2. 甘肃省农业科学院畜草与绿色农业研究所, 兰州 730070
2. Institute of Animal and Pasture Science and Green Agriculture, Gansu Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730070, China
长期以来，反刍动物营养学家一直致力于调节瘤胃中不同微生物菌群之间的竞争关系，以提高能量和蛋白质的利用效率，这可以通过优化饲粮配方和利用饲料添加剂改善。饲料添加剂不仅可以改善瘤胃内环境，还能增强或抑制特定微生物菌群的结构[1]。莫能菌素是一种在动物生产当中被大量使用的饲料添加剂，然而，新出现的细菌耐药性引发了关于使用抗生素作为动物促生长剂的激烈争论[2]，同时强调了植物提取物的重要性[3]。植物精油是从芳香和药用植物中提取的挥发性化合物，具有抗菌、抗病毒、抗真菌、抗线虫、杀虫和抗氧化特性[4-7]。牛至精油是植物精油中的一种，其所具有的上述特性归因于酚类成分中百里香酚和香芹酚中存在羟基[8]，且酚类物质的含量高于大多数其他植物，因而被公认为潜在的植物抗生素[9-11]，因此可能具有调节反刍动物瘤胃发酵的潜力[12]。香芹酚和百里酚在体外对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌具有广谱的抗菌活性[13-14]，尤其会影响普雷沃氏菌科、毛螺菌属以及瘤胃球菌科家族的相对丰度[7]。有研究者通过体外试验发现，牛至精油在降低丁酸弧菌属(Butyrivibrio)的相对丰度的方面显现出比其他精油更强的抗菌活性，但能够提高普雷沃菌属(Prevotella)中一些成员的相对丰度[15]。
迄今为止，牛至精油对瘤胃微生物菌群影响的研究大部分是在体外培养的基础上进行，只有少数的研究验证了牛至精油在非反刍动物体内的作用效果，而牛至精油对荷斯坦犊牛体内作用效果的研究鲜有报导。因此，牛至精油作为潜在的抗生素替代物，研究其对犊牛生长发育的作用具有重要的意义。本试验利用高通量测序技术对荷斯坦犊牛瘤胃微生物菌群中的16S rDNA进行测序，研究饲粮中添加牛至精油和莫能菌素对犊牛瘤胃发酵参数和瘤胃菌群结构的影响，探寻牛至精油替代莫能菌素调节瘤胃发酵以及微生物菌群结构的可能性，以期为牛至精油在畜牧养殖中的应用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验所用的牛至精油由美国瑞科公司提供，暗绿色粉末状，纯度为1%，载体主要为碳酸硅、碳酸钙、硅藻土(助流剂)等；莫能菌素购自武汉远城科技发展有限公司，白色粉末状，纯度为20%，载体主要为次粉、碳酸钙等。
1.2 试验设计试验采用单因素随机设计，从临洮华加牧业有限公司选取体况良好、体重相近的荷斯坦初生犊牛80头，体重(41.31±2.23) kg，随机分成4组，每组20头。牛至精油组开食料中添加4.0 g/kg牛至精油，莫能菌素组开食料中添加3.6 g/kg莫能菌素，混合组开食料中添加4.0 g/kg牛至精油+3.6 g/kg莫能菌素，对照组开食料中不添加任何饲料添加剂。牛至精油和莫能菌素分别按照4.0和3.6 kg/t的比例添加入犊牛开食料中，开食料由甘肃德华生物股份有限公司临洮分公司的饲料设备加工而成，保证牛至精油和莫能菌素能够在开食料中混合均匀，开食料参照NRC(2001)[16]荷斯坦犊牛饲养标准配制，其组成及营养水平见表 1。
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表 1 开食料组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the starter (DM basis) |
参与试验的荷斯坦犊牛采取单栏饲养的方式安置在铺有麦草的犊牛圈中。犊牛出生当天为0日龄，0~2日龄饲喂牛初乳，早、晚各1次，每天提供足量温水；3~10日龄，08:00和20:00各饲喂全脂牛乳2 L；11~35日龄，早晚各饲喂全脂牛乳3 L；36~42日龄，08:00饲喂全脂牛乳3 L；43日龄断奶。从3日龄起饲喂开食料，供其自由采食至70日龄。保持圈舍通风，勤换犊牛圈的麦草。
1.4 样品采集与处理 1.4.1 饲粮样品的采集与测定将每周饲喂的颗粒饲料采集0.5 kg原始样本封存于封口袋内，-20 ℃冰箱冷冻保存，共得到原始样本5 kg。将5 kg原始样本用“四分法”缩减制备分析样本300 g，65 ℃烘干48 h，制作成风干样品用于开食料营养水平的测定。总能和能量消化率估算公式参考我国《肉牛饲养标准》(NY/T 815—2004)[17]，并据此计算消化能：
消化能(MJ/kg)=总能×能量消化率。
样品中干物质(DM)的含量按照GB/T 6435—2014[18]的方法测定；粗脂肪(EE)含量按照GB/T 6433—2006[19]的方法测定，使用索氏提取仪(FOSS SoxtecTM 2043，丹麦)测定；粗蛋白质(CP)含量按照GB/T 6432—1994[20]的方法，使用全自动凯氏定氮仪(FOSS Kjelte 8400，丹麦)测定；中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量按照Van Soest等[21]的方法，使用全自动纤维仪(FOSS FibertecTM M6 1020，丹麦)测定；粗灰分(Ash)、钙(Ca)、磷(P)含量分别按照GB/T 6438—2007[22]、GB/T 6436—2002[23]、GB/T 6437—2002[24]的方法测定。
1.4.2 瘤胃液采集与处理试验犊牛在70日龄时，从4个组中分别选取体重接近该组平均体重的3头犊牛作为采样对象，要求每组的采样对象日龄接近，健康状况良好，近期精神状态和采食情况正常。12头作为采样对象的犊牛70日龄具体生长性能数据如下：平均体重为(91.38±9.02) kg，平均日增重为(0.72±0.15) kg，开食料平均干物质采食量为(0.97±0.32) kg。晨饲前通过口腔导管采集瘤胃液，丢弃前100 mL抽取出的瘤胃液，将采集的瘤胃液分装在3支5 mL的冻存管中，1支投入-80 ℃的液氮罐当中用于测定瘤胃微生物区系；2支经过4层无菌纱布过滤后放置在冰箱中-20 ℃保存，分别用于氨态氮和挥发性脂肪酸含量的测定；瘤胃液剩余部分放置在50 mL的冻存管中现场测定pH。
1.5 DNA样品提取、扩增和测序将样品送往内蒙古犇牛科技有限公司进行样品DNA提取、扩增、纯化及目标片段文库构建，采用Illumina MiSeq PE300上机测序。具体步骤为：采用2.0%琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000检测样品DNA的质量。引物上添加测序接头和样本特异性Barcode序列，进而扩增16S rDNA序列的V3~V4区，引物序列如下：上游引物338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′；下游引物806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。对纯化后的PCR产物采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit在Promega QuantiFluor荧光定量系统上对文库进行定量，将纯化的扩增产物根据所需测序量按相应比例混合，构建测序文库，使用MiSeq测序仪进行2×300 bp的双端测序。
1.6 序列分析采用Magoc等[25]的算法将序列相似性大于97%的clean tags定为1个操作分类单位(OTU)，挑选最佳的centroids(位于几何中心)序列作为该OTU的代表序列，用于后续OTU聚类、多样性指数以及群落结构分析。
1.7 瘤胃发酵参数测定瘤胃液冷冻样品在4 ℃冰箱中解冻，并在2 678×g和4 ℃条件下离心10 min，取1 mL上清液转移至新的离心管并加入0.2 mL含有内标物2-乙基丁酸(2EB)的25%(质量体积比)偏磷酸溶液，混匀后放在冰水中静置30 min。9 184×g和4 ℃条件下离心10 min，取1 mL存于离心管中备测。通过气相色谱仪(GC-2010，日本岛津)测定瘤胃液挥发性脂肪酸组分含量和比例。瘤胃液氨态氮含量的测定采用冯宗慈等[26]改进的方法。使用精密型pH测量计(Testo-206pH，德国德图)检测瘤胃液pH。
1.8 统计分析试验数据经Excel 2013初步整理后，采用SAS 9.4统计软件中的ANOVA过程进行单因素方差分析，差异显著则采用Duncan氏法进行多重比较，以P < 0.01为差异极显著，P < 0.05为差异显著，0.05≤P < 0.10为有差异显著趋势。
2 结果与分析 2.1 牛至精油和莫能菌素对犊牛瘤胃发酵参数的影响由表 2可知，与对照组相比，莫能菌素组和混合组的瘤胃液氨态氮含量均显著降低(P < 0.05)；莫能菌素组的瘤胃液乙酸含量降低，丙酸含量提高，呈差异显著趋势(0.05≤P < 0.10)；莫能菌素组的瘤胃液丙酸比例显著提高(P < 0.05)，乙酸比例有降低趋势(0.05≤P < 0.10)。
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表 2 牛至精油和莫能菌素对犊牛瘤胃发酵参数的影响 Table 2 Effects of oregano essential oil and monensin on rumen fermentation parameters of calves |
4个组共计12个瘤胃液样品，待瘤胃液样品总DNA取后，对其进行质量检测，检测结果表明，浓度和纯度均符合Illumina MiSeq PE300平台测序要求。对不同样品基因组DNA进行16S rDNA基因V3~V4区域扩增，并经1%的琼脂糖凝胶电泳后如图 1所示：扩增的条带单一，可以进行后续测序试验。
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1、2和3为牛至精油组瘤胃液样品，4、5和6为莫能菌素组瘤胃液样品，7、8和9为混合组瘤胃液样品，10、11和12为对照组瘤胃液样品，M、NTC分别为电泳Marker和空白对照。 1, 2 and 3 were rumen fluid samples of oregano essential oil group, 4, 5 and 6 were rumen fluid samples of monensin group, 7, 8 and 9 were rumen fluid samples of mix group; 10, 11 and 12 were rumen fluid samples of control group, M and NTC were the electrophoresis marker and blank control. 图 1 琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果 Fig. 1 Results of agarose gel electrophoresis for PCR |
根据双端序列的overlap关系，将序列拼接成长的tag，并对序列质量进行质控和过滤，利用Vsearch计算序列相似性大于97%的OTU。由表 3可知，牛至精油组和混合组的原始序列数量显著高于对照组(P < 0.05)，牛至精油组和混合组的OTU数量有高于对照组的趋势(0.05≤P < 0.10)。
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表 3 对照组、牛至精油组、莫能菌素组和混合组样品所获得的原始序列数量和OTUs数量 Table 3 Raw reads number and OTU number obtained from samples in control group, oregano essential oil group, monensin group and mix group |
稀释曲线可以在相同的测序深度下直接反映测序数据量的合理性，比较不同试验组中OTU数量的多少，并在一定程度上反映微生物多样性的丰富程度[27]。本试验根据OTU数量构建出12个样本的稀释曲线，从图 2和图 3可知，标签样本数量低于5 000时，OTU数量呈骤升趋势，表明瘤胃内仍有未检测到的细菌，而随着标签样本数量的不断增加，稀释曲线和Shannon稀释曲线走势逐渐趋于平缓，说明数据量满足样品菌群多样性的分析要求。
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图 2 犊牛瘤胃细菌OTU稀释曲线 Fig. 2 OTU dilution curve of bacteria in rumen of calves |
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图 3 犊牛瘤胃细菌OTU Shannon稀释曲线 Fig. 3 OTU Shannon dilution curve of bacteria in rumen of calves |
Chao1指数、ACE指数、Shannon指数和Simpson指数是评价单个样品菌群多样性的指标[28]。其中Chao1指数和ACE指数反映样品中微生物的种类，即OTU的数量。Shannon指数和Simpson指数则是通过OTU数量和匀度综合反映样品菌群的多样性。由表 4可知，饲粮中添加牛至精油、莫能菌素及其混合物没有提高犊牛瘤胃中细菌的丰富度指数以及多样性指数。各组的覆盖率均高于98%，说明足够反映不同试验中每头犊牛瘤胃菌群的情况。
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表 4 样品多样性指数 Table 4 Diversity index of samples |
Beta多样性主要是为了研究不同样品或组之间的菌群结构差异，它与Alpha多样性差异在于Alpha多样性只是用来描述单个样品的菌群多样性，而Beta多样性则是比较不同样品之间的菌群多样性差异。采用加权Unifrac比较对照组、牛至精油组、莫能菌素组和混合组之间的微生物群落之间的距离，图 4可以直观地反映出不同组中物种的组成结构存在差异。每个组的微生物群落聚类清晰，主成分1(PC1)为造成样品微生物群落结构差异性最大的主坐标成分，4个组中样品间呈27.86%多样性，其次为主成分2(PC2)，多样性为7.62%；在PC1维度上，除了混合组和对照组之外，其他组之间微生物群落均呈现出清晰的聚类。在PC2的维度上除莫能菌素组和牛至精油组之外，其他组之间的微生物群落均能很好地区分开。
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A圈内的绿色代表莫能菌素组；B圈内的蓝色代表牛至精油组；C圈内的红色代表混合组；D圈内的黄色代表对照组。 The green in circle A showed the monensin group; the blue in circle B showed the oregano essential oil group; the red in circle C showed the mix group; the yellow in circle D showed the control group. 图 4 16S rDNA的主坐标分析 Fig. 4 Principal coordinate analysis of 16S rDNA |
对照组、牛至精油组、莫能菌素组和混合组的犊牛瘤胃细菌在门水平上的组成和相对丰度见表 5和图 5，共检测到21种菌门，包括厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、螺旋菌门(Spirochaetes)、丝状杆菌门(Fibrobacteres)、软壁菌门(Tenericutes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、互养菌门(Synergistetes)、蓝藻菌门(Cyanobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、广古菌门(Euryarchaeota)、梭杆菌门(Fusobacteria)、黏胶球形菌门(Lentisphaerae)、浮霉菌门(Planctomycetes)等。4个组中犊牛瘤胃液所含的菌门主要为厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门，占到了总细菌的96.51%。牛至精油组、莫能菌素组和混合组的瘤胃液中变形菌门的相对丰度极显著低于对照组(P < 0.01)；莫能菌素组的瘤胃液中拟杆菌门的相对丰度高于对照组，而螺旋菌门的相对丰度低于对照组，且差异均呈显著趋势(0.05≤P < 0.10)；混合组的瘤胃液中螺旋菌门的相对丰度低于对照组，且差异呈显著趋势(0.05≤P < 0.10)。
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表 5 牛至精油和莫能菌素对犊牛瘤胃菌群在门水平相对丰度的影响 Table 5 Effects of oregano oil and monensin on relative abundance in rumen microflora of calves at phylum level |
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图 5 门水平上瘤胃菌群分布图 Fig. 5 Distribution diagram of rumen microflora at phylum level |
对照组、牛至精油组、莫能菌素组和混合组的犊牛瘤胃细菌在属水平上的组成和相对丰度见表 6和图 6，将瘤胃细菌群落细化分类注释到细菌属水平，4个组犊牛瘤胃液菌群总共包含244个属。其中普雷沃氏菌属(Prevotella)、解琥珀酸菌属(Succiniclasticum)、未注释毛螺菌属(Lachnospiraceae_NA)、琥珀酸弧菌属(Succinivibrio)、未注释瘤胃球菌属(Ruminococcaceae_NA)、未注释属(NA)、奥尔森菌属(Olsenella)、未注释拟杆菌属(Bacteroidaceae_NA)、真细菌属(Eubacterium)、Rikenella、醋弧菌属(Acetivibrio)共12个菌属的平均相对丰度占整体的92.50%以上。牛至精油组、莫能菌素组和混合组的瘤胃液中普雷沃氏菌属的相对丰度均高于对照组，差异呈显著趋势(0.05≤P < 0.10)；牛至精油组的瘤胃液中丁酸弧菌属的相对丰度低于对照组，差异呈显著趋势(0.05≤P < 0.10)；莫能菌素组的瘤胃液中奥尔森菌属的相对丰度显著低于对照组(P < 0.05)，而未注释瘤胃球菌属的相对丰度显著高于对照组(P < 0.05)，瘤胃球菌属和丁酸弧菌属的相对丰度均低于对照组，差异呈显著趋势(0.05≤P < 0.10)；混合组的瘤胃液中梭菌属的相对丰度低于对照组，差异呈显著趋势(0.05≤P < 0.10)。
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表 6 牛至精油和莫能菌素对犊牛瘤胃菌群在属水平相对丰度的影响 Table 6 Effects of oregano oil and monensin on relative abundance in rumen microflora of calves at genus level |
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图 6 属水平上瘤胃菌群分布图 Fig. 6 Distribution diagram of rumen microflora at genus level |
瘤胃中的细菌群落多样性极其丰富，尤其是在种和属水平上，在种水平上共包含5 200多个OTU，在属水平上包含3 500多个OTU[29-30]，其中厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门是哺乳动物胃肠道中的优势菌群[31-32]。在本研究中，牛至精油组、莫能菌素组和混合组的犊牛瘤胃液中厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门占主导地位，且厚壁菌门所占比例高于拟杆菌门和变形菌门。Li等[33]和Alipour等[34]报道了荷斯奶牛和犊牛瘤胃菌群中厚壁菌门相对丰度高于拟杆菌门和变形菌门，与本试验研究结果一致。Peng等[35]和Chen等[36]研究表明，在荷斯坦奶牛瘤胃中的菌群以拟杆菌门为主，与本试验结果拟杆菌门处于第2位的优势菌群稍有不同，这种差异可能是由于动物品种、动物日龄以及饲粮结构的不同而引起的[36-37]。Patra等[15]和Shen等[38]的研究结果表明，体外培养条件下，添加牛至精油和莫能菌素可以调节瘤胃液中细菌的生长比例，提高拟杆菌门相对丰度并使之成为优势菌群。在本研究中，莫能菌素提高了犊牛瘤胃液中拟杆菌门的相对丰度，与前人研究结果一致，而牛至精油未能提高拟杆菌门的相对丰度，这可能是由于反刍动物瘤胃内环境的复杂性和特殊性，添加牛至精油在体内效果和体外效果存在差异。刚出生犊牛瘤胃中变形菌门是主要的菌群，相对丰度随着日龄的增长而减小，并和其他菌群维持平衡的状态[39-40]，而本研究结果发现，添加牛至精油、莫能菌素及其混合物能够降低犊牛瘤胃液中变形菌门的相对丰度。已有大量的研究解释了牛至精油抗菌性能的作用机制，其中主要由化学结构和物理性质决定了其抗菌效果[41]，酚类结构的存在以及羟基的位置会影响精油的抗菌效力[13]，而牛至精油比其他种类的植物精油具有更强的抗菌能力，能够在较小的剂量下杀死病菌。变形菌门除了包含蛋白质降解菌、淀粉降解菌、纤维素降解菌、半纤维素降解菌以及乳酸利用菌以外还存在大量的病原菌，例如：大肠杆菌、沙门氏菌和幽门螺杆菌等[42]，而莫能菌素作为一种离子载体型抗生素，对革兰氏阳性菌有较强的杀菌作用，这可以解释在本研究中添加莫能菌素后，瘤胃液中变形菌门相对丰度降低的原因。
3.2 影响荷斯坦犊牛瘤胃液发酵参数的细菌种属分析在属水平上，普雷沃菌属是普遍存在于食草动物和杂食动物瘤胃及胃肠道内的蛋白质降解菌，除此以外还能够利用淀粉、单糖以及其他非纤维素多糖作为能源，以琥珀酸作为主要发酵终产物，然后通过琥珀酸和丙烯酸途径发酵糖类物质和乳酸，琥珀酸的脱羧反应迅速，立即产生丙酸，最后通过糖异生作用维持宿主动物的葡萄糖稳态[43-44]。一般来说，革兰氏阴性细菌存在保护性外膜，也因此比革兰氏阳性细菌更不易受精油作用的影响[13, 41]，而普雷沃氏菌属的成员属于革兰氏阴性菌，在本试验中，添加牛至精油、莫能菌素菌及混合物均能提高瘤胃液中普雷沃氏菌属的相对丰度。此外，与对照组相比，添加莫能菌素提高了犊牛瘤胃液中丙酸的摩尔浓度，这一研究结果与Weimer等[45]和SchĠren[46]报道的相一致。而本试验中牛至精油组犊牛瘤胃液中乙酸和丙酸的含量未发生变化，但Partra等[47]研究报道指出，在体外条件下，添加牛至精油降低了泽西牛瘤胃液中乙酸和丙酸的含量，Bencharr等[48]证明了在体外条件下添加牛至精油并没有提高或降低荷斯坦奶牛瘤胃中乙酸和丙酸的含量，本试验研究结果与Bencharr等[48]相一致，与Partra等[47]研究结果不同。
Shen等[38]在研究莫能菌素对荷斯坦奶牛瘤胃发酵参数的影响中发现，莫能菌素能降低瘤胃液中乙酸比例，这是由于莫能菌素降低了革兰氏阳性纤维溶解菌(如瘤胃球菌属)在瘤胃液中的相对丰度，而瘤胃球菌属是主要的乙酸盐生产菌[49]。然而，在本试验中，莫能菌素组中未注释瘤胃球菌属的相对丰度高于其他3个组，这可能是由于犊牛瘤胃内瘤胃球菌属的生长因添加莫能菌素而受到抑制，导致提高了与它有竞争关系的未注释瘤胃球菌属的相对丰度。
奥尔森菌属是革兰氏阳性细菌属，主要存在于健康状况良好的牛的瘤胃当中[50-51]，其最终代谢产物主要是乙酸和乳酸，在本研究中，添加莫能菌素降低了奥尔森菌属的相对丰度，这可能也是引起乙酸含量降低的原因之一。丁弧酸菌属广泛存在于瘤胃当中，其细菌主要产生丁酸[52]，尽管过去有研究者表明丁酸弧菌属的成员属于革兰氏阴性菌，但它们的细胞壁含有茶青酸的衍生物，这种属的细菌在电镜的观察下发现细胞壁结构呈革兰氏阳性菌，因此对精油非常敏感[53]，在本试验当中，牛至精油降低了瘤胃液中丁酸弧菌属的相对丰度，这与先前的研究报道[54-55]相一致。Capelari等[56]也证明了莫能菌素能降低体外培养瘤胃液中丁酸的摩尔浓度，而在本试验中，牛至精油和莫能菌素均降低了丁弧酸菌属的相对丰度，但未降低瘤胃液中丁酸含量，这可能是瘤胃液中菌群之间具有竞争或者拮抗作用，当丁酸弧菌属收到抑制后，其他有利于产丁酸的菌群未受牛至精油和莫能菌素的影响。此外，混合组犊牛瘤胃液中梭菌属的相对丰度低于对照组，有相关报道指出，莫能菌素能够抑制产高氨的细菌，例如梭菌属[57]，因此，这可能是造成莫能菌素组和混合组的瘤胃液中氨态氮含量低于对照组的原因之一。
3.3 其他指标的探讨本试验只列出了部分具有较高相对丰度门水平和属水平的微生物群落，其成员被称为主要瘤胃细菌[58]，但在反刍动物瘤胃中，相对丰度较低的微生物群落则不能直接被认为是功能性或重要性较小，例如一些重要的菌属：纤维杆菌属、硒单胞菌属和链球菌在成年牛中的相对丰度低于1%，这需要进一步研究并确定这些微生物种属在瘤胃中的作用[59]。反刍动物pH是衡量瘤胃发酵以及微生物代谢平衡状况的一个重要指标[60]，pH的高低在一定程度上影响瘤胃微生物的活性[37]，而反刍动物瘤胃液pH为5.50~6.80[61]，在本试验中，pH的在6.35~6.67之间，均在适宜的范围内。
4 结论① 饲粮中添加牛至精油未能影响犊牛瘤胃液的发酵参数；饲粮中添加莫能菌素降低了瘤胃液中氨态氮和乙酸含量，有提高丙酸的摩尔浓度的趋势；饲粮中添加牛至精油和莫能菌素混合物降低了瘤胃液中氨态氮含量。
② 在门水平上，饲粮中添加牛至精油、莫能菌素以及牛至精油和莫能菌素的混合物均能够降低变形菌门的相对丰度。
③ 在属水平上，饲粮中添加牛至精油、莫能菌素以及牛至精油和莫能菌素的混合物均有提高犊牛瘤胃液中普雷沃氏菌属相对丰度的趋势；饲粮中添加牛至精油有降低丁酸弧菌属相对丰度的趋势；饲粮中添加莫能菌素能够降低奥尔森菌属的相对丰度，并有降低瘤胃球菌属和丁酸弧菌属相对丰度的趋势；饲粮中添加牛至精油和莫能菌素组的混合物有降低梭菌属相对丰度的趋势。
④ 牛至精油、莫能菌素及牛至精油和莫能菌素的混合物均能调节犊牛瘤胃液中菌群的结构，牛至精油能提高犊牛瘤胃中蛋白质降解菌的丰度，降低产丁酸菌属的丰度，同时能够避免或者缓冲莫能菌素对有益菌群的破坏。
| [1] |
CALSAMIGLIA S, CASTILLEJOS L, BUSQUET M. Alternatives to antimicrobial growth promoters in cattle[M]. Nottingham: Nottingham University Press, 2006: 129-167.
|
| [2] |
CHATTOPADHYAY M K. Use of antibiotics as feed additives:a burning question[J]. Frontiers in Microbiology, 2014, 5: 334. |
| [3] |
KHIAOSA-ARD R, ZEBELI Q. Meta-analysis of the effects of essential oils and their bioactive compounds on rumen fermentation characteristics and feed efficiency in ruminants[J]. Journal of Animal Science, 2013, 91(4): 1819-1830. DOI:10.2527/jas.2012-5691 |
| [4] |
WALLACE R J. Antimicrobial properties of plant secondary metabolites[J]. Proceedings of the Nutrition Society, 2004, 63(4): 621-629. DOI:10.1079/PNS2004393 |
| [5] |
ÇETIN B, ÇAKMAKÇI S, ÇAKMAKÇI R. The investigation of antimicrobial activity of thyme and oregano essential oils[J]. Science of the Total Environment, 2011, 35: 145-154. |
| [6] |
BAKKALI F, AVERBECK S, AVERBECK D, et al. Biological effects of essential oils-A review[J]. Food and Chemical Toxicology, 2008, 46(2): 446-475. DOI:10.1016/j.fct.2007.09.106 |
| [7] |
LEI Z M, ZHANG K, LI C, et al. Ruminal metagenomic analyses of goat data reveals potential functional microbiota by supplementation with essential oil-cobalt complexes[J]. BMC Microbiology, 2019, 19(1): 30. DOI:10.1186/s12866-019-1400-3 |
| [8] |
BEN-ARFA A, COMBES S, PREZIOSI-BELLOY L, et al. Antimicrobial activity of carvacrol related to its chemical structure[J]. Letters in Applied Microbiology, 2010, 43(2): 149-154. |
| [9] |
PIZZALE L, BORTOLOMEAZZI R, VICHI S, et al. Antioxidant activity of sage (Salvia officinalis and S. fruticosa) and oregano (Origanum onites and O. indercedens) extracts related to their phenolic compound content[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2002, 82(14): 1645-1651. DOI:10.1002/jsfa.1240 |
| [10] |
BAYDAR H, SAĞDIÇ O, ÖZKAN G, et al. Antibacterial activity and composition of essential oils from Origanum, Thymbra and Satureja species with commercial importance in Turkey[J]. Food Control, 2004, 15(3): 169-172. DOI:10.1016/S0956-7135(03)00028-8 |
| [11] |
OZKAN G, BAYDAR H, ERBAS S. The influence of harvest time on essential oil composition, phenolic constituents and antioxidant properties of Turkish oregano (Origanum onites L.)[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2010, 90(2): 205-209. DOI:10.1002/jsfa.3788 |
| [12] |
PARASKEVAKIS N. Effects of dietary Greek oregano (Origanum vulgare ssp.hirtum) supplementation on rumen fermentation, enzyme profile and microbial communities in goats[J]. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition, 2017, 102(3): 701-705. |
| [13] |
DORMAN H J D, DEANS S G. Antimicrobial agents from plants:antibacterial of plant volatile oils[J]. Journal of Applied Microbiology, 2000, 88(2): 308-316. DOI:10.1046/j.1365-2672.2000.00969.x |
| [14] |
MATHLOUTHI N, BOUZAIENNE T, OUESLATI I, et al. Use of rosemary, oregano, and a commercial blend of essential oils in broiler chickens:in vitro antimicrobial activities and effects on growth performance[J]. Journal of Animal Science, 2012, 90(3): 813-823. DOI:10.2527/jas.2010-3646 |
| [15] |
PATRA A K, YU Z T. Essential oils affect populations of some rumen bacteria in vitro as revealed by microarray (rumen bactarray) analysis[J]. Frontiers in Microbiology, 2015, 6: 297. |
| [16] |
NRC.Nutrient requirements of dairy cattle[S].7th ed.Washington, D.C.: National Academies Press, 2001.
|
| [17] |
中华人民共和国农业部.NY/T815-2004肉牛饲养标准[S].北京: 中国农业出版社, 2004.
|
| [18] |
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局, 中国国家标准化管理委员会.GB/T 6435-2014饲料中水分的测定[S].北京: 中国标准出版社, 2015.
|
| [19] |
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局, 中国国家标准化管理委员会.GB/T 6433-006饲料中粗脂肪的测定[S].北京: 中国标准出版社, 2006.
|
| [20] |
国家技术监督局.GB/T 6432-1994饲料中粗蛋白测定方法[S].北京: 中国标准出版社, 1994.
|
| [21] |
VAN SOEST P J, ROBERTSON J B, LEWIS B A. Symposium:carbohydrate methodology, metabolism and nutritional implications in dairy cattle.Methods for dietary fiber, neutral detergent fiber, and nonstarch polysaccharides in relation to animal nutrition[J]. Journal of Dairy Science, 1991, 74(10): 3583-3597. DOI:10.3168/jds.S0022-0302(91)78551-2 |
| [22] |
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局, 中国国家标准化管理委员会.GB/T 6438-2007饲料中粗灰分的测定[S].北京: 中国标准出版社, 2007.
|
| [23] |
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T 6436-2002饲料中钙的测定[S].北京: 中国标准出版社, 2002.
|
| [24] |
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T 6437-2002饲料中总磷的测定分光光度法[S].北京: 中国标准出版社, 2002.
|
| [25] |
MAGOC T, SALZBERG S L. FLASH:fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies[J]. Bioinformatics, 2011, 27(21): 2957-2963. DOI:10.1093/bioinformatics/btr507 |
| [26] |
冯宗慈, 高民. 通过比色测定瘤胃液氨氮含量方法的改进[J]. 内蒙古畜牧科学, 1993(4): 40-41. |
| [27] |
KEMP P F, ALLER J Y. Bacterial diversity in aquatic and other environments:what 16S rDNA libraries can tell us[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2004, 47(2): 161-177. DOI:10.1016/S0168-6496(03)00257-5 |
| [28] |
SAR C, SANTOSO B, MWENYA B, et al. Manipulation of rumen methanogenesis by the combination of nitrate with β, 1-4 galacto-oligosaccharides or nisin in sheep[J]. Animal Feed Science and Technology, 2004, 115(1/2): 129-142. |
| [29] |
KIM M, MORRISON M, YU Z T. Status of the phylogenetic diversity census of ruminal microbiomes[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2011, 76(1): 49-63. |
| [30] |
CREEVEY C J, KELLY W J, HENDERSON G, et al. Determining the culturability of the rumen bacterial microbiome[J]. Microbial Biotechnology, 2014, 7(5): 467-479. DOI:10.1111/1751-7915.12141 |
| [31] |
LEY R E, LOZUPONE C A, HAMADY M, et al. Worlds within worlds:evolution of the vertebrate gut microbiota[J]. Nature Reviews Microbiology, 2008, 6(10): 776-778. DOI:10.1038/nrmicro1978 |
| [32] |
SINGH K M, AHIR V B, TRIPATHI A K, et al. Metagenomic analysis of Surti buffalo (Bubalus bubalis) rumen:a preliminary study[J]. Molecular Biology Reports, 2012, 39(4): 4841-4848. DOI:10.1007/s11033-011-1278-0 |
| [33] |
LI W C, HOU Q C, WANG Y J, et al. Analysis of the gut microbial diversity of dairy cows during peak lactation by pacbio single-molecule real-time (SMRT) sequencing[J]. Current Microbiology, 2018, 75(10): 1316-1323. DOI:10.1007/s00284-018-1526-9 |
| [34] |
ALIPOUR M J, JALANKA J, PESSA-MORIKAWA T, et al. The composition of the perinatal intestinal microbiota in cattle[J]. Scientific Reports, 2018, 8: 10437. DOI:10.1038/s41598-018-28733-y |
| [35] |
PENG S, YIN J G, LIU X L, et al. First insights into the microbial diversity in the omasum and reticulum of bovine using Illumina sequencing[J]. Journal of Applied Genetics, 2015, 56(3): 393-401. DOI:10.1007/s13353-014-0258-1 |
| [36] |
CHEN Y H, PENNER G B, LI M J, et al. Changes in bacterial diversity associated with epithelial tissue in the beef cow rumen during the transition to a high-grain diet[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2011, 77(16): 5770-5781. DOI:10.1128/AEM.00375-11 |
| [37] |
丁赫, 刘旺景, 敖长金, 等. 饲粮中添加沙葱粉或复合益生菌制剂对杜寒杂交羊瘤胃发酵参数和瘤胃液菌群多样性的影响[J]. 动物营养学报, 2019, 33(1): 324-333. DOI:10.3969/j.issn.1006-267x.2019.01.039 |
| [38] |
SHEN J S, LIU Z, YU Z T, et al. Monensin and nisin affect rumen fermentation and microbiota differently in vitro[J]. Frontiers in Microbiology, 2017, 8: 1111. DOI:10.3389/fmicb.2017.01111 |
| [39] |
JAMI E, ISRAEL A, KOTSER A, et al. Exploring the bovine rumen bacterial community from birth to adulthood[J]. Microbial Ecology, 2013, 7(6): 1069-1079. |
| [40] |
REY M, ENJALBERT F, COMBES S, et al. Establishment of ruminal bacterial community in dairy calves from birth to weaning is sequential[J]. Journal of Applied Microbiology, 2013, 116(2): 245-257. |
| [41] |
BURT S. Essential oils:their antibacterial properties and potential applications in foods-a review[J]. International Journal of Food Microbiology, 2004, 94(3): 223-253. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2004.03.022 |
| [42] |
WILLIAMS K P, KELLY D P. Proposal for a new class within the phylum Proteobacteria, Acidithiobacillia classis nov., with the type order Acidithiobacillales, and emended description of the class Gammaproteobacteria[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2013, 63(8): 2901-2906. |
| [43] |
PURUSHE J, FOUTS D E, MORRISON M, et al. Comparative genome analysis of Prevotella ruminicola and Prevotella bryantii:insights into their environmental niche[J]. Microbial Ecology, 2010, 60(4): 721-729. DOI:10.1007/s00248-010-9692-8 |
| [44] |
FLINT H J, BAYER E A, RINCON M T, et al. Polysaccharide utilization by gut bacteria:potential for new insights from genomic analysis[J]. Nature Reviews Microbiology, 2008, 6(2): 121-131. DOI:10.1038/nrmicro1817 |
| [45] |
WEIMER P J, STEVENSON D M, MERTENS D R, et al. Effect of monensin feeding and withdrawal on populations of individual bacterial species in the rumen of lactating dairy cows fed high-starch rations[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2008, 80(1): 135-145. |
| [46] |
SCHÄREN M, DRONG C, KIRI K, et al. Differential effects of monensin and a blend of essential oils on rumen microbiota composition of transition dairy cows[J]. Journal of Dairy Science, 2017, 100(4): 2765-2783. DOI:10.3168/jds.2016-11994 |
| [47] |
PATRA A K, YU Z T. Effects of essential oils on methane production and fermentation by, and abundance and diversity of, rumen microbial populations[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2012, 78(12): 4271-4280. DOI:10.1128/AEM.00309-12 |
| [48] |
BENCHAAR C, CHAVES A V, FRASER G R, et al. Effects of essential oils and their components on in vitro rumen microbial fermentation[J]. Canadian Journal of Animal Science, 2007, 87(3): 413-419. DOI:10.4141/CJAS07012 |
| [49] |
JEYANATHAN J, MARTIN C, MORGAVI D P. The use of direct-fed microbials for mitigation of ruminant methane emissions:a review[J]. Animal, 2013, 8(2): 250-261. |
| [50] |
OZUTSUMI Y, TAJIMA K, TAKENAKA A, et al. The effect of protozoa on the composition of rumen bacteria in cattle using 16S rRNA gene clone libraries[J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2005, 69(3): 499-506. DOI:10.1271/bbb.69.499 |
| [51] |
CHO S J, CHO K M, SHIN E C, et al. 16S rDNA analysis of bacterial diversity in three fractions of cow rumen[J]. Journal of Microbiology and Biotechnology, 2006, 16(1): 92-101. |
| [52] |
STEWART C S, FLINT H J, BRYANT M P.The rumen bacteria[M]//The rumen microbial ecosystem.Dordrecht: Springer, 1997: 10-72.
|
| [53] |
MCINTOSH F M, WILLIAMS P, LOSA R, et al. Effects of essential oils on ruminal microorganisms and their protein metabolism[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(8): 5011-5014. DOI:10.1128/AEM.69.8.5011-5014.2003 |
| [54] |
BUSQUET M, CALSAMIGLIA S, FERRET A, et al. Plant extracts affect in vitro rumen microbial fermentation[J]. Journal of Dairy Science, 2006, 89(2): 761-771. DOI:10.3168/jds.S0022-0302(06)72137-3 |
| [55] |
CASTILLEJOS L, CALSAMIGLIA S, FERRET A. Effect of essential oil active compounds on rumen microbial fermentation and nutrient flow in in vitro systems[J]. Journal of Dairy Science, 2006, 89(7): 2649-2658. DOI:10.3168/jds.S0022-0302(06)72341-4 |
| [56] |
CAPELARI M, POWERS W. The effect of nitrate and monensin on in vitro ruminal fermentation[J]. Journal of Animal Science, 2017, 95(11): 5112-5123. DOI:10.2527/jas2017.1657 |
| [57] |
RUIZ R, ALBRECHT G L, TEDESCHI L O, et al. Effect of monensin on the performance and nitrogen utilization of lactating dairy cows consuming fresh forage[J]. Journal of Dairy Science, 2001, 84(7): 1717-1727. DOI:10.3168/jds.S0022-0302(01)74607-3 |
| [58] |
FONTY G, JOBLIN K, CHAVAROT M, et al. Establishment and development of ruminal hydrogenotrophs in methanogen-free lambs[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(20): 6391-6403. DOI:10.1128/AEM.00181-07 |
| [59] |
ZENED A, COMBES S, CAUQUIL L, et al. Microbial ecology of the rumen evaluated by 454 GS FLX pyrosequencing is affected by starch and oil supplementation of diets[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2012, 83(2): 504-514. |
| [60] |
张昌吉, 刘哲, 郝正里, 等. 含不同秸秆的全饲粮颗粒料对绵羊瘤胃代谢参数的影响[J]. 草业科学, 2008, 25(1): 82-86. |
| [61] |
MURPHY J J, KENNELLY J J. Effect of protein concentration and protein source on the degradability of dry matter and protein in situ[J]. Journal of Dairy Science, 1987, 70(9): 1841-1849. DOI:10.3168/jds.S0022-0302(87)80223-0 |