肠道微生物在幼龄动物消化吸收功能建立、免疫系统形态和功能发育、信号传导等生理过程中发挥着极为重要的作用[1-2]。它的建立是一个极为复杂的过程,同时受到内部因素和外部因素的影响,如基因、环境、饲粮、免疫压力和疾病等[3-4]。一方面,宿主的遗传背景是塑造动物肠道菌群结构的重要内部因素之一[5-9]。例如,与普通没有亲缘关系的个体相比,双胞胎的肠道菌群结构更为相似[6-7],并且同卵双胞胎肠道菌群的相似度高于异卵双胞胎[9];瘦肉型外种猪和肉脂型地方猪的结肠内容物菌群的形成受到宿主基因的影响,菌群结构及代谢产物表现出明显的差异[10-11]。另一方面,肠道微生物的组成与饲粮结构、环境等外部因素也有着密切关系[12-14]。最新研究报道,肠道菌群没有显著的家族遗传倾向,宿主的遗传背景对菌群结构的影响甚微[15],饮食、生活方式等相关因素是影响肠道微生物群落演替的极为重要的外部因素[16]。
猪是一种重要的经济动物,也是研究人类生理功能和疾病的理想模型。近年来,其肠道菌群形成规律和功能发育得到了广泛研究,研究对象以长白、杜洛克、约克夏等外种猪为主,而对我国地方猪种的研究较少。合川黑猪、盆周山地猪和荣昌猪是我国西南地区特有的优质地方猪种,具有繁殖力高、耐粗饲、抗逆抗病性强及肉质优良等特点,蕴含着巨大的研究价值和商业价值,研究其肠道菌群结构特点及影响因素,有利于更全面地揭示地方猪在宿主遗传、繁殖和免疫等方面的特点。因此,本试验基于细菌16S rRNA的高通量测序技术,分别对哺乳期和断奶早期的合川黑猪、盆周山地猪和荣昌猪的结肠菌群结构进行分析,研究断奶以及不同猪种对肠道菌群的影响,为中国地方猪基础生物学数据积累资料,为仔猪肠道微生态调控技术的研发提供参考。
1 材料与方法 1.1 监测点基本情况荣昌猪的监测点位于重庆市荣昌区荣牧科技有限公司,哺乳仔猪采食母乳和商品开口料,断奶仔猪采食商品仔猪料;合川黑猪的监测点位于重庆市合川区绿丰源黑猪养殖专业合作社,哺乳仔猪采食母乳和少量自配母猪料,断奶仔猪采食自配仔猪料;盆周山地猪的监测点位于重庆市涪陵区重庆市盆周山地猪遗传资源保种场,哺乳仔猪采食母乳和少量自配母猪料,断奶仔猪采食自配仔猪料。
1.2 样品采集及指标测定每个品种各选取21~25日龄(35日龄断奶)、体重均匀的哺乳仔猪5头和30~40日龄、体重均匀的断奶仔猪5头,静脉放血处死后,打开腹腔,无菌采集结肠食糜样品,放入液氮中,运回实验室后放入-80 ℃冰箱中保存,用于16S rRNA高通量测序分析。
1.3 16S rRNA高通量测序及生物信息学分析提取结肠食糜样品总DNA(MoBio PowerFecalⓇDNA提取试剂盒,美国),利用1%琼脂糖凝胶电泳对抽提的基因组DNA进行检测。在引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)末端加上测序接头,对V3~V4基因片段进行PCR扩增,并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库,建好的文库进行文库质检,质检合格的文库用Illumina HiSeq 2500进行测序。
将测序得到的原始序列进行双端拼接、质控过滤,得到优化序列,使用QIIME(version 1.8.0)软件中的UCLUST对优化序列在97%的相似水平下进行操作分类单位(OTU)聚类,并基于Silva分类学数据库对OTU进行物种注释和分类学分析。基于OTU分析结果,进行样品多样性及差异性分析。通过alpha多样性分析研究单个样品内部的物种多样性,统计各样品在97%相似度水平下的Chao1、Shannon和Coverage指数,绘制样品稀释曲线;通过beta多样性分析来比较不同样品在群落组成及结构上存在的差异大小,根据距离矩阵获得相应距离下的样品层次聚类树[非加权组平均法(UPGMA)]、样品主坐标分析(PCoA)图;通过组间差异显著性分析在不同组间寻找具有统计学差异的生物标记(biomarker)。
1.4 数据统计与分析试验数据以平均值±标准差表示,采用SPSS 19.0软件中的一般线性模型对样品alpha多样性指数和仔猪结肠菌群丰度进行单变量双因素方差分析,以P<0.05作为差异显著性判断标准。
2 结果与分析 2.1 alpha多样性分析30个样品测序共获得2 394 066对reads,双端reads拼接、过滤后共产生1 997 571条高质量测序标签(clean tags),平均为66 586条,共产生797个细菌OTU。图 1为样品稀释曲线,显示序列数在20 000时,曲线逐渐趋于平缓,表示样本中的物种不会随测序数量的增加而显著增多,样品序列充分。
表 1中数据为3种地方猪哺乳仔猪和断奶仔猪结肠内容物样品的OTU数和alpha多样性指数。单变量双因素方差分析结果显示,不同品种哺乳仔猪和断奶仔猪结肠样品的OTU数、菌群丰度(Chao1指数)和多样性(Shannon指数)差异不显著(P>0.05)。所有样品的Coverage指数均达到0.999±0.000,表明测序结果可以代表样本中微生物的真实情况。
3个猪种断奶前后的结肠菌群结构组成不同。由图 2-A可知,在门水平上,合川黑猪和盆周山地哺乳仔猪结肠内容物菌群95%以上主要由厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、梭杆菌门(Fusobacteria)和变形菌门(Proteobacteria)组成,荣昌猪哺乳仔猪95%以上属于Firmicutes、Bacteroidetes和螺旋菌门(Spirochaetae);合川黑猪和荣昌断奶仔猪结肠内容物细菌95%以上属于Firmicutes和Bacteroidetes,盆周山地猪断奶仔猪95%以上由Firmicutes、Bacteroidetes和Spirochaetae组成。
由图 2-B可知,仔猪断奶前后结肠菌群组成在属水平上明显不同,不同猪品种间也存在一定差异。在哺乳仔猪中,合川黑猪结肠菌群相对丰度最高的3个属为拟杆菌属(Bacteroides)、梭杆菌属(Fusobacterium)和拟普雷沃菌属(Alloprevotella),盆周山地猪为Bacteroides、乳杆菌属(Lactobacillus)和Alloprevotella,荣昌猪为Bacteroides、Eubacterium coprostanoligenes和普氏菌属(Prevotella);在断奶仔猪中,合川黑猪主要由Subdoligranulum、Bacteroides和Prevotella组成;盆周山地猪中Prevotella变为优势菌,其次为Bacteroides和梭菌属(Clostridium);荣昌猪主要由Prevotella、Subdoligranulum和Eubacterium coprostanoligenes组成。
2.3 beta多样性分析采用PCoA法研究地方猪结肠菌群整体结构的差异性。由图 3-A可知,哺乳仔猪和断奶仔猪之间具有明显的区分,组内样品聚类程度较高,主成分1(PC1)是对这2个阶段猪结肠菌群多样性影响最大的因子,贡献率为24.02%,主成分2(PC2)的贡献率为15.86%;而合川黑猪、盆周山地猪和荣昌猪3个地方品种间的样品距离差异较小,没有形成明显的组内聚类。
基于UPGMA的聚类分析图(图 3-B),能够得到相似的结果,可以看出除了样品PBJ1、PBJ5和RBJ1外,哺乳仔猪与断奶仔猪处于2个分支上,分支距离较远,样品间的差异主要来于断奶。在哺乳仔猪和断奶仔猪各自的分支上,能够进一步看出相同品种间的样品分支距离更短,表明动物品种不同对肠道菌群组成也有一定影响。
2.4 地方猪结肠内容物菌群结构差异性分析根据上述分析结果,试验采用断奶前后和不同猪种2种方式对样品进行分组,分别进行组间比较分析(LEfSe分析),绘制进化分支图[线性判别分析(LDA) score>3.5],同时对结肠菌群的相对丰度进行秩和检验,用于发现不同组间具有统计学差异的标志物种。
以断奶前后样品进行分组,结果显示(图 4-A),哺乳仔猪结肠内容物中Fusobacteria、梭杆菌纲(Fusobacteriia)、梭杆菌目(Fusobacteriales)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、Fusobacterium、Proteobacteria、δ变形菌纲(Deltaproteobacteria)、脱硫弧菌目(Desulfovibrionales)、脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、ε变形菌纲(Epsilonproteobacteria)、弯曲菌目(Campylobacterales)、螺杆菌科(Helicobacteraceae)、螺杆菌属(Helicobacter)、Alloprevotella、克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)、克里斯滕森菌属(Christensenella)、Family_ⅩⅢ、Tyzzerella和厌氧弧菌属(Anaerovibrio)的相对丰度显著高于断奶仔猪(P<0.05);断奶仔猪中,梭菌纲(Clostridia)、梭菌目(Clostridiales)、梭菌科(Clostridiaceae)、Clostridium、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、Subdoligranulum、巨单胞菌属(Megamonas)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)和Prevotella的相对丰度显著高于哺乳仔猪(P<0.05)。
仅根据不同动物品种进行分组,LEfSe分析结果显示(图 4-B),合川黑猪结肠内容物中消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)和Terrisporobacter显著高于其他2个猪种(P<0.05);盆周山地猪结肠内容物中芽孢杆菌纲(Bacilli)、乳杆菌目(Lactobacillales)、γ变形菌纲(Gammaproteobacteria)、气单胞菌目(Aeromonadales)、Succinivibrionaceae和琥珀酸弧菌属(Succinivibrio)的相对丰度显著高于其他2个猪种(P<0.05);荣昌猪结肠内容物中毛螺菌属(Lachnospira)、Ruminococcus和假丁酸弧菌属(Pseudobutyrivibrio)显著高于其他2个猪种(P<0.05)。
对主要菌门和菌属进一步开展双因素方差分析,结果显示,在门水平上(表 2),Fusobacteria、Proteobacteria和疣微菌门(Verrucomicrobia)的相对丰度在哺乳仔猪和断奶仔猪中存在显著差异(P<0.05),而品种对菌群分布没有显著影响(P>0.05)。
在属水平上(表 3),鉴定出12个主要细菌属的相对丰度在哺乳仔猪和断奶仔猪间存在显著(P<0.05)或极显著差异(P<0.01),其中Fusobacterium、Desulfovibrio、红螺菌属(Rhodospirillum)和Bradymonadales在哺乳仔猪中的相对丰度显著高于断奶仔猪(P<0.05);Prevotella、真细菌属(Eubacterium)、Intestinibacter、Leeia、支原体属(Mycoplasma)、Olsenella、溶杆菌属(Solobacterium)在哺乳仔猪中的相对丰度显著低于断奶仔猪(P<0.05)。Eubacterium、Rhodospirillum、Ruminococcus和Succinivibrio的相对丰度在不同品种间存在显著差异(P<0.05)。
本试验采用16S rRNA高通量测序技术测定了我国西南型地方猪种合川黑猪、盆周山地猪和荣昌猪在哺乳期和断奶早期的结肠菌群结构组成,比较分析了不同猪种断奶前后结肠内容物中的菌群差异性。通过PCoA和UPGMA的聚类分析发现,哺乳仔猪和断奶仔猪结肠菌群之间具有显著不同的聚类,而各猪种间的样品聚类程度不高,表明断奶后,饲粮结构的变化等因素对仔猪肠道菌群结构产生了较为明显的影响,而品种对肠道菌群的影响相对较小。
对断奶仔猪和哺乳仔猪的结肠菌群结构分析发现,Firmicutes和Bacteroidetes为3个地方猪断奶前后共有的相对丰度最高的门类。这与前人的研究结果一致,在猪的肠道基因集中,Firmicutes和Bacteroidetes占据主导地位[17]。Fusobacteria、Proteobacteria和Verrucomicrobia在3个品种哺乳仔猪中的相对丰度显著高于断奶仔猪,软壁菌门(Tenericutes)在断奶仔猪中的相对丰度高于哺乳仔猪,互养菌门(Synergistetes)在断奶仔猪中的相对丰度低于哺乳仔猪,但差异未达到显著水平。Bian等[3]研究表明,Fusobacteria和Proteobacteria是哺乳仔猪肠道菌群中的主要门类,且随着日龄的增长会逐渐减少甚至消失。Niu等[18]研究表明,猪肠道菌群中Tenericutes的比例随着日龄的增长而增长,Synergistetes则呈降低趋势。在属水平上,Bacteroides是3个品种哺乳仔猪肠道中共有的优势菌属,在断奶仔猪中其相对丰度有所下降,Fusobacterium属于Fusobacteria、Desulfovibrio属于Proteobacteria,二者在哺乳仔猪中的相对丰度显著高于断奶仔猪。与之相反,Prevotella在哺乳仔猪中的相对丰度较低,在断奶仔猪中成为优势菌属之一,Ruminococcus等在断奶仔猪中的相对丰度显著高于哺乳仔猪。Frese等[14]研究表明,仔猪断奶后Bacteroides比例降低,乳杆菌科(Lactobacillaceae)、Ruminococcaceae、韦荣氏菌科(Veillonellaceae)和普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)比例升高,其中Prevotellaceae在断奶前所占比例为0.3%,断奶后为14.8%,升高至将近50倍。这主要是由于母乳在新生幼龄动物的肠道菌群塑造中起到重要作用,尤其是母乳中的多糖对哺乳仔猪肠道菌群起到控制作用,形成以母乳为导向的微生物区系[14, 19];断奶后,饲粮结构主要由植物和动物原料组成,饲粮中的植物多糖能够选择性地富集一些特定功能的微生物,如Prevotellaceae、Ruminococcus[14, 20]。Koropatkin等[21]在婴儿上的研究也得到相同的结论。
对不同品种仔猪结肠菌群结构分析发现,3个品种仔猪的结肠菌群组成差异较小。与本研究结果不同,诸多研究表明,猪肠道微生物群落多样性与品种有密切相关,动物宿主遗传背景与肠道微生物存在复杂的互作关系[22-24]。Yan等[11]对长白猪和梅花猪仔猪结肠菌群结构进行比较研究,发现8个细菌属、16个细菌物种在2种仔猪中的相对丰度存在显著差异。杨柳等[23]采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)指纹图谱技术比较分析了荣昌、长白、杜洛克猪肠道中的菌群组成,结果显示不同品种猪肠道菌群种、属相似性较高,但分布和数量存在较大的差异。Xiao等[24]研究了杜洛克、约克夏、长白和汉普夏4个品种的公猪粪便的菌群结构,结果表明长白猪和约克夏猪的粪便菌群组成具有较高的相似度,但与汉普夏、杜洛克的粪便菌群差异较大。然而近期在宿主、环境、肠道菌群互作的相关研究结果表明,在宿主与肠道菌群协同进化的过程中,饮食等环境因素对宿主肠道菌群的塑造起到主要作用,遗传因素的贡献相对较小[25]。Bian等[3]研究表明,日龄、断奶、固体饲料的引入对新生仔猪肠道菌群结构的影响比动物品种和哺乳母猪的影响作用更大。
4 结论哺乳仔猪和断奶仔猪的结肠菌群结构组成差异明显,Fusobacteria、Proteobacteria和Verrucomicrobia在哺乳仔猪中的相对丰度显著高于断奶仔猪,Bacteroides是3个品种哺乳仔猪结肠中共有的优势菌属,在断奶仔猪中相对丰度显著下降;Prevotella在哺乳仔猪结肠中的丰度较低,在断奶仔猪中成为优势菌属之一。3个品种之间的结肠菌群结构组成差异较小,表明断奶对仔猪结肠菌群结构的影响较不同品种更为明显。
[1] |
MATAMOROS S, GRAS-LEGUEN C, LE VACON F, et al. Development of intestinal microbiota in infants and its impact on health[J]. Trends in Microbiology, 2013, 21(4): 167-173. DOI:10.1016/j.tim.2012.12.001 |
[2] |
SOMMER F, BÄCKHED F. The gut microbiota-masters of host development and physiology[J]. Nature Reviews Microbiology, 2013, 11(4): 227-238. DOI:10.1038/nrmicro2974 |
[3] |
BIAN G R, MA S Q, ZHU Z G, et al. Age, introduction of solid feed and weaning are more important determinants of gut bacterial succession in piglets than breed and nursing mother as revealed by a reciprocal cross-fostering model[J]. Environmental Microbiology, 2016, 18(5): 1566-1577. DOI:10.1111/1462-2920.13272 |
[4] |
LEAMY L J, KELLY S A, NIETFELDT J, et al. Host genetics and diet, but not immunoglobulin A expression, converge to shape compositional features of the gut microbiome in an advanced intercross population of mice[J]. Genome Biology, 2014, 15: 552. DOI:10.1186/s13059-014-0552-6 |
[5] |
FRAUNE S, BOSCH T C G. Long-term maintenance of species-specific bacterial microbiota in the basal metazoan Hydra[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2007, 104(32): 13146-13151. DOI:10.1073/pnas.0703375104 |
[6] |
TIMS S, DEROM C, JONKERS D M, et al. Microbiota conservation and BMI signatures in adult monozygotic twins[J]. The ISME Journal, 2013, 7(4): 707-717. DOI:10.1038/ismej.2012.146 |
[7] |
YATSUNENKO T, REY F E, MANARY M J, et al. Human gut microbiome viewed across age and geography[J]. Nature, 2012, 486(7402): 222-227. DOI:10.1038/nature11053 |
[8] |
GOODRICH J K, DAVENPORT E R, WATERS J L, et al. Cross-species comparisons of host genetic associations with the microbiome[J]. Science, 2016, 352(6285): 532-535. DOI:10.1126/science.aad9379 |
[9] |
GOODRICH J K, WATERS J L, POOLE A C, et al. Human genetics shape the gut microbiome[J]. Cell, 2014, 159(4): 789-799. DOI:10.1016/j.cell.2014.09.053 |
[10] |
JIANG G L, LIU Y Y, OSO A O, et al. The differences of bacteria and bacteria metabolites in the colon between fatty and lean pigs[J]. Journal of Animal Science, 2016, 94: 349-353. |
[11] |
YAN S J, ZHU C, YU T, et al. Studying the differences of bacterial metabolome and microbiome in the colon between Landrace and Meihua piglets[J]. Frontiers in Microbiology, 2017, 8: 1812. DOI:10.3389/fmicb.2017.01812 |
[12] |
COTILLARD A, KENNEDY S P, KONG L C, et al. Dietary intervention impact on gut microbial gene richness[J]. Nature, 2013, 500(7464): 585-588. DOI:10.1038/nature12480 |
[13] |
YE H M, LIU J H, FENG P F, et al. Grain-rich diets altered the colonic fermentation and mucosa-associated bacterial communities and induced mucosal injuries in goats[J]. Scientific Reports, 2016, 6: 20329. DOI:10.1038/srep20329 |
[14] |
FRESE S A, PARKER K, CALVERT C C, et al. Diet shapes the gut microbiome of pigs during nursing and weaning[J]. Microbiome, 2015, 3: 28. DOI:10.1186/s40168-015-0091-8 |
[15] |
ROTHSCHILD D, WEISSBROD O, BARKAN E, et al. Environment dominates over host genetics in shaping human gut microbiota[J]. Nature, 2018, 555(7695): 210-215. DOI:10.1038/nature25973 |
[16] |
KOENIG J E, SPOR A, SCALFONE N, et al. Succession of microbial consortia in the developing infant gut microbiome[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, 108(Suppl.1): 4578-4585. |
[17] |
XIAO L, ESTELLÉ J, KIILERICH P, et al. A reference gene catalogue of the pig gut microbiome[J]. Nature Microbiology, 2016, 1(12): 16161. DOI:10.1038/nmicrobiol.2016.161 |
[18] |
NIU Q, LI P H, HAO S S, et al. Dynamic distribution of the gut microbiota and the relationship with apparent crude fiber digestibility and growth stages in pigs[J]. Scientific Reports, 2015, 5: 9938. DOI:10.1038/srep09938 |
[19] |
PACHECO A R, BARILE D, UNDERWOOD M A, et al. The impact of the milk glycobiome on the neonate gut microbiota[J]. Annual Review of Animal Biosciences, 2015, 3(1): 419-445. DOI:10.1146/annurev-animal-022114-111112 |
[20] |
IVARSSON E, ROOS S, LIU H Y, et al. Fermentable non-starch polysaccharides increases the abundance of Bacteroides-Prevotella-Porphyromonas in ileal microbial community of growing pigs[J]. Animal, 2014, 8(11): 1777-1787. DOI:10.1017/S1751731114001827 |
[21] |
KOROPATKIN N M, CAMERON E A, MARTENS E C. How glycan metabolism shapes the human gut microbiota[J]. Nature Reviews Microbiology, 2012, 10(5): 323-335. DOI:10.1038/nrmicro2746 |
[22] |
孟和. 动物宿主遗传背景与肠道微生物关系研究进展[J]. 中国家禽, 2017, 39(22): 1-4. |
[23] |
杨柳, 张邑帆, 郑华, 等. 荣昌、长白、杜洛克猪肠道微生物ERIC-PCR-DGGE指纹图谱比较分析[J]. 家畜生态学报, 2011, 32(5): 21-25. DOI:10.3969/j.issn.1673-1182.2011.05.005 |
[24] |
XIAO Y P, LI K F, XIANG Y, et al. The fecal microbiota composition of boar Duroc, Yorkshire, Landrace and Hampshire pigs[J]. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences, 2017, 30(10): 1456-1463. DOI:10.5713/ajas.16.0746 |
[25] |
REIMER R A. Establishing the role of diet in the microbiota-disease axis[J]. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology, 2018, 16(2): 86-87. |