2. 宁夏大学农学院, 银川 750021
2. College of Agriculture, Ningxia University, Yinchuan 750021, China
乳汁是哺乳动物哺育后代的特殊产物,是新生哺乳动物营养最主要也是最佳的来源。尽管乳汁对新生哺乳动物的存活和早期发育有着重要意义,且国内外也对其进行了大量研究,但每个哺乳阶段的乳汁中各种组分尚未完全确定,许多小分子物质的功能也未得到充分阐明。总的来说,乳汁主要成分有蛋白质、脂质、糖类、维生素、矿物质、免疫细胞和生物活性因子等,但乳汁成分容易受许多因素的影响,如遗传、地理来源、环境、哺乳期和母体营养状况等[1-2]。初乳一般为动物分娩后3 d内所分泌的乳汁,其中所含的营养素专为新生哺乳动物量身打造,提供它们在生命第1阶段所有必需的营养。此外,初乳对于新生哺乳动物的被动免疫尤为重要,母体产生的免疫球蛋白、免疫细胞以及具有免疫活性的小分子物质可以直接传递到新生哺乳动物体内,并在很大程度上支持它们脆弱的身体对抗外源感染[3]。不止如此,初乳中的高浓度生长因子和胰岛素调控新生哺乳动物胃肠道的发育和成熟[4];初乳中还富含上千种微生物,这些菌群是在新生哺乳动物肠道中定植的第1批细菌,对新生哺乳动物的健康有长期的影响[5-6];同样重要的还有母源多能干细胞,在新生哺乳动物许多组织中能够进行整合并分化成成熟细胞[7];另外,初乳中还含有激素、细胞因子、趋化因子等,与新生哺乳动物身体组织的微观解剖结构、免疫系统和大脑的发育和成熟密切相关[3, 8-11]。动物分娩后3~14 d内有一段乳汁组分变化巨大的过渡时期,在14 d后乳汁成分趋于稳定,这2个时期的乳汁分别被称为过渡乳和成熟乳。过渡乳具有初乳的某些特征,但同时泌乳量逐渐提高并发生了组分变化。过渡时期乳汁酪蛋白和免疫球蛋白含量逐渐下降,α-乳清蛋白和β-乳球蛋白含量逐渐上升[2],总蛋白质含量下降,脂肪和糖类含量上升,乳汁中各种生物活性物质如酶的活性和激素水平也逐渐降低[3]。成熟乳组分较为稳定,各类营养素比例均衡[8],并且每个母体提供的各种营养素最适合于其自身产下的新生哺乳动物直接吸收利用[3, 9, 12]。
代谢组学(metabolomics)作为系统生物学的重要组成部分,旨在通过分析细胞、生物体液及组织的代谢特征来探究相关机制,可将代谢物与表型直接关联,是非常有前景的组学工具。目前,应用最多的代谢组学技术主要有气相色谱-质谱联用(GC-MS)、高效液相色谱-质谱联用(LC-MS)和核磁共振(NMR)等。
本文重点综述了近年来基于代谢组学技术研究人类乳汁(HM)和牛乳汁(BM)中小分子代谢物(氨基酸、糖类和脂质等)和影响初乳与成熟乳之间某些低丰度小分子差异代谢物的因素。
1 基于代谢组学对HM的研究最近几年基于代谢组学对于HM的研究已显示了绝大部分常量营养素的变化[12-14],但对于微量营养素的关注度还远远不够。这些研究中,一部分在探究早产乳汁和足月乳汁之间的差异,另一些团队的目的则是优化人工配方乳,而研究结果无不显示HM代谢组可根据新生儿的需要而改变。Spevacek等[12]在研究早产HM与足月HM代谢组差异时选择了3个时间点,证实在人初乳(HC)、人过渡乳(HTM)和人成熟乳(HMM)代谢组中,早产HM与足月HM具有不同的代谢特征。该团队筛选并鉴定出69种差异代谢物,包括23种氨基酸、15种糖、11种与能量有关的代谢物、10种脂肪酸、3种核苷酸、2种维生素和5种与细菌相关的代谢物。Sundekilde等[13]研究发现,HM代谢组可根据胎龄、哺乳期或接触外源性物质的变化而变化。
1.1 氨基酸几乎所有已发表的相关文章都提到,乳汁中氨基酸在所有泌乳阶段都表现出巨大的差异,尤其是在初乳中。一般来说,随着乳汁的逐渐成熟,HM中的大部分游离氨基酸含量稳定下降[12]。与成熟乳相比,初乳中缬氨酸、亮氨酸含量更高;而成熟乳中谷氨酸含量较初乳中更多[13],这与先前的研究[15-16]结论相符。有趣的是,早产HM中支链氨基酸(BCAAs)含量随泌乳时间的延长而增加,这与足月HM的变化截然相反[17]。很多研究表明BCAAs在脑发育、免疫系统构成、肝再生和葡萄糖代谢等过程中起到关键作用[18-21]。由此可以大胆推测,早产新生儿由于在母亲体内发育尚未完全成熟,出生后需要大量BCAAs支撑其能量需求及各个重要器官的发育,因而在早产初乳中BCAAs含量远远高于足月初乳而后随泌乳时间的延长而逐渐降低。HM中还存在高含量丙氨酸直接参与能量代谢,还能根据新生儿需要,部分可以转化为谷氨酸促进脑发育,证明丙氨酸是HM中基础氨基酸[12, 16]。甲硫氨酸参与肉毒碱的合成,而肉毒碱载体系统是将活化的脂肪酸转运出入线粒体的基础[22-23]。此外,甲硫氨酸还显示出对心血管的保护作用,并改善脂质代谢。在足月HM中,丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸和缬氨酸含量随泌乳时间的延长而增加,早产HM中的丙氨酸含量较足月HM具有更高含量,亦呈增长趋势。赖氨酸和异亮氨酸含量在足月HM中随泌乳时间的延长而下降,而在早产HM中保持不变[12]。
1.2 糖类人乳低聚糖(HMOs)是结构多样的非结合聚糖家族,在HM中是第3位丰富的成分。最初HMOs被发现为益生元“双歧因子”,因为其作为肠道微生物群的代谢底物而影响肠道微生态环境,对母乳喂养的新生儿具有不可取代的作用。新的研究表明,HMOs是抗黏附抗菌剂,可作为可溶性诱饵受体,防止病原体附着于新生儿黏膜表面,降低细菌、病毒和原虫感染的风险[24]。此外,HMOs可调节上皮细胞和免疫细胞反应,减少过多的黏膜白细胞的浸润和活化,能降低发生坏死性小肠结肠炎(NEC)的风险,并为新生儿提供唾液酸作为脑发育和认知的潜在必需营养素[25]。
HM代谢组中糖组分的差异与母体的表型有关,母体内葡糖基转移酶家族酶的分泌血型依赖于基因的表达,如α-1-2-岩藻糖转移酶(FUT2,由Se基因编码,决定分泌或非分泌状态)和α-1-3-4-岩藻糖转移酶(FUT3,由Le基因编码,表达Lewis血型的阳性或阴性)[24]。
随着乳汁的成熟,HMOs及其组件逐渐减少[13, 26]。相比于足月HM,早产HM中总HMOs和唾液酸含量较高[13, 27],且组成HMOs的其他糖基差异也很大[13, 28]。在足月HM中,乳糖、3-岩藻糖基乳糖(3-fucosyllactose, 3’-FL)和葡萄糖的含量随乳汁成熟而升高,但2-岩藻糖基乳糖(2-fucosyllactose, 2’-FL)、3-半乳糖乳糖(3-galactosillactose, 3’-GSL)、3-唾液酸乳糖(3-sialyllactose, 3’-SL)、6-唾液酸乳糖(6-sialyllactose, 6’-SL)、乳糖-N-岩藻戊糖Ⅲ(lacto-N-fucopentaose Ⅲ,LNFP Ⅲ)和岩藻糖的含量变化相反,虽然LNFP Ⅲ和乳酸-N-新四糖(lacto-N-neotetraose,LNnT)在早产HC中比在足月HC中含量更低,但LNFP Ⅲ含量在早产HM中随哺乳时间的延长没有明显变化,因此在28 d时含量相近。乳酸-N-四糖(lacto-N-tetraose,LNT)、乳酸-N-二岩藻糖基六糖Ⅰ(lacto-N-difucohexaose Ⅰ,LNDFH Ⅰ)、3’-SL、6’-SL、岩藻糖、N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine)和N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic)在早产HM中含量更高[24]。不论是早产HM还是足月HM,在泌乳后期(26周前后)差异并不显著,表明HC在历经巨大的变化后,随着乳汁成熟,其糖组分趋于稳定且相似[13]。
1.3 脂肪酸乳脂是乳汁提供的主要能量来源,但其对提供必需脂肪酸、脂溶性维生素和特定成分的生物活性物质也很重要[29]。脂肪酸是乳汁中差异最大的营养物质,年龄、地域因素、胎次、孕龄、体质量指数(BMI)、饮食、哺乳期、妊娠期糖尿病(GDM)、每日母乳喂养的量和持续时间都是影响HM脂质含量的因素[30-31]。HC和HMM脂质组分占比分别为1.9%~2.3%和3.5%~4.5%,其中占比最多的是甘油三酯。棕榈酸、油酸、亚油酸和α-亚麻酸也是检测到含量较多的脂肪酸[30, 32]。棕榈酸主要集中在甘油三酯的2位,油酸主要集中在甘油三酯的1位和3位[31]。
最新的研究表明,地域因素和年龄对脂肪酸差异的影响更大[30]。在同一项研究中,作者证实了地域因素主要影响饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸的特征,并提出是饮食差异造成的影响。Azulay等[33]在研究中评估了GDM对HC的影响,脂肪酸组成的分析显示,与非GDM女性相比,GDM女性初乳中4种必需的ω-6多不饱和脂肪酸:γ-亚麻酸、二十碳三烯酸、花生四烯酸和二十二碳四烯酸的含量显著更高。ω-6多不饱和脂肪酸可能作为乳汁强化的生物活性物质并支持新生儿神经发育,还可以构成新的代谢机制来补偿胰岛素对GDM母亲所产新生儿的损伤。
2 基于代谢组学对BM的研究BM是非常有营养价值的食品,对BM的研究具有较大的生产实际意义,BM代谢物在食品工业中亦有着广泛的应用,并能作为乳腺炎感染的生物标志物[34-35]。Sundekilde等[35-36]指出,基于代谢组学检测BM代谢物有助于探究BM的生化特性,可在不同研究中用于寻找关键生物标志物。在早期,Boudonck等[37]使用基于质谱的代谢组学方法研究了BM代谢物组成,并鉴定出223种不同的代谢物。由于早期代谢物数据库不够完善,理论上BM中代谢物应该存在更多。虽然BM中大部分代谢物产生的生物过程尚不完全明确,但BM中存在的代谢物主要为乳腺细胞所产出,因此一些关于奶牛及其乳腺功能的研究中早已报道过某些BM代谢物,并建立了不同代谢状态的BM代谢组。BM代谢物与重要奶牛疾病的相关性如表 1所示。Xu等[38]最新的代谢组学数据揭示了奶牛泌乳早期能量平衡与乳汁间的联系,以是否进行干奶程序为条件对比BM代谢物差异。该团队鉴定并筛选了52种差异代谢物,通过多元统计分析筛选出5个最具影响力的代谢物(甘氨酸、胆碱、肉毒碱、瓜氨酸和脯氨酸)。Lu等[39]使用代谢组学方法研究了奶牛干奶期和能量平衡对过渡期奶牛乳汁代谢物的影响,结果显示半乳糖-1-磷酸与严重的能量负平衡有关;Sundekilde等[36]发现BM体细胞计数与BM成分变化相关,并确定了乙酸、丁酸、乳酸等几种生物标志物。基于代谢组学对BM的研究最终都只有一个目的:为了得到品质更优的BM。以此扩展出更多的研究方向,如研究由不同营养物质组成的饲粮对BM组分的影响,优化饲粮配比[40];研究某疾病对BM的影响,并寻找生物标志物,在此基础上寻找防治疾病的思路[41-42];对比不同牛种产出的BM品质,结合基因型寻找某些基因与乳汁表型的联系,从而筛选优质牛种[43]等。目前,BM代谢物数据库尚未完善,且部分代谢物在BM中的意义尚不明确,缺乏对某些小分子代谢物生物学功能的深入研究。
有研究比较了牛血浆与BM代谢物,发现血浆与乳汁中代谢物成分几乎没有相关性,并证明BM是一种独特的代谢区,其代谢物组成在正常情况下基本不受血浆成分影响,但在哺乳后期或乳腺炎症期间,代谢物也可能通过脱细胞途径从血液或组织间液进入乳汁[44-45]。Klein等[46]比较了泌乳早期与晚期各类代谢物丰度,发现丙酮和β-羟丁酸含量在奶牛泌乳早期个体间差异巨大,表明这一阶段奶牛个体的能量状态差异显著,这与先前的研究相互印证。Yang等[47]比较了中国荷斯坦奶牛、娟姗奶牛、牦牛、水牛、山羊、骆驼和马的乳汁中代谢物特征,发现胆碱和琥珀酸在荷斯坦牛奶中独特存在,而代谢通路分析显示娟姗奶牛、水牛、牦牛和山羊乳汁中均存在甘油磷酸代谢和支链氨基酸的生物合成途径;骆驼和马乳汁中存在不饱和脂肪酸的生物合成途径,这项研究有助于评估牛奶特性和检测牛奶掺假。到目前为止,大多数的乳汁代谢组学研究都集中在改善BM营养成分以提高乳制品质量上,而其中涉及的生理和代谢机制还尚未得到充分的阐释。
3 基于代谢组学对其他哺乳动物乳汁的研究有研究使用代谢组学来对比大熊猫乳汁在3个泌乳阶段的差异,发现第1阶段的乳汁不能区分开,但从第2阶段开始isoglobotriose(熊类乳汁中一种主要的低聚糖)成分出现了明显的差异。还分析了用于喂养大熊猫幼仔的3种人造奶配方,发现它们与天然熊猫奶的组分显著不同[48]。
有研究表明,驴奶富含溶菌酶,且与配方奶相比驴奶中代谢物与人乳中代谢物更为接近,但是这种乳汁却不太容易获取[49]。近几年由于山羊乳的市场良好,对山羊乳汁的代谢组研究也逐渐增多。关于季节性体重下降对山羊乳腺组织和乳清代谢组影响的研究揭示,乳清代谢组比乳腺组织代谢组种类更多,但山羊的品种间差异不大[50]。Caboni等[51]通过将山羊乳代谢组与基因位点构建相关性模型进行分析揭示山羊不同αS1-酪蛋白基因型的乳代谢物差异。该团队在另一项研究中还比较了山羊与绵羊的乳汁中代谢物差异,结果显示绵羊奶中的阿拉伯糖醇、柠檬酸、α-酮戊二酸、甘油酸、肌醇和甘氨酸含量更高而山羊奶中甘露糖-6-磷酸、异麦芽酮糖、缬氨酸、焦谷氨酸、亮氨酸和岩藻糖含量更高[52]。为了明确山羊乳的独特性,Scano等[53]比较了山羊乳汁与BM代谢组来寻找山羊乳中特殊代谢物,发现缬氨酸和甘氨酸在山羊乳中是特异性的,塔罗糖和苹果酸在牛奶中是特异性的,羟基戊二酸在巴氏灭菌的乳品中是特异性的。这些代谢物有潜力作为商品化羊乳制品的鉴定标志物,防止商业欺诈。这些研究均具有一定的借鉴价值,比如在对BM的代谢组学研究中同样可以与乳腺组织代谢组进行比较,将血浆、乳腺和乳汁的代谢组学关系进行深度剖析,以此寻找新的研究思路。
虽然Scano等[54]在最新的报道中总结了近年来基于NMR的代谢组学手段检测乳汁及乳制品得到的代谢物并进行分类整理,并制作了韦恩图进行比对,但代谢物数量还有待完善。
4 小结目前,基于代谢组学的研究非常热门,但在对哺乳动物乳汁的研究中显得不够丰富。HM的代谢组相对比较清晰,影响HM组分的因素更多为遗传、地理来源、饮食和健康状况等,未来的研究可能会证明更多的因素与此相关。此外,对HM的研究目的多为对比早产乳和足月乳的差异代谢物,缺少HM与BM代谢组的比较,在优化人工配方奶时,可以通过对比HM与BM来添加某些关键成分。对于HM的研究应更多地结合新生儿血浆或肠内容物代谢组,来深入探究乳汁中的生理作用机制。在对BM的早期研究中,有一些关于小分子代谢物的研究,但缺少宏观归纳或系统比较性研究,因此对于BM或其他哺乳动物乳汁的研究也可以更多地探究代谢物生理性变化来健全乳汁小分子代谢物的功能,并且对组分进行分类,使代谢组更为清晰。不仅如此,目前新兴的组学技术还包括微生物组学、金属组学,将这些组学得到的信息构建相关性模型,可以拓宽研究的视野,例如乳汁代谢物中可以检测到一些微生物的代谢产物,若将其与微生物组学关联起来,能否得到一些重大的发现?我们期待看到这方面的报道。
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