌蛋白质的合成。前人采用双X射线扫描手段比较间隔饲喂与连续饲喂仔猪体成分的差异发现，间隔饲喂可显著提高机体瘦肉率，对肥肉率没有显著影响。此外，间隔饲喂可显著提高仔猪背最长肌、比目鱼肌和腓肠肌的重量[6]。本研究发现，与M12组相比，M6组胴体瘦肉率、背最长肌重量和半腱肌重量显著提高，本研究结果与前人研究结果一致，说明降低饲喂频率可促进哺乳仔猪骨骼肌的生长。本课题组前期研究发现，降低饲喂频率降低了胴体重以及骨骼肌中与蛋白质和氨基酸代谢相关蛋白的表达[8]。育肥猪上的研究，降低饲喂频率显著降低了采食量，而本研究采用配对设计，组间采食量一致，采食量的异同可能是本研究与前期研究结果不一致的原因。间隔饲喂可导致餐后出现高峰值的血浆胰岛素含量，当胰岛素含量超过一定阈值后可刺激蛋白质的合成[6]。Newman等[20]发现，餐后高含量胰岛素引起的蛋白质合成是较低饲喂频率组骨骼肌重量和胴体瘦肉率增加的主要原因。本研究结果表明，饲喂频率对哺乳仔猪血浆胰岛素和IGF1含量无显著影响，与前人研究结果不一致。生理状态下，胰岛素呈脉冲样式分泌，在餐后2~3 h可恢复到基础水平[6]，而本研究血浆采集于所有仔猪禁食大于5 h之后，故而不同饲喂频率组仔猪血浆胰岛素含量没有差异。此外，前人采用连续饲喂可抑制餐后的胰岛素分泌，间隔饲喂与其相比可极大的增加餐后胰岛素分泌[6]；而本试验中12次饲喂与6次饲喂对餐后胰岛素分泌的影响可能一致，但有待进一步研究。血液中的IGF1主要来源于肝脏，受生长激素的调控[21]。研究发现骨骼肌蛋白质沉积和生长主要受肌肉本身分泌的IGF1而不是循环血中的IGF1调控[22]。因此，本试验中较低饲喂频率可能促进骨骼肌本身IGF1的分泌。
3.3 饲喂频率对哺乳仔猪背最长肌蛋白质合成基因表达的影响为了验证饲喂频率是否促进骨骼肌本身IGF1的分泌，本研究检测了背最长肌中IGF1的mRNA表达量，发现降低饲喂频率有提高背最长肌IGF1 mRNA表达量的趋势。此外，本研究发现，饲喂频率对背最长肌INSR mRNA表达量没有显著影响。胰岛素与INSR结合，激发一系列级联信号促进蛋白质合成[11]。研究表明，间隔饲喂与连续饲喂相比显著提高了猪背最长肌INSR和磷酸化INSR的表达[6]。本研究结果与前人研究结果不一致，说明饲喂频率调控骨骼肌蛋白质沉积可能不通过胰岛素-INSR途径，但有待进一步研究证实。IGF1与IGF1R结合，进而激活mTOR，mTOR激活后可磷酸化EIF4E和RPS6，进而启动翻译和蛋白质的合成[13]。本研究发现，与M12组相比，M6组背最长肌IGF1R、mTOR、EIF4E和RPS6的mRNA表达显著提高，说明降低饲喂频率可能通过激活IGF1-IGF1R-mTOR通路促进骨骼肌蛋白质合成。蛋白质合成除了受INS和IGF1通路的促进外，还受到MSTN的抑制[12]。本研究结果表明，饲喂频率对背最长肌MSTN mRNA表达量没有显著影响。前人研究指出，MSTN的活性受FST和DCN的调控，FST和DCN可抑制MSTN的mRNA表达[12]。本研究结果发现，饲喂频率对背最长肌FST和DCN的mRNA表达量没有显著影响。MSTN通过与其受体ACVR2B和ALK5结合，进而磷酸化母亲DPP同源物2或母亲DPP同源物3(SMAD2/3)，启动对骨骼肌蛋白质合成的抑制作用[12-23]。本研究发现，与饲喂12次相比，饲喂6次显著降低了背最长肌ACVR2B和ALK5的mRNA表达量，说明降低饲喂频率可能减少了MSTN和其受体的结合，进而削弱了MSTN对骨骼肌生长和蛋白质沉积的抑制作用。因此，降低饲喂频率可能通过上调IGF1-IGF1R-mTOR通路并减少MSTN与受体结合促进猪骨骼肌蛋白质合成。
4 结论① 与饲喂12次相比，饲喂6次可提高哺乳仔猪生长性能、胴体瘦肉率和骨骼肌重量。
② 降低饲喂频率可能通过上调IGF1通路和下调MSTN受体表达促进骨骼肌生长和机体蛋白质沉积。
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