畜牧业的发展在提高人们生活质量的同时也带来了严重的环境污染。由于畜禽对饲料氮的利用率较低,动物生产中粪氮、尿氮的大量排放造成的环境污染尤其严重。相对于单胃动物,反刍动物对饲料中氮的利用率更低[1]。要治理动物生产造成的氮污染,最理想的途径就是提高动物对饲料氮的利用率,从源头上减少粪氮、尿氮的排放量。Harrison等[2]和Calsamiglia等[3]研究表明,在不同的试验条件下,反刍动物的饲料氮利用率变异范围很大,这说明其还有很大的提高空间。虽然前人做了很多努力,但截至目前,反刍动物对饲粮氮的利用率整体并没有显著提高[4-5],这说明人们并没有全面认识和掌握影响反刍动物氮代谢的关键因素。因此,本试验通过对比氮利用率不同的山羊瘤胃细菌结构与组成的差异性,研究了瘤胃细菌与反刍动物氮利用率的关系,以期促进人们对影响反刍动物氮利用率因素的进一步认识,为以后通过调控瘤胃微生物来提高动物氮利用率奠定理论基础。
1 材料与方法 1.1 试验动物与饲粮试验动物为30只10月龄左右、平均体重为(24.47±0.38) kg的雌性努比亚黑山羊。试验期间所有羊只单笼饲养,自由饮水,饲粮参照我国《肉羊饲养标准》(NY/T 816—2004)(体重25 kg,日增重0.10 kg)进行配制,饲粮组成及营养水平见表 1。每日饲喂前将精料和粗料按比例称量,并混合均匀。每日07:30、13:30和18:30分别饲喂1次,每日饲喂量以山羊活体重的4%供给[6]。每天对每只羊的饲喂量、食入量和剩料量进行详细记录。
试验由30 d预试期和6 d代谢试验期组成。代谢试验的第1天晨饲前,对所有试验羊进行称重,代谢试验期间收集每只羊排泄的全部粪尿,试验结束后将6 d粪尿样品均匀混合。代谢试验结束后的次日晨饲前对羊只进行颈静脉采血,抗凝处理后制备血浆,-20 ℃保存备用。随后将山羊迅速屠宰,分离出瘤胃,测定瘤胃内容物pH后,迅速用无菌容器采集每只山羊适量的瘤胃内容物,一部分于-80 ℃保存,用于测定细菌结构与组成;另一部分经4层纱布过滤,将滤液置于无菌的离心管中,放入液氮中暂时保存,取样结束后将其转移到-80 ℃冰箱中保存,用于瘤胃发酵指标的测定。根据采食量,饲粮、粪便和尿液样品中的氮含量计算每只山羊对饲料的氮利用率[7],计算公式如下:
然后统计30只山羊对饲料氮利用率的平均值和标准差,参照Ramos等[8]的方法,将氮利用率大于平均值+0.5倍标准差的山羊个体作为高氮利用率组(HNU组),氮利用率小于平均值-0.5倍标准差的个体作为低氮利用率组(LNU组),并对HNU组和LNU组的样品进行分析检测。
1.3 样品分析采用Roche Cobas-8000c702型自动生化分析仪测定血浆样品总蛋白(PT)、白蛋白(ALB)、尿素(UR)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量及谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)活性。
粪便样品中干物质(DM)、粗灰分(Ash)、粗蛋白质(CP)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、钙(Ca)、磷(P)和粗脂肪(EE)含量的测定参照张丽英[9]的方法进行。尿液中CP含量的测定参照粪便样品的测定方法。
瘤胃液中氨态氮(NH3-N)、微生物蛋白质(MCP)和挥发性脂肪酸(VFAs)含量的测定:从-80 ℃冰箱中取出50 mL瘤胃液滤液样品,在冰上进行解冻,然后4 ℃离心(12 000×g)10 min,取上清液。采用碱性次氯酸钠-苯酚比色法测定NH3-N含量[10],采用考马斯亮蓝法测定MCP含量[11],采用气相色谱仪(Varian CP-3 800,美国)测定VFAs(乙酸、丙酸和丁酸)含量[12]。
1.4 细菌16S rDNA高通量测序瘤胃内容物样品放置于冰上解冻后,用无菌的磷酸缓冲盐溶液(PBS)反复冲洗内容物于纱布上,通过漏斗将冲洗液引入新的无菌离心管中,将得到的冲洗液4 ℃离心(10 000×g)10 min,收集沉淀,用TIANamp Bacteria DNA Ki[天根生化科技(北京)有限公司]提取瘤胃微生物总DNA,具体步骤参照试剂盒说明书进行。用带有barcode的细菌通用引物515F和806R[13],以获得的DNA为模板,对细菌16S rRNA的V4高变区进行PCR扩增,扩增得到的产物用Illumina’s HiSeq 300PE平台进行高通量测序。
针对高通量测序所获得的片段,经纯化、质控,筛选掉那些低质量的序列,比如平均碱基质量值小于Q25、未知碱基数大于6、长度小于200 bp和大于500 bp的序列,然后调用Usearch V7.0去除嵌合体[14];得到高质量的片段后,在序列相似度大于97%的基础上,用Uclust方法和Furthest聚类算法聚类为操作分类单元(operational taxonomic units,OTU),然后在每个OTU的序列中选取相对丰度最高的序列作为该OTU的代表序列;将代表序列与SILVA(http://www.arb-silva.de/)的SSUrRNA数据库中的参考序列进行比对[15-16],最终生成OTU物种注释表和各分类水平的物种相对丰度表。在上述数据分析的同时,使用QIIME V1.8.0软件计算alpha多样性指数;用QIIME V 1.8.0软件计算样品间的Unifrac距离,并利用R软件绘制样品间的主坐标分析(PCoA)图。
1.5 瘤胃中蛋白质分解菌的实时荧光定量(real-time)PCR分析用real-time PCR(Bio-Rad CFX96)对瘤胃内容物样品中产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)、溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)、栖瘤胃普雷沃氏菌(Prevotella ruminicola)、溶糊精琥珀酸弧菌(Succinivibrio dextrinosolvens)、黄色瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)、牛链球菌(Streptococcus bovis)和瘤胃球菌属_sp._HUN007(Ruminococcus_sp._HUN007)7个与蛋白质降解相关的细菌进行定量分析。PCR的反应体系为25.0 μL(表 2)。参照Stubner[17]的方法,用含有目的片段的质粒作为标准质粒,绘制标准曲线。Real-time PCR引物见表 3。
PCR扩增程序:98 ℃预变性30 s,1个循环;95 ℃变性5 s,58 ℃退火5 s,72 ℃延伸5 s,40个循环;1 step熔解曲线信号采集。荧光数据采集在延伸结束时进行。
1.6 数据统计与分析数据用SPSS 19.0中两样本非参数检验进行组间差异显著性检验。P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。用SPSS 19.0中的Spearman等级相关(Spearman rank correlation)对山羊的氮利用率与组间有显著差异微生物的相对丰度进行相关性分析,P<0.05表示两者存在显著相关关系。
2 结果与分析 2.1 氮利用率30只试验羊对饲料的氮利用率平均值为(45.62±9.89)%,变异范围为20.71%~67.47%,变异系数(CV)为26.81%。用“试验设计”中所描述的分组方法,从群体中共挑选出HNU组山羊8只,LNU组山羊7只,由表 4可知,2组饲料氮利用率分别为(56.68±5.54)%和(34.25±4.21)%,经显著性检验,组间差异极显著(P < 0.01)。
由表 5可知,HNU组和LNU组之间饲粮DM、Ash、OM、EE、ADF和NDF的表观消化率差异均不显著(P>0.05)。HNU组饲粮CP的表观消化率显著高于LNU组(P < 0.05)。
由表 6可知,HNU组的血浆HDL-C含量显著高于LNU组(P < 0.05);HNU组和LNU组之间血浆TP、ALB、UR、TC、TG、LDL-C含量及GPT、GOT活性差异均不显著(P>0.05)。
由表 7可知,HNU组的瘤胃液pH显著高于LNU组(P<0.05),HNU组的瘤胃液MCP含量极显著高于LNU组(P<0.01),HNU组的瘤胃液NH3-N含量极显著低于LNU组(P<0.01),HNU组的瘤胃液丙酸含量显著低于LNU组(P<0.05);HNU组的瘤胃液乙酸、丁酸含量和乙酸/丙酸均低于LNU组,但差异不显著(P>0.05)。
本次测序,从15个瘤胃样品中共检测到1 180 198条高质量的序列,平均每个样品(78 679.87±5 548.27)条;经>97%相似性聚类后,共得到25 356个OTU,所有样本共享的OTU有700个(图 1)。
随机抽取一定测序量的数据,并对这些序列聚类得到的OTUs数目进行统计,然后以2组山羊抽取的序列数与对应的物种数构建稀释曲线。从图 2的稀释曲线可以看出,每条稀释曲线均趋于平缓,最终达到了平台期,说明本研究所采集的瘤胃内容物样本均能够覆盖绝大多数的菌群种类。
观察到的物种指数(observed species index)、Shannon指数、Simpson指数、Chao1指数、ACE指数、覆盖率、PD whole tree指数等alpha多样性指数的计算结果见表 8。虽然HNU组的观察到的物种指数、Chao1指数、ACE指数、PD whole tree指数有低于LNU组的趋势,但2组之间各α多样性指数差异均不显著(P>0.05)。
根据样品间的非加权遗传距离(Unweighted unifrac-distance),用主坐标分析对样品的相似性进行分析,结果如图 3所示。图中2点间距离值越小代表样品间微生物群落的相似度就越高,距离值越大则代表相似度就越低。从图中可以看出,HNU组样品聚集度高,而LNU组样品则较为分散。
从图 4各组的ANOSIM统计分析图可以看出,R=0.147>0,说明组间差异大于组内;P=0.015 < 0.05,说明组间有显著差异。
本次测序,从15个瘤胃样品中共检测到了23个菌门。拟杆菌门和厚壁菌门占整个瘤胃微生物的90%左右,其中拟杆菌门(HNU组平均值为61.37%,LNU组平均值为59.91%)的相对丰度最高,厚壁菌门位居第二(HNU组平均值为32.11%,LNU组平均值为30.75%)(图 5)。在属水平上共注释到了239个菌属,相对丰度最高的属为普雷沃菌属1(Prevotella 1)(HNU组12.02%,LNU组17.63%),其次为理研菌科RC9肠道群(Rikenellaceae RC9_gut_group)(HNU组11.71%,LNU组10.16%),约38%的序列为未知序列,未能得到注释。LNU组中Prevotella 1和解琥珀酸菌属(Succiniclasticum)的相对丰度显著高于HNU组(P<0.05),而瘤胃球菌属1(Ruminococcus 1)、毛螺菌科XPB_1014肠道群(Lachnospiraceae XPB_1014_group)、瘤胃球菌科UCG_004(Ruminococcaceae UCG_004)和瘤胃杆菌属(Ruminobacter)的相对丰度则显著低于HNU组(P<0.05);另外,还有一些相对丰度比较低的微生物在组间也存在显著差异(P<0.05),具体见表 9。对这些组间有显著差异的微生物,用其相对丰度与山羊的氮利用率做相关性分析,结果发现,有3个纲:梭菌纲(Clostridia)、甲烷微菌纲(Methanomicrobia)、未鉴定拟杆菌门(unidentified Firmicutes);2个目:梭菌目(Clostridiales)、甲烷八叠球菌目(Methanosarcinales);3个科:拟杆菌科S24-7(Bacteroidales S24-7_group)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、酸杆菌科(Acidaminococcaceae);7个属:Ruminococcus 1、Ruminobacter、Ruminococcaceae UCG_004、厌氧支原体属(Anaeroplasma)、Succiniclasticum、Possible genus_Sk018、Lachnospiraceae XPB_1014_group)与宿主氮利用率存在显著相关关系(P<0.05)。
对15个样品间的核心共享菌属进行分析,并将相对丰度位于前35位的共享属用热图进行展示(图 6)。图中,Prevotella 1、Rikenellaceae RC9_gut_group属于拟杆菌门,琥珀酸弧菌科UCG_002 (Succinivibrionaceae UCG_002)属于变形菌门,其他的共享属均来源于厚壁菌门。由热图上的颜色可以看出,Prevotella 1是瘤胃中相对丰度最高的共享菌。
根据以往的报道,本试验挑选了7种与蛋白质降解相关的瘤胃细菌进行real-time PCR分析。结果如表 10所示,HNU组中Butyrivibrio fibrisolvens数量极显著高于LNU组(P<0.01),Fibrobacter succinogenes和Ruminococcus_sp._HUN007数量显著高于LNU组(P<0.05);而Prevotella ruminicola、Succinivibrio dextrinosolvens、Ruminococcus flavefaciens和Streptococcus bovis数量在2组间没有显著差异(P>0.05)。
对于反刍动物来说,瘤胃发酵指标是机体消化代谢正常与否的直接反映。高效的瘤胃发酵有利于MCP的合成,为宿主增加瘤胃后消化道可吸收蛋白质的比例,最终影响饲粮中氮的利用率[21]。瘤胃内NH3-N是饲粮中蛋白质和非蛋白氮分解的终产物,同时又是瘤胃微生物合成MCP的原料。瘤胃NH3-N含量过高,超过了微生物对其的利用能力时,就会经瘤胃壁吸收进入肝脏合成尿素,并随尿液排出,由此而造成氮的浪费。瘤胃内NH3-N的含量主要受饲粮中含氮物降解产氨速度和瘤胃微生物摄取氨合成MCP速度的影响。本试验中,HNU组和LNU组的饲粮氮含量和氮的降解特性完全一样,但HNU组NH3-N含量却极显著低于LNU组,这说明HNU组微生物降解饲粮中氮产生氨的速度可能显著低于LNU组,或者是微生物利用氨氮合成MCP的速度显著高于LNU组,总之降低瘤胃NH3-N含量会降低饲料氮的浪费。这也许正是HNU组饲粮氮利用率显著高于LNU组的一个重要原因。另外本试验在饲粮一致且没有添加任何添加剂的情况下,发现氮利用率不同的山羊其瘤胃pH及丙酸及NH3-N和MCP含量在组间存在显著差异,这可能与组间氮利用率存在差异有很大关系。瘤胃中pH相对比较稳定,过高或过低都将影响瘤胃微生物的正常生长,从而影响瘤胃的发酵。一般情况下,瘤胃pH的正常范围为6.0~7.0,本试验中,LNU组pH的平均值为6.13±0.22,HNU组pH的平均值为6.41±0.24,所有山羊的瘤胃pH均保持在正常范围之内。但是,HNU组的pH却显著高于LNU组,这很可能是由于HNU组中丙酸含量低于LNU组引起的,原因很可能跟瘤胃中某种瘤胃微生物有关,如Ruminococcus_sp._HUN007、Fibrobacter succinogenes等。
血液成分与各种营养素的营养状况密切相关,且血液样本容易得到,通过测定和分析血液中相关生理生化指标,可以快速检验动物的营养状况并做出评价。血液尿素氮(UN)含量被用来估测反刍动物饲料蛋白质生物学价值,它的含量反映着反刍动物消耗氮的程度,即其含量可反映动物蛋白质代谢状况,并可作为蛋白质沉积的一个指标。UN是肝脏尿素生成量、内源UN周转量和尿中排出量相平衡的动态结果,与蛋白质采食量、瘤胃NH3-N含量关系密切。如果瘤胃NH3-N含量低于其适宜的范围,则血液UR库中的UN就被运到瘤胃转化为NH3-N,以使瘤胃NH3-N含量保持相对稳定[22]。本试验中,UR含量在HNU组和LNU组之间无显著差异,而瘤胃NH3-N和MCP的含量在2组间差异极显著,出现这种差异的原因可能是瘤胃内蛋白质利用菌群的差异造成的。
本次试验所用的30只山羊年龄、性别、遗传背景和饲养管理都一致,但它们对饲粮中氮的利用效率却在20.71%~67.47%之间高度变异。以往在生产和科研活动中,人们也许曾经注意到了这种现象,但本文是第1篇有关反刍动物饲料氮利用率个体差异的正式研究报道。在本文之前,虽然还未见反刍动物氮利用效率个体差异的报道,但以往的研究表明,反刍动物饲料利用效率的个体差异性是普遍存在的现象[23-24]。氮利用率是饲料利用率的一个重要组成部分,因此反刍动物氮利用率的个体差异性也许也是一种普遍存在的现象。以往的研究表明,影响动物对氮利用率的主要因素包括品种、饲粮、年龄等[25-26],本文首次研究了瘤胃微生物的结构与组成对宿主氮利用率的影响。
饲粮中的含氮物被动物采食以后,首先在瘤胃中被微生物分解并转化为MCP,然后MCP与饲粮中的未降解蛋白质一起进入小肠再被宿主消化吸收[27],有研究表明,进入宿主小肠的蛋白质70%左右为MCP,因此瘤胃微生物在反刍动物饲粮蛋白质的消化过程中发挥着重要作用[28]。本研究发现,瘤胃内与宿主氮利用率显著相关的微生物不仅数量众多,而且有些微生物的相对丰度也较高,如Prevotella 1(LNU组17.63%,HNU组12.02%)。本研究中Prevotella 1是所有样品的瘤胃共享属,也是相对丰度最高的属,这与以往的研究结果一致[29-30]。HNU组Prevotella 1的相对丰度显著低于LNU组。Prevotella 1下包含有许多细菌种,其中研究较为透彻的有布氏普雷沃氏菌、短普雷沃氏菌和Prevotella ruminicola,他们作用的底物包括半纤维素、果胶、淀粉和蛋白质等[31],但各自的侧重点不同。短普雷沃氏菌的发酵底物主要为葡萄糖、乳糖和纤维二糖等[32];淀粉、木聚糖等营养物质均能够被布氏普雷沃氏菌和Prevotella ruminicola所利用[33];只有Prevotella ruminicola被认为具有分解蛋白质的功能,但是本研究通过real-time PCR分析发现,Prevotella ruminicola的相对丰度在组间未见显著差异。因此,本试验中造成Prevotella 1组间显著差异的原因尚不清楚,仍需进一步研究。
本研究结果表明,瘤胃中在属水平上,Ruminococcus 1和Ruminococcaceae_UCG_004的相对丰度,在种水平上Ruminococcus_sp._HUN007的相对丰度,HNU组都显著高于LNU组。Ruminococcus flavefaciens(也属于Ruminococcaceae)在组间的差异虽然不显著,但在数值上,HNU组仍大于LNU组。以往许多研究表明,Ruminococcaceae的很多微生物都是典型的纤维降解菌,而大部分的纤维降解菌都具有一定的蛋白质降解能力[34]。因此,提高这些微生物在瘤胃中的丰度能促进宿主对氮的消化和利用。具有降解蛋白质功能的纤维分解菌还有Fibrobacter succinogenes、Butyrivibrio fibrisolvens等[35]。本研究对它们也进行了定量分析,结果显示它们在HNU组的相对丰度也都高于LNU组。但并不是所有与纤维降解有关的微生物都能促进宿主对氮的利用。如Succiniclasticum,它能将瘤胃内纤维分解产生的琥珀酸降解为丙酸从而促进Fibrobacter succinogenes对纤维的分解,然而本研究发现LNU组的Succiniclasticum相对丰度显著高于HNU组。出现这种结果说明LNU组可能产生了更多的琥珀酸,也说明促进纤维降解并不一定能促进宿主对氮的利用。瘤胃中的Succinivibrio dextrinosolvens、Streptococcus bovis等也被认为与蛋白质的降解有关[18-19],但本研究并未检测到它们在HNU组和LNU组间的差异,结合本课题组以往的研究结果,普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)_UCG_001和Prevotellaceae_UCG_003的相对丰度随饲粮NDF水平增加而升高的变化规律,说明这2种菌具有纤维降解能力[36],而以往体外培养的试验表明,它们具有消化蛋白质和氨基酸的活性,没有直接降解纤维的能力,但与纤维降解菌共培养时却能间接地促进纤维的降解[37]。我们推测,细菌在体外分离培养的试验结果与实际瘤胃环境中发挥的作用可能不一致,这可能就是导致没有检测到它们在HNU组和LNU组间的差异的原因。
4 结论山羊对饲料中氮的利用效率存在明显的个体差异,这种差异与瘤胃微生物结构与组成的差异有关。瘤胃中存在多种与宿主氮利用率显著相关的微生物,宿主氮利用率越高,瘤胃中的Fibrobacter_succinogenes、Butyrivibrio_fibrisolvens、Ruminococcus_sp._HUN007等菌数量越多。
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