养猪生产中的各种不利因素常会引起猪只的应激反应，尤其在仔猪早期断奶阶段，断奶、饲粮转换、环境变化、病原性等因素会导致仔猪产生应激[1]，出现如腹泻、采食量减少、生长迟缓等问题，造成经济损失。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁成分，作为典型的内毒素，可导致仔猪出现抽搐、发烧、呕吐等症状，也可引起机体各组织的炎症反应，常被用来建立急性免疫应激模型[2-3]。Toll样受体(TLRs)和核苷酸结合寡聚域受体(NODs)是调节先天免疫反应的2个重要蛋白家族，其中Toll样受体4(TLR4)、核苷酸结合寡聚域受体1(NOD1)和核苷酸结合寡聚域受体2(NOD2)及其下游相关基因是炎症信号通路的重要成员。在我们前期以LPS刺激构建的组织(如肠道、肝脏)损伤模型的研究中，LPS刺激会导致机体组织中TLR4和NOD炎症信号通路关键基因的表达在短时间内显著上调，引发炎症反应，造成组织损伤[2-3]。但是，这些研究仅集中于单个时间点，并没有研究不同时间点的动态表达。脾脏是全身最大的周围淋巴器官，内含大量的免疫细胞，如巨噬细胞和淋巴细胞，参与着机体的非特异性免疫和特异性免疫[4]。本试验旨在研究LPS刺激后不同时间断奶仔猪脾脏炎症信号通路关键基因及炎症相关基因表达的变化，为缓解养猪生产中的应激问题提供新的思路。
1 材料与方法 1.1 试验设计选择42头、体重为(7.1±0.9) kg的杜×长×大断奶仔猪，按注射LPS之前(0 h)和注射LPS后不同时间点(1、2、4、8、12、24 h)随机分为7个处理，每个处理6头猪。各处理仔猪预饲14 d后，腹腔注射100 μg/kg BW的LPS，分别于注射LPS之前和注射LPS后不同时间点取样品待测。
1.2 样品采集血液样品于颈静脉采集，保存于5 mL乙二胺四乙酸(EDTA)管中置于冰上待测。采血后将仔猪麻醉屠宰，取脾脏样品置于冰上，将脾脏样品用冷的生理盐水冲洗后切成小块，立刻放置于液氮中速冻，然后转到-80 ℃冰箱保存待测。
1.3 试验材料LPS为大肠杆菌血清型055 : B5，Sigma公司提供；注射时将LPS溶解于生理盐水溶液中, 注射液中LPS含量为500 μg/mL，按0.2 mL/kg BW注射，即100 μg/kg BW。
1.4 饲养管理试验在武汉轻工大学猪营养与代谢实验室进行。猪舍温度25~27 ℃，教槽料饲喂，自由采食和饮水。
1.5 测定指标与方法 1.5.1 血细胞分类计数血细胞分类计数采用Siemens ADVIA®2120i全自动血液分析仪测定。
1.5.2 mRNA表达量测定测定的指标包括TLR4和NOD信号通路关键基因和炎症相关基因。引物序列参考Zhang等[2]和Wang等[5](表 1)。脾脏组织的RNA提取使用RNAiso Plus(#9108, TaKaRa)，提取完后用琼脂糖凝胶电泳验证RNA的完整性。根据PrimeScript® RT Reagent Kit with gDNA Eraser(#RR047A, TaKaRa)说明书的指导，进行基因组DNA去除和cDNA合成。Real-time PCR采用SYBR® Premix Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus) qPCR Kit(#RR420A, TaKaRa)。目的基因mRNA相对表达量的计算参照Livak等[6]的方法，内参基因为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，并通过归一化法，以相对于注射LPS之前处理的表达量表示。
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表 1 引物序列 Table 1 Primer sequences |
数据分析采用SPSS 22.0软件进行独立样本t检验，1、2、4、8、12、24 h分别与0 h比较，以P < 0.05表示差异显著。结果以平均值±标准误来表示。
2 结果 2.1 LPS刺激对断奶仔猪血细胞分类计数的影响由表 2可知，与注射LPS之前(0 h)相比，LPS刺激导致白细胞(1~4 h)、嗜中性粒细胞(1~4 h)、淋巴细胞(2~12 h)、单核细胞(2~24 h)、嗜酸性粒细胞(2~4 h)、嗜碱性粒细胞(4 h)、嗜中性粒细胞比例(2 h)、单核细胞比例(1~24 h)、红细胞分布宽度变异数(24 h)、血小板(12 h)、血小板容积比(12 h)显著降低(P < 0.05)；其中白细胞(12~24 h)、嗜中性粒细胞(8~24 h)、嗜酸性粒细胞(8~24 h)、嗜中性粒细胞比例(4~24 h)在后期显著上升(P < 0.05), 且高于正常水平。此外，LPS刺激会导致淋巴细胞比例(2 h)、嗜碱性粒细胞比例(2 h)、红细胞(2 h)、血红蛋白(2~4 h)、血小板平均体积(12 h)、血小板分布宽度(8~24 h)显著升高(P < 0.05)；其中淋巴细胞比例(8~24 h)、嗜碱性粒细胞比例(8、24 h)显著降低(P < 0.05), 且低于正常水平。
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表 2 LPS刺激对断奶仔猪血细胞分类计数的影响 Table 2 Effects of LPS challenge on blood cell differential counts of weaned piglets |
由表 3可知，与注射LPS之前(0 h)相比，LPS刺激导致TLR4(8~12 h)、骨髓分化因子88(MyD88)(1~12 h)、白介素受体相关激酶1(IRAK1)(4~8 h)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)(1~4 h)、NOD1(2~12 h)、NOD2(1~8 h)、受体互作蛋白激酶2(RIPK2)(1~12 h)、核因子-κB(NF-κB)(1~4 h)mRNA表达量显著上调(P < 0.05)。这些基因的mRNA表达量在2~8 h达到峰值，8~24 h逐渐恢复至正常水平或略低于正常水平。
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表 3 LPS刺激对断奶仔猪脾脏炎症信号通路关键基因及炎症相关基因的mRNA表达量的影响 Table 3 Effects of LPS challenge on mRNA expression of key genes of inflammatory signaling pathway and inflammatory related genes in spleen of weaned piglets |
与注射LPS之前(0 h)相比，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(1~4 h)、白细胞介素-1β(IL-1β)(1~12 h)、IL-6(1~4 h)、环氧合酶2(COX2)(1~12 h)、热休克蛋白70(HSP70)(2~4 h)mRNA表达量在LPS刺激后也显著升高(P < 0.05)。其中，TNF-α、IL-1β、COX2 mRNA表达量在1 h达到峰值，IL-6 mRNA表达量在2 h达到峰值，HSP70 mRNA表达量在4 h达到峰值，8~24 h均逐渐恢复至正常水平或略低于正常水平。
3 讨论脾脏在机体免疫-神经-内分泌网络中扮演着重要的角色，并且在滤血、造血和储血方面发挥着作用[4]。脾脏与机体脏器的功能情况密切相关，在一些疾病(如肝炎病毒感染、肿瘤以及炎症性疾病等)的发生和发展过程中起到了重要作用[7]。有研究表明，在抗感染过程中脾脏免疫细胞的活化和炎症因子的释放可导致机体严重的损伤[4]。因此，研究病理状况下脾脏炎症相关因子的变化规律对于进一步了解脾脏在机体不同状态下功能的变化具有重要意义。
血细胞分类计数主要包括白细胞、红细胞和血小板这3类计数，该指标与机体的生理状况密切相关，可作为疾病诊断和治疗的重要参考指标[8]。细菌性或病毒性感染都可引起血细胞分类计数的变化[8]。本试验中，LPS刺激导致部分血细胞分类计数发生了显著的变化。与本试验结果一致，我们前期研究也发现LPS刺激4、24 h影响了白细胞、红细胞和血小板计数，且部分指标(如白细胞、嗜酸性粒细胞)在4、24 h时变化的趋势不一[9]。研究发现，白细胞总数及其分类计数可以指示机体的炎症状态[9]。红细胞除了是运输氧的主要媒介，也与天然免疫和一些特异性免疫相关[10]。此外，血小板在炎症和免疫方面同样具有重要的作用，血液中血小板的减少会增加机体受感染的风险[11]。由于脾脏可清除血液中的异物和衰老的血细胞，分泌激素(如白细胞生成素、红细胞生成素、血小板生成素等)调节骨髓造血，还可调节机体的细胞免疫、体液免疫以及细胞吞噬功能[12]，因此我们猜测LPS可能造成机体的炎症反应，影响组织(如脾脏)的正常功能。
TLRs是一类跨膜的天然免疫受体，其中TLR4是与免疫和炎症密切相关的重要成员[3]。TLR4可以将信号从细胞外传递到细胞内，触发细胞内MyD88、IRAK1、TRAF6等信号分子，导致NF-κB活化入核，促进炎性细胞因子的表达与释放[3]。与跨膜的TLRs不同，NODs存在于细胞内，NODl和NOD2是该家族中最具有代表性的2个成员，可识别细菌的肽聚糖成分[13]。NOD1和NOD2可以通过自身寡聚化来招募和激活下游分子RIPK2，同样可以激活NF-κB[13]。正常情况下，TLR4和NOD信号通路的激活有利于提高机体的免疫力，进而抵抗感染和杀灭病原体[14]。但是，其过度激活会带来负面的影响，严重者会引起疾病的产生如脓毒症、类风湿性关节炎、感染性休克等[14]。
本试验中，LPS刺激导致脾脏TLR4和NOD炎症信号通路关键基因mRNA表达量上升，在后期这些基因逐渐恢复至正常水平或略低于正常水平。这与我们前期关于单个时间点(4、24 h)LPS刺激对一些组织(如肌肉、肝脏、肠道等)的影响的研究结果相吻合[3, 13, 15]。TLR4是介导LPS应答的主要受体[3]。此外，虽然NOD1和NOD2是细菌的肽聚糖成分的特异性识别受体，但是有研究发现LPS可以通过影响TLR4和TNF-α，进而激活NOD信号通路[16]。因此，LPS引起机体的炎症反应可能与其介导炎症信号通路的激活密切相关。
炎性细胞因子(如TNF-α、IL-1β和IL-6)是大多数炎性病症中的重要介质，当它们过表达时，会使机体处于炎症状态，而长期的炎症则会诱发炎症性疾病[17]。COX2是催化花生四烯酸合成前列腺素的关键酶，其过量表达亦与炎症密切相关[18]。HSP70表达量在正常细胞中较低，但是在应激状态下显著升高[13]。本研究结果表明，LPS刺激会提高这些炎症相关基因的mRNA表达量，并促使其在短时间内达到峰值，随后逐渐下降恢复。本试验中炎性细胞因子的结果与大鼠模型上得出的结果相似[19]。这些炎症相关基因的mRNA表达量集中在1~2 h达到峰值，而TLR4和NOD信号通路关键基因则多集中在2~4 h达到峰值。Rosenstiel等[20]研究发现TNF-α可以诱导肠上皮细胞NOD2 mRNA表达上调。因此，我们猜测LPS刺激后可能首先导致炎性细胞因子的大量合成，随后促使TLR4和NOD炎症信号通路关键基因mRNA表达上调。
有趣的是，COX2虽然在各系统炎症中全程均有表达，但是在炎症的不同阶段可产生不同的前列腺素以发挥不同的作用[21]。研究发现，COX2在炎症发生期通过合成前列腺素E2(PGE2)发挥促炎作用，而在炎症消退期以合成前列腺素D2(PGD2)、15-脱氧前列腺素J2(15ΔPGJ2)发挥抗炎作用[21]。除此之外，有研究证明高水平的HSP70可降低炎症反应[13]。HSP70家族成员能降低LPS刺激所致的炎性细胞因子和炎性介质的合成与释放[22]，还可以阻碍NF-κB的激活[23]。综上，本试验中，在前期，LPS刺激一方面促使炎性介质表达上调造成机体的炎症反应，另一方面由于机体的负反馈也诱导了抗炎介质(HSP70)的表达。在后期，可能由于机体自身调节(比如调节COX2和HSP70)，LPS刺激的影响逐渐被消除。
4 结论LPS刺激可引起断奶仔猪的血细胞分类计数发生变化，并且在短时间内提高脾脏TLR4和NOD炎症信号通路关键基因和炎症相关基因的mRNA表达量。这些基因在LPS刺激前期处于较高水平，而在后期逐渐回归到正常水平或略低于正常水平。
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