饲用抗生素具有提高畜禽存活率、促进生长和提高饲料转化率等功能,但长期使用抗生素会引发药物残留、环境污染和食品安全等问题。欧盟已于2006年全面禁止使用饲用抗生素,我国也正在采取措施逐步加快限制饲料中添加预防性抗生素,2017年至今已先后停止硫酸黏菌素、喹乙醇、氨苯胂酸、洛克沙胂作为药物添加剂在畜禽动物中的使用。2019年3月13日,农业部发布《药物饲料添加剂退出计划(征求意见稿)》,计划2020年底退出除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂品种。如何在“禁抗”的大背景下保障动物健康、维持正常生长性能已成为畜牧养殖业关注的热点,寻求安全、绿色、有效的抗生素替代品迫在眉睫。
多糖作为一种具有增强免疫功能的绿色保健生物制品,在一定程度上可以替代抗生素。目前黄芪多糖(APS)、灵芝多糖等已广泛应用于畜牧和水产养殖业[1],但其生产周期长、提取工艺相对复杂且成本较高;而微生物多糖较于其他多糖具有生产周期短、成本相对较低且不易受外界条件限制等优势。硒具有抗氧化、促生长和提高机体免疫力等功能,是动物机体所必需的一种微量元素。不同来源及状态的硒在生物活性和效价上存在差异,与无机硒相比,有机硒具有更高的生物活性和更低的毒性[2],通过微生物进行硒的有机化可有效提高硒的活性和利用率。本课题组前期筛选得到新型高产多糖耐硒菌株阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)Z0206,不仅可以分泌大量的胞外多糖(EPS),而且可以将无机的亚硒酸钠(Na2SeO3)高效转化为有机的富硒胞外多糖(Se-EPS)[3]。在克氏原螯虾[4]、肉仔鸡[5]上应用研究表明,Se-EPS能显著提高其生长性能、抗氧化能力和免疫功能,而Se-EPS在断奶仔猪上的应用尚未见报道。因此,本研究选择断奶仔猪为试验对象,以生猪养殖中常用的Na2SeO3、APS作为参考,旨在研究Enterobacter cloacae Z0206所产EPS和Se-EPS对断奶仔猪生长性能、抗氧化功能、肠道形态结构及抗菌肽表达的影响,同时探究Se-EPS是否具有多糖和硒的协同作用。
1 材料与方法 1.1 试验材料Na2SeO3、EPS、Se-EPS由浙江大学饲料研究所实验室制备[3],EPS和Se-EPS中多糖实测含量均为69.40%,Se-EPS中硒含量为535.7 mg/kg;APS由北京生泰尔科技股份有限公司提供,多糖实测含量为69.75%。试验仔猪由宁波振宁牧业有限公司养猪场提供,饲粮由浙江科盛饲料股份有限公司加工,基础饲粮组成及营养水平见表 1。血清抗氧化指标检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
试验选择28日龄“杜×长×大”三元杂交断奶仔猪150头,按照品种、胎次、体重相近原则,将仔猪随机分成5组,每组3个重复,每个重复10头猪。对照(CON)组饲喂基础饲粮,Na2SeO3组饲喂基础饲粮+0.30 mg/kg Na2SeO3,Na2SeO3+APS组饲喂基础饲粮+0.30 mg/kg Na2SeO3+560 mg/kg APS,Na2SeO3+EPS组饲喂基础饲粮+0.30 mg/kg Na2SeO3+560 mg/kg EPS,Se-EPS组饲喂基础饲粮+560 mg/kg Se-EPS。试验期39 d,试验期间仔猪自由采食和饮水,试验结束后每组随机选取6头仔猪屠宰取样,用于后续试验分析。
1.3 生长性能测定记录试验开始和结束时的仔猪体重并记录采食量,计算平均日采食量、平均日增重、料重比以及腹泻率。
1.4 血清抗氧化指标空腹12 h后采集仔猪静脉血液,于4 ℃、3 000×g离心15 min,收集上清于-80 ℃保存,用于测定血清总抗氧化力(T-AOC)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量。
1.5 肠道苏木精-伊红(HE)染色取1 cm左右的完整十二指肠和空肠,用生理盐水轻轻冲洗肠内容物,于Bouins液中固定,然后进行HE染色并观察比较肠黏膜形态结构变化,记录绒毛高度、隐窝深度并计算绒毛高度/隐窝深度(V/C)。
1.6 抗菌肽基因表达采集十二指肠、空肠、回肠组织,置液氮速冻后于-80 ℃超低温冰箱保存,用Trizol Reagent提取肠道组织中的总RNA,检测总RNA的浓度以及光密度(OD)260/OD280值,反转为cDNA,再用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测抗菌肽猪β-防御素1(pBD-1)、猪β-防御素2(pBD-2)的mRNA相对表达量。pBD-1、pBD-2引物自行设计合成,内参基因18S rRNA参考Yang等[6]进行合成,引物序列见表 2。
利用SPSS 23.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),P < 0.05为差异显著水平,采用最小显著差数(LSD)法进行多重比较。数据结果以平均值±标准差(mean±SD)表示。
2 结果 2.1 Se-EPS对断奶仔猪生长性能的影响由表 3可知,与对照组相比,饲粮中添加Na2SeO3、Na2SeO3+APS、Na2SeO3+EPS、Se-EPS均未对断奶仔猪的平均日采食量有显著影响(P>0.05);饲粮中添加Na2SeO3+APS、Na2SeO3+EPS、Se-EPS均显著提高了断奶仔猪的平均日增重和末重(P < 0.05),且Se-EPS组显著高于Na2SeO3组(P < 0.05);饲粮中添加Na2SeO3、Na2SeO3+APS、Na2SeO3+EPS、Se-EPS均显著降低了断奶仔猪的料重比(P < 0.05),且Na2SeO3+APS、Se-EPS组显著低于Na2SeO3组(P < 0.05)。Se-EPS在提高断奶仔猪平均日增重、降低料重比方面稍优于Na2SeO3+EPS,但无显著差异(P>0.05)。
由表 4可知,与对照组相比,饲粮中添加Se-EPS显著提高了断奶仔猪的血清T-AOC及GSH-Px、SOD活性(P < 0.05),显著降低了血清MDA含量(P < 0.05)。与Na2SeO3组相比,Se-EPS组断奶仔猪的血清T-AOC显著提高(P < 0.05),血清MDA含量显著降低(P < 0.05)。与Na2SeO3+APS和Na2SeO3+EPS组相比,Se-EPS组断奶仔猪的血清抗氧化指标没有显著差异(P>0.05)。
由表 5可知,与对照组相比,饲粮中添加Se-EPS显著提高了断奶仔猪的十二指肠V/C(P < 0.05),有增加十二指肠绒毛高度及降低十二指肠隐窝深度的趋势(P>0.05);饲粮中添加Na2SeO3+EPS、Se-EPS显著提高了断奶仔猪的空肠绒毛高度和V/C(P < 0.05),且Na2SeO3+EPS组和Se-EPS组之间无显著差异(P>0.05)。
由图 1可知,与对照组相比,饲粮中添加Na2SeO3、Na2SeO3+APS、Na2SeO3+EPS、Se-EPS均可提高断奶仔猪十二指肠、空肠和回肠中抗菌肽基因pBD-1、pBD-2的mRNA相对表达量。其中,Se-EPS组十二指肠中pBD-1和空肠、回肠中pBD-2的mRNA相对表达量显著高于对照组(P < 0.05);Na2SeO3+EPS组空肠中pBD-2的mRNA相对表达量显著高于对照组(P < 0.05);Na2SeO3+APS、Na2SeO3+EPS组回肠中pBD-2的mRNA相对表达量显著高于对照组(P < 0.05)。
多糖作为一种天然、绿色、无药残和无耐药性添加剂,具有提高幼龄动物平均日增重及饲料转化率、促进动物生长等功效。田允波等[7]研究表明,白术多糖可显著提高“杜×长×大”三元杂交断奶仔猪的平均日增重,并降低料重比。许丹宁等[8]研究表明,饲粮中添加0.50%的白术多糖,不仅能提高仔猪平均日增重,降低料重比,还影响仔猪的内分泌系统,促进其生长。APS也被广泛应用于养猪生产中,APS可抑制肠道有害菌群增殖[9],降低仔猪腹泻发生率[10],增强仔猪免疫力[11],提高断奶仔猪成活率以及断奶重。骆先虎等[12]研究发现,饲粮中添加APS显著提高了断奶仔猪的平均日增重及养分消化率,降低了料重比和腹泻率。
本研究发现,饲粮中添加Se-EPS未显著影响断奶仔猪平均日采食量,提示饲粮中添加Se-EPS并不影响断奶仔猪饲粮的适口性。平均日增重方面,饲粮中添加Se-EPS显著提高了断奶仔猪平均日增重,且Se-EPS组优于Na2SeO3、Na2SeO3+APS、Na2SeO3+EPS组,提示在促进仔猪平均日增重方面,Se-EPS较APS和EPS效果更优。料重比方面,饲粮中添加Na2SeO3、Na2SeO3+APS、Na2SeO3+EPS、Se-EPS均显著降低了断奶仔猪的料重比,且Na2SeO3+APS、Se-EPS组显著低于Na2SeO3组,提示Se-EPS和APS在降低料重比方面作用效果相当。综上结果表明,Se-EPS可提高断奶仔猪平均日增重,降低料重比,这为Se-EPS在断奶仔猪上的进一步应用提供了可能。
3.2 Se-EPS对断奶仔猪血清抗氧化指标的影响机体中的活性氧自由基增多会造成机体氧化损伤甚至导致疾病[13-14]。因此,使用抗氧化剂以减少活性氧自由基含量,从而减轻其对机体的损伤极为重要。硒作为GSH-Px和硫氧还蛋白还原酶(TrxR)等含硒酶的组成部分发挥抗氧化功能[15-16]。然而,无机硒和有机硒在抗氧化作用方面存在明显差异,且有研究表明有机硒(如硒多糖)具有更高的抗氧化活性。岳丽红等[17]在体外比较了黑木耳硒多糖和黑木耳多糖的氧化能力,发现黑木耳硒多糖较黑木耳多糖抗氧化能力更佳。此外,本课题组前期研究发现,添加400 μg/mL Se-EPS可显著提高RAW264.7细胞内SOD和GSH-Px的活性,抑制活性氧、MDA的产生和乳酸脱氢酶(LDH)的释放,从而缓解过氧化氢(H2O2)诱导的氧化损伤[18]。本研究发现,与Na2SeO3组相比,Se-EPS组断奶仔猪血清T-AOC显著提高,血清MDA含量显著降低,表明Se-EPS具有更好的抗氧化功能。
硒在机体内最基本、最重要的功能是发挥抗氧化作用、维持机体氧化还原稳态,主要沉积在动物肝脏、肾脏、胰脏中,较少沉积于血液、骨骼和肌肉中。目前硒沉积的研究热点是富硒畜产品的开发,如富硒猪肉、鸡蛋和牛奶等,主要集中在育肥猪、蛋鸡和奶牛上,而在仔猪上的沉积研究较少。本试验重点关注了Se-EPS在断奶仔猪上的抗氧化功能,而其在动物组织中的沉积有待进一步研究。
3.3 Se-EPS对断奶仔猪肠道形态结构的影响肠道作为机体最大的消化器官,可以阻止病原菌等的入侵[19],而断奶应激会严重影响肠屏障结构和功能的完整性[20-21]。研究表明,饲粮中添加多糖能够改善仔猪小肠黏膜形态结构,提高肠道对养分的消化吸收能力,促进断奶仔猪的生长[22-23]。宋德广[24]研究发现,生物纳米单质硒可缓解小肠上皮细胞氧化应激损伤,抑制细胞凋亡,从而维持肠绒毛形状的完整及肠道屏障结构和功能。本研究中,在断奶仔猪饲粮中添加Na2SeO3+EPS、Se-EPS在一定程度上可提高十二指肠绒毛高度,降低十二指肠隐窝深度,且饲粮中添加Se-EPS显著提高了空肠绒毛高度。这表明Se-EPS可缓解断奶应激造成的肠道形态结构损伤,从而维护肠道对养分的正常消化吸收。
3.4 Se-EPS对断奶仔猪抗菌肽基因表达的影响抗菌肽作为机体先天免疫的重要组成成分之一,能帮助机体抵抗有害细菌或病毒等的入侵。哺乳动物体内的抗菌肽主要包括defensins和cathehcidins两大家族[25-26]。pBD-1是组织表达型抗菌肽,主要分布于猪的呼吸道、消化道、胸腺和脾脏等组织中。研究表明,pBD-1的表达可能受到病原菌的调控,如当机体受到病毒或有害细菌的侵袭,pBD-1的含量会增加,从而降低病原菌(如沙门氏菌等)对机体的伤害[27]。pBD-2作为诱导型防御素,其表达受多种因素影响,如锌离子(Zn2+)、L-异亮氨酸[28]、支链氨基酸[29]以及罗伊氏乳杆菌等[30]。Wan等[31]研究表明,表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)可促进肠道分泌抗菌肽pBD-1和pBD-2,减少细菌易位,从而更有效地抵抗大肠杆菌感染。本研究发现,饲粮中添加Se-EPS显著提高了十二指肠中pBD-1的mRNA相对表达量;饲粮中添加Na2SeO3+EPS、Se-EPS显著提高了空肠中pBD-2的mRNA相对表达量;对于回肠中抗菌肽基因的表达,饲粮中添加Na2SeO3+APS、Na2SeO3+EPS、Se-EPS显著提高了回肠中pBD-2的mRNA相对表达量。结果提示,Se-EPS可提高肠道抗菌肽基因的表达,而不同肠段存在一定差异。
4 结论饲粮中添加Se-EPS可提高断奶仔猪生长性能、抗氧化功能以及促进肠道内源抗菌肽的表达。
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