铜是动物机体内必需的微量元素之一，除参与机体的代谢过程、调节生长发育和免疫功能外，还通过构成机体内的含铜酶[如铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、铜蓝蛋白(CP)等]参与机体造血、自由基防御等活动[1]。不同的花粉中矿物元素的种类和含量均有所差异。通过检测花粉中12种矿物元素的含量，邓子龙等[2]得出花粉中镁、钙、铁、锌、铜和锰等元素含量较多。蜂王浆的组成成分为水分、蛋白质、脂类、碳水化合物、矿物质、维生素等[3]，其中矿物质中常量元素钠、硫、磷与微量元素铜、铁、铝、锰的含量比较稳定。有试验表明，不同日龄的工蜂浆和蜂王浆中矿物元素铜的含量在1.68~6.62 mg/kg[4]。蜂王主要以蜂王浆为食，蜂王浆也是蜜蜂幼虫的矿物质来源。哺育蜂为蜜蜂幼虫供给不同矿物质含量的王浆，帮助蜂群繁殖的健康运转[5]。铜是铜锌超氧化物歧化酶、铜蓝蛋白酶的重要组成部分，参与动物体内多种抗氧化功能[6]。有研究发现，意大利蜜蜂工蜂蛹中铜含量能达到中华蜜蜂工蜂蛹的2倍，所以推测铜含量低可能是中华蜜蜂抗螨的原因之一[7]。环境、行为、遗传及生理生化指标都能影响蜜蜂的抗螨机制，蜜蜂幼虫血淋巴营养物质含量也能影响抗螨机制。螨的生命活动所需的物质和能量都来源于其寄主幼虫的血淋巴，不同种类的蜜蜂感染螨的程度不同，因此推测寄主本身血淋巴组分的差异会影响螨的生命活动，但构成影响的关键元素和影响的规模还有待进一步研究。食物中适宜水平的铜在昆虫生长繁殖中扮演重要角色。研究发现，饲粮中添加低水平的铜能够提高棕尾别麻蝇的体重和生殖率，相反的是高水平的铜则对其体重与生殖率有抑制作用[8]。Bounias等[9]在蜜蜂人工饲粮中添加乳酸铜以及铜的有机盐——葡萄糖酸铜，发现二者都对蜂群的抗病能力有重要贡献，并通过试验比较了2种铜源对蜜蜂蜂螨防治的效果，结果发现葡萄糖酸铜效果更佳，但是铜的适宜添加水平及其对蜜蜂生理机能的影响还有待进一步研究证明。鉴于此，本试验通过在饲粮中添加葡萄糖酸铜来研究饲粮中铜水平对意大利蜜蜂工蜂幼虫生长发育、生理功能、抗氧化能力的影响，以此探明意大利蜜蜂工蜂幼虫饲粮中铜的适宜水平。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验动物采用取自健康、群势基本相同的蜂群的1日龄意大利蜜蜂工蜂幼虫。试验用铜源为葡萄糖酸铜(山东西亚化学有限公司产品)，纯度为98%。
1.2 饲粮配制以葡萄糖酸铜为铜源，在意大利蜜蜂工蜂幼虫人工饲粮中分别添加0(对照)、1.00、2.00、3.00、4.00和5.00 μg/g的铜，配制6种不同铜添加水平饲粮，实测饲粮铜水平分别为2.69、3.62、4.63、5.64、6.61和7.67 μg/g。6种饲粮组成及铜水平见表 1。
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表 1 6种人工饲粮组成及铜水平 Table 1 Composition and copper levels of 6 kinds of diets |
试验地点为山东农业大学南校区试验蜂场。选用1日龄意大利蜜蜂工蜂幼虫1 440只，随机分成组，每组10个重复，每个重复24只，在24孔细胞培养板中饲养。6组工蜂幼虫分别饲喂铜水平实测值为2.69、3.62、4.63、5.64、6.61和7.67 μg/g的饲粮。意大利蜜蜂工蜂幼虫在实验室内进行人工饲养，将1日龄工蜂幼虫放入每孔添150 μL饲粮的24孔板中，将培养板放入干燥器(相对湿度为95%，15%甘油溶液)，干燥器放入培养箱(35 ℃、相对湿度为90%)中饲养，每日更换饲粮。饲养至6日龄时转移至铺满无菌垫纸的24孔板上化蛹(停止饲喂)，9日龄时转移至新的铺满无菌垫纸的24孔板中，直至羽化出房。分别于特定日龄测定工蜂幼虫化蛹率、羽化率、体重、体长、抗氧化酶活性、抗氧化相关基因相对表达量以及血淋巴生化指标等。
1.4 测定指标及方法 1.4.1 工蜂幼虫化蛹率、羽化率的计算和体重、体长的测量在6日龄时统计化蛹幼虫数，21日龄时统计幼虫羽化出房数，分别计算化蛹率和羽化率。
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各组随机取出3板6日龄工蜂幼虫，用温水洗净幼虫体表，然后再吸水纸洗掉虫体表面的水分，在35 ℃的环境中放置3 min，保证体表水分彻底挥发，然后放在万分之一电子天平上称重，计算出6日龄工蜂幼虫的平均体重。称重完成后让幼虫尽量伸展到最大限度，用游标卡尺小心测定其体长。
1.4.2 血淋巴生化指标的测定在6日龄时，每个重复取3只工蜂幼虫，采用20 μL的毛细采血管取工蜂幼虫血淋巴于加有苯基硫脲的1.5 mL离心管中，于-80 ℃保存，待测血淋巴中总蛋白(TP)、总胆固醇(TCHO)的含量。
将冷冻保存的血淋巴解冻后，4 ℃条件下3 000 r/min离心10 min，取上清液，采用日立7020型全自动生化分析仪测定血淋巴中TP、TCHO的含量。
1.4.3 虫体抗氧化酶活性的测定在4、5、6日龄时，每个重复取2只工蜂幼虫放入10 mL离心管内，准确称量幼虫的质量后，按1 : 9的重量体积比加入生理盐水，匀浆后制成10%的组织匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清制成1%的组织匀浆，所有过程操作均在冰浴中进行。
取制备好的组织匀浆液，采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定虫体TP含量以及Cu/Zn-SOD、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和CP活性，操作过程参照试剂盒所附说明书。
1.4.4 虫体抗氧化相关基因相对表达量的测定在4、5、6日龄时，每个重复取2只工蜂幼虫，按照1.4.3的方法制备组织匀浆后，采用Trizol法提取总RNA含量，并使用反转录试剂盒(TaKaRa)进行反转录。遵循荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa)操作指南，用美国ABI-7500型实时荧光定量PCR仪检测目的基因的相对表达量。目的基因引物委托生工生物科技有限公司合成引物，设计参考序列来自于NCBI数据库，采用Primer 5.0进行引物设计，以β-肌动蛋白(β-actin)为内参基因，引物序列如表 2所示。
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表 2 PCR引物序列 Table 2 PCR primer sequences |
采用SAS 9.2软件对数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏法多重比较，P＜0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 饲粮中铜水平对工蜂幼虫生长发育及生理机能的影响 2.1.1 饲粮中铜水平对工蜂幼虫化蛹率、羽化率、体重和体长的影响由表 3可知，饲粮中铜水平对工蜂幼虫化蛹率和羽化率均有影响显著(P < 0.05)。与对照组相比，铜的添加使得工蜂幼虫化蛹率显著降低(P < 0.05)；羽化率在铜水平为3.62 μg/g时达到最高，与对照组差异不显著(P > 0.05)，但显著高于5.64、6.61和7.67 μg/g铜组(P < 0.05)。对饲粮中铜水平和工蜂幼虫羽化率进行曲线拟合(图 1)，得出工蜂幼虫饲粮中铜的适宜水平为4.96 μg/g。
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表 3 饲粮中铜水平对工蜂幼虫化蛹率和羽化率的影响 Table 3 Effects of dietary copper level on pupation rate and eclosion rate of worker bee larvae |
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图 1 饲粮中铜水平与工蜂幼虫羽化率的回归分析 Fig. 1 Regression analysis of dietary copper level and eclosion rate of worker bee larvae |
由表 4可知，饲粮中铜水平对6日龄工蜂幼虫体重无显著影响(P > 0.05)，但对6日龄工蜂幼虫体长有显著影响(P < 0.05)。从体长看，5.64 μg/g铜组显著高于对照组和其他铜添加组(P < 0.05)。
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表 4 饲粮中铜水平对6日龄工蜂幼虫体重和体长的影响 Table 4 Effects of dietary copper level on body weight and body length of 6-day-old worker bee larvae |
由表 5可知，饲粮中铜水平对血淋巴中TP、TCHO含量有显著影响(P < 0.05)。随着饲粮中铜水平的升高，6日龄工蜂幼虫血淋巴中TP、TCHO含量均持续下降。其中，血淋巴中TP含量除4.63 μg/g铜组分别与3.62和5.64 μg/g铜组差异不显著(P > 0.05)外，其他各组间差异显著(P < 0.05)；5.64、6.61和7.67 μg/g铜组血淋巴中TCHO含量显著低于对照组(P < 0.05)。
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表 5 饲粮中铜水平对6日龄工蜂幼虫血淋巴生化指标的影响 Table 5 Effects of dietary copper level on biochemical indices in hemolymph of 6-day-old worker bee larvae |
由表 6可知，饲粮中铜水平对4、5和6日龄工蜂幼虫Cu/Zn-SOD活性有显著影响(P < 0.05)。对于4日龄工蜂幼虫，4.63、5.64、6.61 μg/g铜组Cu/Zn-SOD活性显著高于其他组(P < 0.05)；对于5日龄工蜂幼虫，在铜水平为7.67 μg/g时Cu/Zn-SOD活性达到最低，显著低于除5.64 μg/g铜组外的其他各组(P < 0.05)；对于6日龄工蜂幼虫，随着饲粮中铜水平的升高，Cu/Zn-SOD活性呈现先升高后下降的趋势，且在铜水平为3.62 μg/g时达到最高，显著高于其他各组(P < 0.05)。
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表 6 饲粮中铜水平对不同龄期工蜂幼虫铜锌超氧化物歧化酶活性的影响 Table 6 Effects of dietary copper level on Cu/Zn-SOD activity of worker bee larvae at different instars |
由表 7可知，饲粮中铜水平对5、6日龄工蜂幼虫GSH-Px活性有显著影响(P < 0.05)。随着饲粮中铜水平的升高，6日龄工蜂幼虫GSH-Px活性呈现先升高后降低的趋势，且在铜水平为3.62 μg/g时达到最高，显著高于其他各组(P < 0.05)。对饲粮中铜水平和6日龄工蜂幼虫GSH-Px活性进行曲线拟合(图 2)，得出工蜂幼虫饲粮中铜的适宜水平为5.34 μg/g。
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表 7 饲粮中铜水平对不同龄期工蜂幼虫谷胱甘肽过氧化物酶活性的影响 Table 7 Effects of dietary copper level on GSH-Px activity of worker bee larvae at different instars |
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图 2 饲粮中铜水平与6日龄工蜂幼虫谷胱甘肽过氧化物酶活性的回归分析 Fig. 2 Regression analysis of dietary copper level and GSH-Px activity of 6-day-old worker bee larvae |
由表 8可知，随着饲粮中铜水平的升高，4、5、6日龄蜜蜂幼虫CP活性均呈现先升高后下降趋势。饲粮中铜水平对4日龄工蜂幼虫CP活性无显著影响(P > 0.05)，但对5、6日龄工蜂幼虫CP活性有显著影响(P < 0.05)。6.61 μg/g铜组5日龄CP活性显著高于对照组和7.67 μg/g铜组(P < 0.05)，同时其6日龄工蜂幼虫CP活性显著高于对照组和除5.64 μg/g铜组外的其他铜添加组(P < 0.05)。
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表 8 饲粮中铜水平对不同龄期工蜂幼虫铜蓝蛋白活性的影响 Table 8 Effects of dietary copper level on CP activity of worker bee larvae at different instars |
由表 9可知，饲粮中铜水平对4、5、6日龄工蜂幼虫Cu/Zn-SOD基因的相对表达量有显著影响(P < 0.05)。对于4日龄工蜂幼虫，3.62 μg/g铜组Cu/Zn-SOD基因的相对表达量显著高于对照组和6.61、7.67 μg/g铜组(P < 0.05)；对于5日龄工蜂幼虫，5.64、6.61、7.67 μg/g铜组Cu/Zn-SOD基因的相对表达量显著高于对照组和2.69、3.62 μg/g铜组(P < 0.05)；对于6日龄工蜂幼虫，3.62 μg/g铜组Cu/Zn-SOD基因的相对表达量与对照组差异不显著(P > 0.05)，但显著高于其他铜添加组(P < 0.05)。
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表 9 饲粮中铜水平对不同龄期工蜂幼虫铜锌超氧化物歧化酶基因相对表达量的影响 Table 9 Effects of dietary copper level on Cu/Zn-SOD gene relative expression level of worker bee larvae at different instars |
由表 10可知，饲粮中铜水平对4日龄工蜂幼虫CAT基因的相对表达量无显著影响(P > 0.05)，但对5和6日龄工蜂幼虫CAT基因的相对表达量有显著影响(P < 0.05)。随着饲粮中铜水平的升高，5日龄工蜂幼虫CAT基因的相对表达量呈现先升高后下降的趋势(P < 0.05)，3.62 μg/g铜组CAT基因相对表达量显著高于对照组和6.61、7.67 μg/g铜组(P < 0.05)；6.61、7.67 μg/g铜组6日龄工蜂幼虫CAT基因的相对表达量显著低于对照组和3.62 μg/g铜组(P < 0.05)。
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表 10 饲粮中铜水平对不同龄期工蜂幼虫过氧化氢酶基因相对表达量的影响 Table 10 Effects of dietary copper level on CAT gene relative expression level of worker bee larvae at different instars |
蜜蜂幼虫取食含有葡萄糖酸铜的饲粮后，铜在蜜蜂幼虫体内不断沉积，随着时间的推移，体内铜的沉积量不断增加。有研究表明，昆虫取食含添加铜的饲粮后，铜在昆虫体内的沉积量随着饲粮中铜添加水平的升高而增加[10]。这是由于随着饲粮中铜水平的升高，昆虫体内出现低浓度刺激、高浓度抑制反应[11]，相应的有关生长发育指标受损。本试验结果中工蜂幼虫Cu/Zn-SOD基因的相对表达量随着饲粮中铜水平的升高反而降低，这可能是由于在分子水平方面，一定的浓度范围内，低浓度的Cu2+有利于嘧啶碱基的形成和稳定，而高浓度的Cu2+导致DNA损伤，使得昆虫机体功能发生障碍，生长发育受损[12]。饲粮中铜水平对工蜂幼虫体长有显著影响，且铜的添加使得工蜂幼虫化蛹率降低。然而，随着饲粮中铜水平的升高，工蜂幼虫羽化率出现先升高后降低趋势，并在铜水平为3.62 μg/g时最高，说明适宜水平的铜能使羽化率升高。羽化率反映了蜜蜂幼虫从蛹阶段过渡到成蜂阶段的成功率，羽化率的提高表明适宜水平的铜对于蜜蜂的发育有促进作用，这可能是因为细胞内的Cu2+对激活Ras蛋白/促分裂原活化蛋白激酶途径起重要作用，参与生物体内细胞的新陈代谢过程[13-15]。鉴于此，过量Cu2+可能通过此途径导致蜜蜂细胞发生凋亡。此外，可能由于过量铜的加入对工蜂幼虫来讲属于一种外界刺激，外界刺激的应激使得体重下降，体长减小，化蛹率降低。
3.2 饲粮中铜水平影响工蜂幼虫的血淋巴生化指标由于高浓度Cu2+的作用下，昆虫血淋巴中某些化合物的含量降低，如总脂、TP等，此外，由这些化合物所决定的相关能量物质的含量也随之急速下降[16-17]。本试验中，添加高水平的铜会使工蜂幼虫血淋巴中TP和TCHO的含量降低，这可能是由于铜可以促进动物体内脂质代谢，降低脂肪沉积。Sk r ˇ ivan等[18]研究证实，在肉鸡饲粮中添加铜可以减少肌肉中脂质和胆固醇的含量。胆固醇是脂类的一种，蜕皮激素的合成需要胆固醇，蜜蜂幼虫阶段的生长发育需要蜕皮激素的参与。在本研究中，饲粮中铜的添加对工蜂幼虫血淋巴中血淋巴中含量有显著影响，随着饲粮中铜水平的升高，6日龄工蜂幼虫血淋巴中TP、TCHO含量均持续下降，与前面所提到的化蛹率降低、体重下降、体长减小相对应。
3.3 饲粮中铜水平影响工蜂幼虫的抗氧化能力铜参与机体的抗氧化功能，在影响含铜氧化酶的活性方面扮演重要角色。铜是CP活性中心和Cu/Zn-SOD的重要组成部分，参与动物体内多种抗氧化反应。Cu/Zn-SOD抗氧化功能强大，可以催化机体代谢的有毒物质转化为氧气和过氧化氢。Cu2+有催化剂的作用，参与膜的脂质过氧化，有助于活性氧的形成，Cu2+借助激活GSH-Px酶促防御系统，促进昆虫体内发生脂质过氧化[13]。饲粮中铜水平在2.69~7.67 μg/g时，6日龄工蜂幼虫的Cu/Zn-SOD、GSH-Px、CP活性出现先升高后降低的趋势，最终结果是高水平的铜抑制蜜蜂幼虫的代谢反应，这可能是高水平的铜减弱工蜂幼虫清除氧自由基能力，也可能与酶分子中的其他金属离子(如铁等)发生竞争性替代作用，造成了抗氧化酶活性的降低。CP是用于血红蛋白合成的一种铁氧化酶，Fe2+经过CP的氧化作用变成Fe3+[19]，可能铁与铜发生竞争性抑制，从而降低了CP的活性。值得一提的是，随着饲粮中铜水平的升高，工蜂幼虫Cu/Zn-SOD的基因相对表达量与其活性表现出一致的变化趋势。柴春彦等[20]研究表明，缺铜降低了乳牛血液的抗氧化能力，进而导致过氧化氢的进一步堆积，毒害了机体功能。
4 结论饲粮中铜水平影响意大利蜜蜂工蜂幼虫的生长发育、生理机能以及抗氧化能力。分别对饲粮中铜水平与意大利蜜蜂工蜂幼虫的羽化率和6日龄GSH-Px活性进行曲线拟合，得到意大利蜜蜂工蜂幼虫饲粮中铜的适宜水平为4.96~5.34 μg/g。
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