胎儿胚胎发育时期的营养对其后续身体状况有重要的影响，胚胎发育时期营养摄取不足可能会在以后诱发各种疾病[1-2]。怀孕期间的营养不良会导致胎儿的低初生重(LBW)，并且会导致后代成年后肥胖[3-4]。研究发现，胎儿生长情况受遗传因素的调节较少，主要取决于胎儿从母体获取营养的情况[5]，而动物机体的肥胖与脂代谢密切相关。目前，有关成年期动物脂代谢的研究较多，而对动物早期脂代谢的研究比较少。
肝脏是能量代谢的中枢器官，在脂肪生成、糖异生和脂质分解代谢中起重要作用[6]。事实上，能量和脂质代谢之间的平衡在维持肝脏功能方面很重要[7]。脂质代谢与整体健康密切相关，它为整个生物体提供能量生成基质[8]。研究发现，LBW仔猪比正常初生重(NBW)仔猪肝脏发育显著降低[9]；LBW会改变仔猪肝脏miRNA的表达，从而导致肝脏代谢(如脂代谢、蛋白质代谢)出现紊乱[10]。
梅山猪是一种中国本土猪品种，以其高繁殖能力、高抗病性和良好的肉质而闻名[11]。然而梅山猪的平均初生重普遍较低，出生后的生长速度较慢。因此，梅山猪肉在市场上并不普及。有关初生重影响“杜×长×大”三元杂交猪或者其他品种猪脂代谢方面的研究已有很多，而对梅山新生仔猪的研究较少。本试验以梅山猪为模型，通过分析肝脏细胞、脂代谢产物以及脂代谢相关基因在肝脏中的表达，旨在阐明初生重对新生梅山仔猪脂代谢的影响。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验所用梅山猪由昆山市梅山猪种猪保种有限公司提供。
1.2 试验设计选取胎次、预产期和产仔数(13~15头)相近的梅山母猪6头，分娩后分别从每窝中挑选1对NBW[(0.85±0.06) kg]和LBW[(0.65±0.02) kg]仔猪，共计6对。12头新生仔猪出生后不喂食母乳，出生6 h内在颈部肌肉注射戊巴比妥钠(50 mg/kg BW)麻醉，然后颈动脉放血致死。
1.3 检测指标 1.3.1 器官指数试验仔猪采血后屠宰取肝脏，吸水纸吸干表面多余血液，立即称重，记录，计算肝脏器官指数。器官指数(g/kg)=器官湿重(g)/猪活体重(kg)。
1.3.2 血浆脂代谢指标试验仔猪心脏采血3 mL于抗凝管中，离心分离血浆，测定血浆甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL)含量。
1.3.3 肝脏脂代谢指标从-80 ℃中取出肝脏样品，称取约260 mg，按1 : 9(质量体积比)比例加入生理盐水制成匀浆，随后混匀离心(3 000 r/min，10 min)，收集上清液，用二喹啉甲酸(BCA)法测定肝脏总蛋白(TP)，再用试剂盒测定肝脏TC(No. A111-1)、TG(No. A110-1)、高密度脂蛋白(HDL)(No. A112)、LDL (No. A113)含量及脂蛋白脂酶(LPL)(No. A067)、肝脂酶(HL)(No. A067)活性。试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，严格按照试剂盒说明书操作规程执行。
1.3.4 肝脏组织结构参考文献[12]的方法，制成肝脏组织苏木精-伊红(HE)染色切片，并通过显微镜(Olympus CKX41，日本)拍摄染色部分的代表性图像，使用Image-Pro Plus 6.0软件测量肝细胞的大小。
1.3.5 肝脏脂代谢相关基因表达从-80 ℃取出肝脏样品，使用TRIZOL提取样品总RNA，测定纯度(ABZ 7500)，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA质量。将合格的RNA反转录为cDNA，存放于-80 ℃中待测，具体根据TaKaRa试剂盒说明书(RR047A, TaKaRa)进行。通过NCBI PubMed得到所需引物，引物序列见表 1。特异性引物由金维智生物科技有限公司合成。以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因作为内参基因，对目的基因进行相对定量分析，使用2-△△Ct方法计算目的基因的相对表达水平。反转录和荧光定量试剂盒均购于TaKaRa生物技术有限公司，操作步骤严格按照说明书执行。
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表 1 实时荧光定量PCR引物序列 Table 1 Primer sequences of real time PCR |
试验数据由Excel 2013软件先进行处理，再采用SPSS 19.0软件对数据进行独立样本t检验，P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著。
2 结果与分析 2.1 初生重对新生梅山仔猪肝脏发育的影响由表 2可知，与NBW组相比，LBW组新生梅山仔猪的体重显著降低(P<0.05)，肝脏重呈下降趋势(P=0.084)。
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表 2 初生重对新生梅山仔猪肝脏发育的影响 Table 2 Effects of birth weight on development of liver of Meishan newborn piglets |
由表 3可知，LBW组新生梅山仔猪的肝脏切片横截细胞的面积和粒径均极显著低于NBW组(P < 0.01)。由图 1可知，LBW组新生梅山仔猪的肝脏组织结构与NBW组并无明显差异。
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表 3 初生重对新生梅山仔猪肝脏细胞的影响 Table 3 Effects of birth weight on liver cell of Meishan newborn piglets |
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图 1 不同初生重新生梅山仔猪的肝脏HE染色结果 Fig. 1 Results of liver HE staining of different birth weight Meishan newborn piglets (20×) |
由表 4可知，与NBW组相比，LBW组新生梅山仔猪的血浆TC含量极显著升高(P < 0.01)，血浆LDL含量显著升高(P < 0.05)，血浆TG含量极显著降低(P < 0.01)。
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表 4 初生重对新生梅山仔猪血浆脂代谢指标的影响 Table 4 Effects of birth weight on plasma lipid metabolism indexes of Meishan newborn piglets |
由表 5可知，与NBW组相比，LBW组新生梅山仔猪的肝脏TC含量显著降低(P < 0.05)，肝脏TG含量和LPL活性极显著降低(P < 0.01)，肝脏HL活性呈下降趋势(P=0.086)。
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表 5 初生重对新生梅山仔猪肝脏脂代谢指标的影响 Table 5 Effects of birth weight on liver lipid metabolism indexes of Meishan newborn piglets |
由表 6可知，LBW组新生梅山仔猪的肝脏脂肪酸合成酶(FAS)和LPL的基因表达量极显著低于NBW组(P < 0.01)，肝脏激素敏感脂肪酶(HSL)的基因表达量显著低于NBW组(P < 0.05)。
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表 6 初生重对新生梅山仔猪肝脏脂代谢相关基因表达量的影响 Table 6 Effects of birth weight on liver lipid metabolism related gene expression levels of Meishan newborn piglets |
肝脏是机体内重要的器官，以营养代谢为主，可以合成和释放各种脂蛋白和脂质代谢酶[13-14]。器官指数是器官发育的一个生物学指标，器官大小在一定程度上反映了功能的程度[15]。在正常情况下，器官重量和器官指数可以反映内脏器官的状况，根据脏器的重量以及器官指数可以了解内脏器官病变的性质和程度[16]。本试验结果发现，LBW组新生梅山仔猪的肝脏重与NBW组相比下降了25.82%。结合相关研究，发现子宫内发育迟缓(IUGR)新生仔猪就是指新生仔猪的初生重低于正常值，与本文LBW新生梅山仔猪相似，具有参考性。研究发现，IUGR新生仔猪的肝脏发育相对NBW新生仔猪较迟缓[17]，并且其肝脏器官结构受损，从而会造成体内代谢紊乱的发生。本试验中，对比2组HE染色切片并未发现LBW组和NBW组在肝脏组织结构上有显著差异，但LBW组新生梅山仔猪肝脏横截细胞的面积和粒径都极显著低于NBW组，这提示LBW组新生梅山仔猪的肝脏发育相对NBW组较迟缓。LBW组的新生梅山仔猪肝脏发育程度低，初步判断是由于新生梅山仔猪的体重低于正常体重，导致仔猪肝脏发育迟缓，从而推测其营养代谢功能(脂代谢)可能低于NBW组新生梅山仔猪。本试验中，LBW组仔猪肝脏发育不良，但其脂代谢功能是否受到影响需要进一步通过其他指标来反映。
肝脏是研究机体脂代谢的适宜器官，通过脂代谢产物含量以及肝脏脂代谢相关基因表达的变化可以了解机体的脂代谢情况，动物机体中肝脏负责脂质的分泌和沉积[18-19]。此外，脂代谢影响动物的生长、发育和繁殖。TC是一种能够合成多种类固醇的脂，机体内TC含量能够反映动物对脂质的代谢和吸收状况[20]。HDL和LDL含量与机体健康密切相关，并且是导致机体患心血管疾病的重要因素[21]。当机体内LDL含量升高时，心血管疾病的发生率增加；而HDL有抗动脉粥样硬化的作用。TG来源于脂肪分解或糖转化得到，并且为机体提供能量，TG含量可反映机体的脂代谢情况，当其含量下降时，代表机体内脂代谢功能增强，但只有适宜的TG含量才有利于机体健康[22]。本试验结果发现，与NBW组相比，LBW组新生梅山仔猪的血浆TC含量极显著升高，血浆LDL含量显著升高，血浆TG含量极显著降低。研究发现，IUGR仔猪血清TC和LDL含量显著高于NBW组，同时TG含量显著低于NBW组[23]。研究也发现，IUGR仔猪血液TG含量低于NBW组[24]，这与本试验结果相似。LPL的功能是在非常低密度的脂蛋白中水解在血液中循环的TG中的脂肪酸。因此，该酶可以为组织提供用于合成TG的脂肪酸，其在脂肪沉积中起重要作用[25]。LPL和HL作为调节脂质代谢的关键酶，其活性降低可导致脂质的清除率降低、TG含量升高和代谢紊乱。本试验发现，与NBW组相比，LBW组新生梅山仔猪的肝脏TC含量显著降低，肝脏TG含量和LPL活性极显著降低，肝脏HL活性呈下降趋势。NBW组新生梅山仔猪的肝脏LPL和HL活性升高时，肝脏TG含量降低，从侧面印证了LBW可能会影响新生梅山仔猪肝脏和血液中脂质的转运，脂代谢功能相对于NBW组有一定的削弱。
机体中的脂肪分解和生成与体内各种酶和转录因子有着密切关系[18]。研究报道，FAS可促进脂肪酸的合成，脂肪酸可被酯化为TG，可能导致动物体内脂肪沉积，FAS基因表达与体内脂肪合成和脂质含量密切相关[26-27]。熊文中等[28]研究发现，FAS基因表达与猪胴体和体脂以及脂肪组织中胴体脂肪的百分比有关。HSL基因在许多器官中表达，它是影响体脂代谢的关键酶和限速酶[29-30]。此外，HSL对动物脂肪沉积和瘦肉率有重要影响[31]。研究发现，LPL缺乏可导致动物脂质代谢严重紊乱[32]，LPL基因突变可显著影响猪皮下脂肪的沉积[33]。祝仁铸等[34]研究发现，LPL基因表达量会随着猪体重的增加而增加。本试验结果发现，LBW组新生梅山仔猪的肝脏FAS、LPL和HSL的基因表达量均显著低于NBW组。当猪FAS的基因表达量升高时其体内的TG含量也会上升[28]，这与本试验结果相吻合。以上结果表明，LBW对新生仔猪肝脏脂代谢相关基因的表达有一定的抑制作用，并且可能对新生仔猪的整个脂代谢功能有所影响，初步推测可能与LBW仔猪生理状况(如营养状况)有关。由于动物机体内环境情况复杂，影响仔猪肝脏脂代谢的因素众多，初生重只是影响仔猪肝脏发育和脂代谢的众多关键因素之一，具体机制作用仍需要进一步研究。
4 结论与NBW组相比，LBW组新生梅山仔猪的肝脏发育迟缓，血浆TC含量极显著升高、LDL含量显著升高、TG含量极显著降低，肝脏TC含量显著降低、TG含量和LPL活性极显著降低，肝脏FAS和LPL的基因表达量极显著降低、HSL的基因表达量显著降低。以上结果提示，LBW在一定程度上会抑制新生梅山仔猪的肝脏发育以及肝脏脂代谢。
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