2. 中国农业大学动物科学技术学院动物营养学国家重点实验室, 北京 100193
2. State Key Laboratory of Animal Nutrition, College of Animal Science and Technology, Chinese Agricultural University, Beijing 100193, China
在猪的体外模拟消化中，通常采用胰液素或微生物来源的酶试剂制备模拟小肠液[1-2]。由于试剂酶存在水溶性差、比活性低以及与被模拟对象不同源等问题，探讨猪源性小肠液消化酶的纯化方法非常关键。早期Furuya等[3]、张子仪等[4]采用胃蛋白酶-猪小肠液的体外消化方法模拟饲粮在猪体内的消化过程，获得的饲粮养分体外消化率与生物学法测定值具有良好的相关性，这表明在体外消化中猪小肠液来源的消化酶能较好地模拟猪小肠的消化能力。然而，在小肠液的标准化上还需要进一步规范。为了使模拟小肠液的反应试剂趋于标准化，获得高比活性的肠液消化酶纯化粉剂是基本前提。为此，胡光源[5]对比了硫酸铵沉淀法和直接冻干法制备猪空肠液消化酶粉剂的效果，结果表明硫酸铵沉淀法使消化酶活性的损失较大，且改变了酶的消化能力；而直接冻干法获得的消化酶虽可以较好地还原体内肠液的消化能力，但存在粉剂消化酶比活性和活性回收率低、粗灰分与粗脂肪含量高(粗灰分含量>20%，粗脂肪含量>10%)等问题。本研究组也曾采用超滤、透析等方法去除肠液中的盐分[6]，但效果并不理想。近期，本研究组在肠液消化酶纯化上建立了以冰乙醇沉淀酶蛋白的提取方法，最终经过冻干后获得消化酶粉剂[7]，此法获得的酶粉剂比活性与活性回收率均具有满意的结果。为了进一步明确该方法的适用性，本研究以2个生长阶段和2种饲粮类型下的猪空肠液为研究对象，测定冰乙醇沉淀-复溶和冻干2个处理过程中不同来源空肠液的淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶活性回收率的差异，从而探讨猪小肠液的来源在纯化过程中对消化酶活性回收率的影响，为猪肠液酶粉剂的制备提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验设计采用2×2完全随机设计，其中猪生长阶段设2个处理，即生长期(60~100日龄)和育肥期(101~140日龄)；饲粮类型设2个处理，即玉米-豆粕型饲粮(CSBM)和玉米-玉米干酒糟及其可溶物(DDGS)-米糠粕型饲粮(CDRM)。为了获得2个生长阶段和2种饲粮类型的4种猪空肠液，每个生长阶段采用2×2交叉设计，将8头猪随机分为2组，每组4头猪，在60~100日龄和101~140日龄各进行2期试验，交叉饲喂玉米-豆粕型饲粮和玉米-DDGS-米糠粕型饲粮，从而获得每个处理8个重复。
1.2 试验动物及饲粮选择体重为(25.8±1.4) kg的“大×长”二元杂交去势公猪8头，在代谢笼中单笼饲养。适应1周后在空肠前段(离幽门后170 cm)，即空肠靠近肠系膜、淋巴结末端的肠段上安装T型瘘管。术后饲养于代谢笼内，按常规程序护理2周[4, 8]，待瘘管猪恢复健康后开始试验。2种典型试验饲粮分别为玉米-豆粕型饲粮和玉米-DDGS-米糠粕型饲粮，营养水平以不低于NRC(2012)[9]生长猪营养需要量推荐值设定，其组成及营养水平见表 1。
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表 1 试验饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) |
每期试验分为10 d预试期和3 d空肠液收集期，预试期及空肠液收集期饲喂量为维持能量需要(418.6 kJ/kg BW0.75)的3倍剂量，每天08:00和16:00拌湿饲喂饲粮，期间自由饮水。空肠液收集期的第1天和第3天的09:00—10:00和17:00—18:00通过自封袋从空肠瘘管处连续收集空肠液样品。每期收集完成后将每头猪的空肠液样品按时间点分开混匀，并立即于4 ℃、1 250×g离心10 min，待离心结束后取上清液混合后储存于-20 ℃保存待用。待整个试验结束后，将每个处理内同一个重复多次采样制备的空肠液等体积比例混合分装，-20 ℃保存待用。
1.4 猪空肠液的纯化空肠液纯化的简要步骤为：取冷冻的生长猪空肠液于流水下迅速解冻并定量体积，高速离心后，取上清液用4倍肠液原始体积的无水冰乙醇(-20 ℃预冻10 h以上)沉淀酶蛋白。沉淀后的酶蛋白于4 ℃ 10 000 r/min离心15 min，弃上清液后用0.05 mol/L 0.5倍原肠液体积的磷酸盐缓冲液(pH=7.0)复溶后再高速离心，取上清液用LGJ-4原位冻干机冷冻干燥制成粉剂，于-20 ℃保存。
1.5 测定指标及方法原肠液及复溶后肠液中消化酶活性的测定方式：先将肠液样品于不高于5 ℃的冷水浴中解冻后充分混合，并以去离子水稀释至所需浓度。冻干后的纯化粉剂消化酶活性的测定方式：将纯化粉剂先溶解于去离子水后进行消化酶活性的测定。其中，淀粉酶活性(U/mL)的测定参考Dahlqvist[10]的方法；胰蛋白酶活性(U/mL)的测定参考Wirnt[11]的方法；糜蛋白酶活性(U/mL)的测定参考Wirnt[12]的方法。
原肠液或纯化粉剂中总蛋白含量采用Thermo总蛋白试剂盒(Pierce，Rockford，IL，美国)以二喹啉甲酸(BCA)法进行测定。
1.6 数据统计与分析采用SAS 9.2的MEANS模块计算基本统计量。对不同来源空肠液纯化过程中消化酶活性回收率的差异采用GLM模块进行双因素方差分析，并以Duncan氏法对各处理均值进行多重比较。
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式中：E1为原肠液中消化酶活性(U/mL)；E2为冰乙醇沉淀-复溶后肠液消化酶活性(U/mL)；E3为肠液纯化冻干粉剂消化酶比活性(U/mg)；m为冻干粉质量(mg)；V为原肠液体积(mL)。
2 结果与分析 2.1 猪空肠液的来源对冰乙醇沉淀-复溶后消化酶活性回收率的影响生长阶段和饲粮类型对猪空肠液经冰乙醇沉淀-复溶后消化酶活性回收率的影响见表 2。淀粉酶活性的回收率为76.69%~81.42%，胰蛋白酶活性的回收率为76.73%~82.37%，糜蛋白酶活性的回收率为73.95%~77.58%。双因素方差分析表明，不同生长阶段和饲粮类型来源的猪空肠液经冰乙醇沉淀-复溶后对消化酶活性的回收率无显著交互作用(P>0.05)。不同生长阶段和饲粮类型来源的猪空肠液经冰乙醇沉淀-复溶后在淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶活性的回收率上均无显著性差异(P>0.05)。
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表 2 空肠液经冰乙醇沉淀-复溶后消化酶活性回收率 Table 2 Recoveries of digestive enzyme activities after the jejunal fluid was deposited by ice ethanol then dissolved with phosphate buffer solution |
生长阶段和饲粮类型对猪空肠液经冰乙醇沉淀-复溶-冻干后消化酶活性回收率的影响见表 3。淀粉酶活性的回收率为69.76%~74.05%，胰蛋白酶活性的回收率为65.00%~73.11%，糜蛋白酶活性的回收率为66.87%~72.00%，整个纯化过程中总蛋白的回收率为31.73%~33.61%。双因素方差分析表明不同生长阶段和饲粮类型来源的猪空肠液经冰乙醇沉淀-复溶-冻干后对消化酶活性的回收率无显著交互作用(P>0.05)。不同生长阶段和饲粮类型来源的猪空肠液经冰乙醇沉淀-复溶-冻干后在淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶活性的回收率上均无显著性差异(P>0.05)。
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表 3 空肠液经冰乙醇沉淀-复溶-冻干后消化酶活性和总蛋白回收率 Table 3 Recoveries of digestive enzyme activities and total protein after the jejunal fluid was deposited by ice ethanol then dissolved with phosphate buffer solution finally freeze-dried |
在猪空肠液消化酶的纯化过程中，消化酶活性损失主要来源于冰乙醇沉淀-复溶和冻干这2个过程，由表 4可知冰乙醇沉淀-复溶过程中3种消化酶活性损失率在19.84%~25.07%，冻干过程中3种消化酶活性损失率在4.70%~9.53%。冰乙醇沉淀-复溶过程中消化酶活性的损失率极显著高于冻干过程(P < 0.01)。
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表 4 纯化过程中各主要步骤中消化酶活性损失率 Table 4 Digestive enzyme activity loss rates in each main step of purification process |
酶是一类具有催化活性的蛋白质，因此，从溶液中分离蛋白质的方法也可能适用于分离消化液中的酶蛋白。目前常用分离方法有盐析、有机溶剂沉淀和色谱柱层析等[13]。胡光源[5]、严峰[6]分别采用硫酸铵沉淀法和直接冻干法纯化猪、鸭小肠液中的消化酶存在重复性差、酶粉剂的比活性不高、灰分含量高等缺点。而通过有机溶剂(乙醇)低温沉淀酶蛋白可以较好地去除肠液中一层类似于油污的缩水性物质，获得较高的比活性[7]。然而，吴晓英等[14]、安正仑等[15]和郭兆斌等[16]通过有机溶剂(异丙醇或丙酮)沉淀胰腺组织匀浆中的胰酶时，存在消化酶活性回收率低(< 15%)的现象。上述试验结果表明，在纯化过程中，由于加入的有机试剂可能使酶蛋白变性，也可能因蛋白质沉淀需要使其在不利环境下暴露较长时间而部分失活，导致了酶的活性回收率或高或低。本研究中，通过添加冰乙醇降低水的介电常数，引起蛋白质分子表面脱水降低了蛋白质的溶解度，从而在低温条件下发生沉淀。然而，高浓度乙醇一方面促使了酶蛋白的沉淀，另一方面也增加了杂质的沉淀以及在沉淀过程中酶蛋白的失活[17-18]。Wang等[19]在用乙醇沉淀酵母麦芽糖酶时，活性损失达到50%左右。但本试验中采用冰乙醇沉淀复溶后3种主要消化酶的活性回收率均在73%以上，这表明本试验中采用冰乙醇沉淀保留了大部分的酶蛋白。2个生长阶段的试验猪饲喂2种不同纤维含量的饲粮后的小肠液经过乙醇沉淀处理3种主要消化酶的活性回收率无显著差异，这表明乙醇沉淀酶蛋白对不同来源的猪小肠液具有通用性。
在蛋白质纯化的干燥过程中，通常采用氮吹气流蒸发、低温旋转蒸发、喷雾干燥、冷冻干燥等方式[20]。由于氮吹仪或旋转蒸发只能去除大部分游离的水，如制备成粉剂还需要进一步干燥处理。喷雾干燥需要有载体及瞬时高温，这2个条件都可能对消化酶的回收率有影响[21]。冷冻干燥是在低温和负压的相对温和条件下进行，但在干燥过程中会使蛋白质的缩水基团外露，一方面导致其溶解性降低，另一方面也使部分蛋白质的构象发生了改变而出现活性损失[22]。本研究中乙醇沉淀后的冻干处理使3种主要消化酶活性的回收率进一步小幅降低，但整个纯化过程的总回收率在65%~74%，而蛋白质的回收率在31%~34%，这表明本纯化过程可以去除大部分不具有消化酶活性的杂质蛋白。2个生长阶段的试验猪饲喂2种类型的饲粮后的小肠液经过乙醇沉淀-复溶-冻干后3种主要消化酶的活性回收率均无显著差异，这表明乙醇沉淀-复溶-冻干处理对不同来源的猪小肠液具有通用性。在整个纯化过程中，乙醇沉淀-复溶过程对消化酶活性的损失率在19%~26%，而冻干过程的损失率在4%~10%。这是由于乙醇沉淀-复溶过程耗时比较长，并且离心及复溶过程中的搅拌所产生的切割力极容易改变蛋白构象，从而导致酶活性丧失的占比较大，而冻干过程一直处于低温保护状态，并且不易受到外源因素的干扰，只有在水分升华过程中会导致一少部分消化酶活性的损失。
4 结论本试验结果表明，不同生长阶段和饲粮类型下的猪空肠液在消化酶纯化过程中活性的回收率无显著性差异，采用冰乙醇沉淀冻干法纯化猪空肠液可以获得60%以上的消化酶活性回收率。
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