花生四烯酸(AA)是一种长链多不饱和脂肪酸，存在于血液、肌肉、肝脏和其他组织器官中，在动物机体炎症及免疫反应中起重要调节作用[1]。AA在机体正常状态下的浓度很低，当机体感染病菌或产生炎症时，细胞膜磷脂在磷脂酶A2(PLA2)催化作用下会大量产生AA。而AA可以在环氧合酶(COX)的催化下，转化为前列腺素(PG)，在脂氧化酶(LOX)的催化下，则可以转化为白细胞三烯(LT)[2]。其中PGE2能够调节巨噬细胞、淋巴细胞和自然杀伤细胞的活性，与机体炎症反应有着密切的关系[3]。而LTB4具有十分强劲的白细胞趋化性，能够诱导活化抑制性T淋巴细胞，从而增强自然杀伤细胞活性，是机体免疫反应的重要介质[4]。Dirix等[5]认为，AA代谢途径是调节机体免疫反应中一条重要的核心途径。
壳聚糖(CTS)是由甲壳素脱乙酰基后生成的一种碱性多糖，具备可生物降解性、可食用性及生物相容性等优点，主要来自海生动物如虾、蟹等的外壳。壳聚糖作为一种天然、无毒的多糖类物质，已有学者对其在动物生产中的应用效果进行了研究，结果表明壳聚糖不仅可以用作动物的生长促进剂，也可以作为免疫调节剂来影响动物的免疫功能[6-9]。已有研究表明，在体外用壳聚糖处理小鼠巨噬细胞，能够提高培养液中胞浆型磷脂酶A2(cPLA2)的活性和AA的浓度，并且这种作用与剂量和时间呈线性增加效应[10]。李慧英等[11]研究表明，壳聚糖不仅能够提高肉仔鸡血清中AA的浓度，也能够提高肠道组织中PLA2、COX-2和5-LOX的活性及其基因表达量。李俊良等[12]研究表明，在体外条件下用壳聚糖处理断奶仔猪外周血淋巴细胞(PBLs)可以增加培养液中AA代谢途径主要介质PGE2和LTB4的浓度，提高关键控制酶cPLA2、COX-2和5-LOX的活性及其基因表达量，这对缓解仔猪因断奶引起的应激有重要的意义。目前，关于壳聚糖对AA免疫调节途径的影响研究主要集中在禽类和单胃动物上，在反刍动物上尚未见报道。因此，本试验拟研究饲粮中添加壳聚糖对奶牛AA免疫调节途径相关指标的影响，这不仅对揭示壳聚糖对奶牛免疫功能的影响机制具有重要的理论学术价值，同时对于科学研发和应用壳聚糖作为奶牛绿色饲料添加剂具有重大的生产实践意义。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验所用荷斯坦奶牛全部由内蒙古赛科星繁育生物技术股份有限公司提供；壳聚糖购自海得贝海洋生物工程有限公司，分子质量为70 000 u，黏度系数为80 cP，脱乙酰度为85.38%。酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒均购自博尔迪生物科技有限公司。奶牛淋巴细胞分离液(TBD)、RNAiso Plus(No.9109)、PrimeScriptTM RT reagent Kit(No.DRR036A)、SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ(No.RR820A)、Buffer(No.D604)、DNA Marker DL 1000(No.3591A)、DNA Marker DL 2000(No.D510A)、ddH2O、核酸染料、琼脂糖、氯仿、乙酸、异丙醇和无水乙醇均购自宝生物工程有限公司。
1.2 试验设计试验选择40头处于泌乳中期的健康荷斯坦奶牛，泌乳期为(186.1±30.0) d，体重为(556±50) kg，产奶量为(22.65±1.19) kg/d。按照产奶量、分娩期、泌乳期和胎次等相近的原则，将奶牛随机分为5个组，每组8头牛。对照组奶牛饲喂基础饲粮(不添加壳聚糖)，试验组奶牛分别饲喂在基础饲粮中添加500、1 000、1 500和2 000 mg/kg(风干基础)壳聚糖的饲粮。基础饲粮组成及营养水平见表 1。饲养试验持续60 d，分为试验前期(第1~30天)和后期(第31~60天)2个阶段，每个阶段30 d。奶牛每天上料2次，挤奶3次，饲养试验期间奶牛自由采食、自由饮水。在整个试验过程中，各组牛舍环境与管理保持一致。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
在试验期第30和60天，早晨饲喂前对奶牛进行尾静脉无菌采血30 mL，其中10 mL血样在4 ℃、3 000 r/min离心10 min，取血清分装至200 μL安培管中，保存至-20 ℃直到分析。另外20 mL血样收集在5 mL的抗凝管中，在常温条件下进行PBLs的分离与收集。
1.4 测定指标与方法 1.4.1 血清中指标的测定血清中AA、PGE2和LTB4的浓度以及cPLA2、COX-2和5-LOX的活性均用ELISA试剂盒测定，测定结果用酶标仪(SynergyH4，Bio-Tek，日本)进行读数后记录，通过绘制标准曲线计算得出各因子的浓度或活性。
1.4.2 奶牛PBLs的分离与采集PBLs的分离严格按照奶牛淋巴细胞分离液说明书进行，具体过程如下：1)将采集后的血液加入试剂盒中的稀释液，按照1 : 1比例进行稀释；2)另取5 mL玻璃离心管，加入2 mL淋巴细胞分离液，再缓慢加入2.5 mL稀释后的血液，使血液平铺于淋巴细胞分离液上方；3)2 000 r/min离心20 min；4)小心吸取离心后溶液中中间白色絮状的一层至另一个5 mL离心管中；5)加入3 mL磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，1 500 r/min离心5 min，该步骤重复进行2次；6)将所得的淋巴细胞转移至1.5 mL冻存管中，每管加入1 mL RNAiso Plus保存至-80 ℃以待分析。
1.4.3 PBLs中RNA的提取与cDNA的合成RNA的提取采用Trizol法，严格进行无菌无酶操作，且全程在冰上进行。RNA反转录为cDNA时根据PrimeScriptTM RT reagent Kit试剂盒说明书进行，反应体系总体积为10 μL，具体如下：其中2 μL的5×PrimeScript RT Master Mix，500 ng/μL的总RNA，无酶水补加至10 μL。其反应条件为：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。
1.4.4 引物设计及合成本试验中以β-肌动蛋白(β-actin)为内参基因，目的基因引物由Primer 5和Olige 6软件自行设计后，再由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列见表 2。
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表 2 AA免疫调节途径相关基因的引物序列 Table 2 Primer sequences of genes related with AA immune regulating pathway |
实时荧光定量PCR在实时定量PCR仪上进行，根据SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒说明书进行操作，实时荧光定量PCR体系总体积为20 μL，其中2 μL的模板cDNA，10 μL的SYBR Premix Ex TaqTM(2×)，0.4 μL的PCR Forward Primer(10 μmol/L)，0.4 μL的PCR Reverse Primer(10 μmol/L)，7.2 μL的无酶水。定量程序为：预变性，95 ℃ 30 s；变性，95 ℃ 5 s；退火，60 ℃ 30 s；延伸，72 ℃ 30 s，共计40个循环；延伸，72 ℃ 10 min。通过绘制熔解曲线得到循环数后，采用2-ΔΔCt法进行目的基因表达量的计算。
1.5 统计分析试验数据经过Excel 2007整理后，由SAS 9.0软件建立的一般线性模型程序进行回归分析。壳聚糖添加水平为计量免疫途径中各指标的影响因素，采用一元线性回归和多项式回归分析，评估二者间的一元线性和二次曲线效应。P < 0.05代表回归关系显著；P < 0.01代表回归关系极显著；0.05≤P < 0.10代表回归关系趋于显著。
2 结果与分析 2.1 壳聚糖对奶牛血清中AA、PGE2和LTB4浓度的影响壳聚糖对奶牛血清中AA、PGE2和LTB4浓度的影响见表 3。在试验后期(第60天)，随着壳聚糖添加水平的升高，血清中AA浓度升高，并呈显著的一次线性(P < 0.05)和趋于显著的二次曲线(0.05≤P < 0.10)升高效应；PGE2浓度呈显著的二次曲线升高效应(P < 0.05)；LTB4浓度呈显著的一次线性(P < 0.05)和极显著的二次曲线升高效应(P < 0.01)。上述所有指标在1 500 mg/kg壳聚糖添加组表现出最高值，而壳聚糖的添加水平增加到2 000 mg/kg时，所有指标有不同程度的降低，这表明上述指标与壳聚糖的添加水平之间存在二次剂量依赖关系。
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表 3 壳聚糖对奶牛血清中AA、PGE2和LTB4浓度的影响 Table 3 Effects of chitosan on concentrations of AA, PGE2 and LTB4 in serum of dairy cows |
壳聚糖对奶牛血清中cPLA2、COX-2和5-LOX活性的影响见表 4。在试验前期(第30天)，随着壳聚糖添加水平的升高，血清中cPLA2的活性呈显著的一次线性(P < 0.05)和趋于显著的二次曲线(0.05≤P < 0.10)升高效应。在试验后期(第60天)，随着壳聚糖添加水平的升高，血清中cPLA2活性呈显著的二次曲线升高效应(P < 0.05)，COX-2活性呈现趋于显著的一次线性(0.05≤P < 0.10)和显著的二次曲线(P < 0.05)升高效应，5-LOX活性呈显著的一次线性(P < 0.05)和趋于显著的二次曲线(0.05≤P < 0.10)升高效应。试验后期(第60天)各指标均在1 500 mg/kg壳聚糖添加组表现出最高值，也表明上述指标与壳聚糖的添加水平之间存在二次剂量依赖关系。
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表 4 壳聚糖对奶牛血清中cPLA2、COX-2和5-LOX活性的影响 Table 4 Effects of chitosan on activities of cPLA2, COX-2 and 5-LOX in serum of dairy cows |
壳聚糖对奶牛PBLs中cPLA2、COX-2和5-LOX基因表达量的影响见表 5。在试验前期(第30天)，随着壳聚糖添加水平的升高，PBLs中cPLA2基因表达量呈极显著的线性(P < 0.01)和二次曲线(P < 0.01)升高效应，5-LOX基因表达量呈显著的二次曲线(P < 0.05)和趋于显著的线性(0.05≤P < 0.10)升高效应。在试验后期(第60天)，随着壳聚糖添加水平的升高，PBLs中cPLA2基因表达量呈显著的线性(P < 0.05)和趋于显著的二次曲线(0.05≤P < 0.10)升高效应，COX-2基因表达量呈显著的二次曲线升高效应(P < 0.05)，5-LOX基因表达量呈极显著的线性(P < 0.01)和显著的二次曲线(P < 0.05)升高效应。上述指标在1 000或1 500 mg/kg壳聚糖添加组表现出最高值，而壳聚糖的添加水平增加到2 000 mg/kg后，所用指标均有不同程度的降低，这表明上述指标与壳聚糖的添加水平存在二次剂量依赖关系。
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表 5 壳聚糖对奶牛PBLs中cPLA2、COX-2和5-LOX基因表达量的影响 Table 5 Effects of chitosan on expression levels of cPLA2, COX-2 and 5-LOX genes in PBLs of dairy cows |
AA是体内分布最为广泛的多不饱和脂肪酸之一，是由细胞膜磷脂作为底物，在PLA2催化作用下产生，在机体的营养物质代谢、白细胞功能调控和血小板激活中发挥着重要的作用[13]。PLA2是4种磷脂酶中的一种，由成熟的巨噬细胞、单核细胞、T淋巴细胞和肝细胞等分泌，既可以分解脂类物质，也可以参与炎症及急性疾病过程的调控，在机体的免疫应答反应中发挥着重要的作用[14]。当机体发生疾病或者创伤时，PLA2可起到促进血液凝固，调节机体内环境稳态及代谢的作用。PLA2可分为3种亚型，其中cPLA2主要作用于细胞内，需要Ca2+参与，在机体内生物性能最稳定，分布最为广泛。AA在机体正常情况下的浓度很低，当机体感染病菌或产生炎症时，细胞膜磷脂在PLA2催化作用下会大量产生AA。Maruvada等[15]研究指出，病原体感染时会引起体内白细胞cPLA2活性的改变，增加机体内AA的浓度，这一过程在由微生物感染引起的炎症反应中起重要的作用。Bianco等[10]研究表明，壳聚糖可以提高小鼠巨噬细胞中AA的浓度和PLA2的活性。李慧英等[11]以肉仔鸡为研究对象，结果表明壳聚糖增加了肉仔鸡小肠中cPLA2基因的表达量，并且增加了血清中cPLA2的活性和AA的浓度。此外，李俊良等[12]以断奶仔猪为研究对象也得到了同样的结果。在本试验中，随着壳聚糖添加水平的升高，奶牛血清中AA的浓度和cPLA2的活性及其基因的表达量也随之增加，与上述前人的研究结果相一致，表明壳聚糖提高奶牛血清中AA的浓度是通过提高cPLA2基因的表达及其活性来实现的。
AA在机体中COX催化作用下可以形成PGE2[16]，在LOX催化作用下可以形成LTB4、氢过氧化二十碳四烯酸和脂氧素等。PGE2是一种重要的细胞生长和调节因子，能够直接或间接地调节T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞的活性，同时具有免疫抑制和抗炎作用。LTB4是白细胞趋化因子，可以有效激活T淋巴细胞并促进骨髓源性白细胞的迁移，更好地发挥固有免疫和适应性免疫二者的协同作用[17]。李俊良等[12]通过体外试验研究表明，适宜剂量的壳聚糖可以增加断奶仔猪PBLs中COX-2、5-LOX基因的表达量及其活性，提高培养液中PGE2和LTB4的浓度；对断奶仔猪的试验研究也表明壳聚糖可以提高小肠黏膜上COX-2、5-LOX基因的表达量及其外周血中PGE2和LTB4的浓度，这对缓解仔猪因断奶引起的应激有重要的意义[18]。目前，有关壳聚糖对奶牛AA免疫调节途径的影响尚无报道。本试验研究表明，壳聚糖能够增加奶牛血清中COX-2、5-LOX基因的表达量及其活性，进而使PGE2和LTB4的释放量增加，对奶牛的免疫功能产生一定的影响。此外，用壳聚糖处理经脂多糖(LPS)诱导的小鼠巨噬细胞，结果发现壳聚糖能够抑制COX的活性及其基因表达的上调，降低培养液中PGE2的浓度[19]。这表明壳聚糖对AA代谢途径的调节是双向的，即在机体正常免疫状态下，促进AA代谢途径中主要介质的产生；当机体在炎症状态下或受外界刺激时，壳聚糖可以减缓PGE2等代谢产物的产生，这对壳聚糖调节动物免疫功能具有重要的意义。
已发表的研究结果表明，壳聚糖可以提高肉牛血清中白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的浓度[8]。这可能是由于壳聚糖可以增加AA代谢途径中主要介质PGE2和LTB4的产生，进而刺激巨噬细胞和单核细胞分泌IL-1、IL-6和TNF-α等免疫细胞因子，提高动物机体的免疫功能[20]。更有研究报道指出，核转录因子-κB(NF-κB)引导的信号通路对AA的释放有一定的影响，而且发现PLA2的活化与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的活性密切相关[21]。Wei等[22]研究表明壳聚糖可以通过调节NF-κB和MAPK信号通路来上调COX-2和5-LOX基因的表达，进而影响动物机体的免疫功能。由此可以推测，壳聚糖能够调节AA免疫调节途径上游基因(NF-κB和MAPK)的表达，进而调控AA免疫调节途径相关基因的表达，从而影响免疫细胞对细胞因子的分泌。此外，AA代谢途径中的代谢产物不仅是机体免疫反应的重要介质，会影响免疫系统的发育，而且也是血小板激活和脂质蛋白代谢等生理功能中重要的调控物质。
4 结论本试验结果表明，在泌乳中期奶牛饲粮中添加壳聚糖能够增加AA免疫调节途径中cPLA2、COX-2和5-LOX基因的表达量及其活性，进而提高机体内AA、PGE2和LTB4的浓度，对奶牛的免疫功能起到一定程度的调节作用，以1 500 mg/kg壳聚糖的免疫调节效果最佳。
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