2. 西南大学动物科学学院, 重庆 402460
2. College of Animal Science, Southwest University, Chongqing 402460, China
抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs),也称为宿主防御肽,是生物体为了自我保护而释放的一种碱性多肽物质,可对抗多种病原微生物,同时因其高安全和无污染的特性,受到养殖业和医药等领域的广泛关注[1-4]。植物是抗菌肽开发的重要资源,目前在根、种子、花、茎和叶中都有分离得到,其中植物种子因含有丰富的营养物质,有利于微生物繁殖,在进化过程中更容易因协同进化产生抗菌类物质[5-7]。
辣椒(Capsicum annuum L.)是一种重要的调味品及蔬菜作物,我国种植面积超过2 000万亩(1亩≈667 m2),每年产量高达2 800万t。但占其干果重30%~60%的辣椒籽,却在加工过程中被忽略,造成了资源浪费[8]。辣椒籽营养丰富,含有膳食纤维、蛋白质、脂肪和矿物质,其中蛋白质占其质量分数的17.30%左右[9],具有很好的抗菌肽开发利用潜力。
本试验前期从辣椒籽中提取出了一种对黄曲霉生长有明显抑制作用的蛋白质,结合葡聚糖凝胶层析、三羟甲基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Tricine-SDS-PAGE)检测等手段,明确其主要抑菌成分为一种分子质量在7.8 ku左右的抗菌肽[10],经小鼠急性毒性试验和大鼠亚慢性毒性试验证实其具备较好的安全性,按一定剂量添加到饲料原料中表现出与商品防霉剂等同的防霉效果[11]。但对其最适使用条件和范围尚不明确。因此,本文研究了辣椒籽抗菌肽在不同外界因素下其抑菌活性的变化,并对其抑菌谱进行了测定,为其开发为饲料添加剂、新型防腐保鲜剂或生物农药等产品奠定基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料采用文献[10]的方法制备辣椒籽抗菌肽,具体为:辣椒所选品种为贵州灯笼椒,将其辣椒籽粉碎后,用无水乙醚浸提过夜,去除粗脂肪。按料液比1:5添加至乙二胺四乙酸(EDTA)缓冲液(10 mmol/L Na2HPO4,15 mmol/L NaH2PO4,100 mmol/L KCl,1.5% EDTA,pH 5.4)中,4 ℃条件下浸提16.13 h。将浸出溶液用8层纱布过滤,8 000 r/min离心15 min,取上清液按计量81.15%饱和度所需的固体硫酸铵量,研磨粉碎后缓慢加入,均匀搅拌至充分溶解,4 ℃静止4 h,10 000 r/min离心15 min,沉淀冷冻干燥为辣椒籽抗菌肽粗品。进一步结合透析袋脱盐、10 ku超滤管超滤以及葡聚糖凝胶层析对辣椒籽抗菌肽进行分离纯化,收集,经Tricine-SDS-PAGE检测分子质量在7.8 ku左右的目标抗菌肽冷冻干燥备用。
稳定性研究指示菌:分离自贮藏玉米中的黄曲霉C1(Aspergilus flavus C1)。
抑菌谱选用的23株菌株:7株革兰氏阳性细菌、3株革兰氏阴性细菌、4株酵母、9株丝状真菌,均为西南大学动物科学学院415微生物学实验室保藏菌。
1.2 辣椒籽抗菌肽抑菌活性及抑菌谱的测定采用牛津杯琼脂平板扩散-抑菌圈法[12-13],先将指示菌稀释至107 CFU/mL,吸取1 mL到9 cm灭菌培养皿中,然后倾注15 mL加热溶化冷却至50 ℃的固体培养基,旋转混匀待其凝固后为带菌平板。检测抗菌肽抑菌活性时,在含菌平板上轻轻放置灭菌后的牛津杯,取100 μL超滤除菌的辣椒籽抗菌肽溶液加入牛津杯,4 ℃冰箱扩散6 h,在各菌适宜温度下培养48 h后测量抑菌圈直径。各处理重复6次。
1.3 辣椒籽抗菌肽抑菌稳定性测定 1.3.1 不同浓度对辣椒籽抗菌肽抑菌活性的影响分别配制浓度为10.000、5.000、2.500、1.250、0.625 mg/mL的辣椒籽抗菌肽,用牛津杯琼脂扩散法测定抑菌圈直径,分析不同浓度对黄曲霉抗菌活性的影响。各处理重复3次。
1.3.2 热处理对辣椒籽抗菌肽抑菌活性的影响取7.5 mg/mL辣椒籽抗菌肽溶液,分别在40、60、80和100 ℃条件下水浴30 min,121 ℃高温处理15 min后冷却至室温,以未热处理的样品作为对照(抑菌活性为100%),然后用牛津杯琼脂扩散法测定抑菌圈直径,并计算残留活性,研究不同温度对辣椒籽抗菌肽抑菌活性的影响。各处理重复3次。残留活性计算公式如下:
取7.5 mg/mL的辣椒籽抗菌肽溶液,分别用NaOH和HCl调节溶液pH至2、4、6、8、10、12,室温处理4 h,调回pH至中性(6.5~7.5),以未处理的样品作为对照(抑菌活性为100%),然后用牛津杯琼脂扩散法测定抑菌圈直径,计算残留活性,研究不同pH对辣椒籽抗菌肽抑菌活性的影响。各处理重复3次。
1.3.4 金属离子对辣椒籽抗菌肽抑菌活性的影响配制浓度为0.04 mol/L的金属盐溶液(NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、FeCl2、MnSO4、CuSO4),加入等体积的辣椒籽抗菌肽溶液,室温处理2 h后,以未加金属离子处理的样品作为对照,然后用牛津杯琼脂扩散法测定抑菌圈直径,计算残留活性,研究不同金属离子对辣椒籽抗菌肽抑菌活性的影响。各处理重复3次。
1.3.5 蛋白酶对辣椒籽抗菌肽抑菌活性的影响取7.5 mg/mL辣椒籽抗菌肽溶液,分别加入不同蛋白酶,使酶的终浓度为1 mg/mL,在不同酶的最适pH和最适温度下(表 1)处理4 h,然后90 ℃灭酶活,并重调pH至7.0。以未加蛋白酶的样品作为对照,然后用牛津杯琼脂扩散法测定抑菌圈直径,并计算残留活性,研究不同蛋白酶对辣椒籽抗菌肽抑菌活性的影响。各处理重复3次。
准确称取等量辣椒籽抗菌肽,在20 W紫外灯下照射(照射距离10 cm)不同时间(0、1、3、6、12、18、24 h)后,配制成等浓度溶液,以紫外照射0 h作为对照,然后用牛津杯琼脂扩散法测定抑菌圈直径,并计算残留活性,研究不同紫外线照射时间对辣椒籽抗菌肽抑菌活性的影响。各处理重复3次。
1.3.7 尿素对辣椒籽抗菌肽抑菌活性的影响分别配制含0、1、2、3、4、5、6 mol/L尿素的无菌水溶液,加入等体积的辣椒籽抗菌肽溶液,室温处理2 h后,用牛津杯琼脂扩散法测定抑菌圈直径,并计算残留活性,研究不同浓度尿素对辣椒籽抗菌肽抑菌活性的影响。各处理重复3次。
1.4 数据统计与分析数据采用Excel 2007进行初步处理,并用SPSS 20.0进行单因素方差分析,试验数据用平均值±标准差表示,并以P<0.05作为差异显著性判断标准。
2 结果与分析 2.1 辣椒籽抗菌肽的抑菌活性及抑菌谱由表 2可知,辣椒籽抗菌肽可以抑制部分细菌,主要对食源性病原菌蜡样芽孢杆菌ATCC 14579、蜡样芽孢杆菌NIZO4120、金黄色葡萄球菌DY、无乳链球菌FJ、鼠伤寒沙门氏菌Ⅱ 505及乳杆菌类的植物乳杆菌WCFS1、短乳杆菌DSMZ 3有明显的抑菌活性,显示了其在饲料和食品安全以及药物开发中的潜力。对所选的4株酵母菌酿酒酵母LU-325、酿酒酵母DSMZ 70449、光滑念珠菌Lu020、白色念珠菌ATCC10231和9株丝状真菌黄曲霉C1、黑根霉HR、黑曲霉ACCC 30005、指状青霉SQ2、绿色木霉YZ1、串珠镰刀菌ACCC 36127、瓜果腐酶ACCC37383、尖孢镰刀菌ACCC37383、立枯丝核菌ACCC 36124均有不同程度的抑制作用,显示其在饲料原料等农副产品中防霉防腐作用以及在医疗卫生中的应用潜力。
以黄曲霉C1为指示菌,研究不同浓度辣椒籽抗菌肽的抑菌效果。由表 3可知,辣椒籽抗菌肽对黄曲霉C1的抑制能力随着浓度的增加而增强,即使在低浓度(0.625 mg/mL)作用下,仍能形成明显的抑菌圈。这说明辣椒籽抗菌肽具有较强浓度稳定性。
不同温度处理对辣椒籽抗菌肽抑菌活性的影响如表 4所示。辣椒籽抗菌肽经25~100 ℃处理30 min,121 ℃高温处理15 min后,对黄曲霉C1的残留活性依然能保持90%以上,表明辣椒籽抗菌肽具备较高的热稳定性。
不同pH条件下黄曲霉生长无显著变化,但经酸碱处理后辣椒籽抗菌肽抑菌活性发生了变化,结果见表 5。在pH≥7的条件下,辣椒籽抗菌肽的抑菌圈直径随pH的升高而显著升高(P<0.05),pH 12条件下处理4 h,辣椒籽抗菌肽的残留活性比对照升高35.38%,说明其更适用于碱性条件下使用。在pH≤7的条件下,辣椒籽抗菌肽抑菌圈直径显著降低(P<0.05),pH 2条件下处理4 h,辣椒籽抗菌肽的残留活性仍可以保持在80%。
不同金属离子对抗菌肽抑菌效果的影响如表 6所示。结果表明,Fe2+处理后,辣椒籽抗菌肽的残留活性下降了32.35%,其原因可能是抗菌肽与Fe2+形成络合物,降低了辣椒籽抗菌肽的溶解性而影响其抑菌效果;其余6种金属离子处理后,抑菌圈直径和对照无显著差异(P>0.05),对抑菌活性无影响。
辣椒籽抗菌肽经不同蛋白酶处理后的抑菌活性见表 7和图 1。与对照相比,胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、风味蛋白酶处理后的辣椒籽抗菌肽抑菌圈直径无显著差异(P>0.05),说明辣椒籽抗菌肽对这4种酶的稳定性较好。
辣椒籽抗菌肽对紫外线的稳定性结果如表 8所示。结果表明,紫外线照射24 h对辣椒籽抗菌肽抑菌圈直径无显著影响(P>0.05)。
辣椒籽抗菌肽对尿素的稳定性结果如表 9所示。结果表明,辣椒籽抗菌肽经不同浓度的尿素(0~6 mol/L)处理后,与对照相比,抑菌圈直径无显著差异(P>0.05),说明辣椒籽抗菌肽对尿素稳定性较好。
任何一种新型抑菌物质,研究并掌握其抗菌谱对其后期的开发应用具有重要意义。目前报道的抗菌肽均有广谱的抑菌特性,如Qiao等[14]研究的拟穴青蟹(Scylla paramamosain)阴离子抗菌肽SCY2对革兰氏阳性菌(枯草芽孢杆菌、溶壁微球菌、藤黄微球菌、谷氨酸棒状杆菌)和革兰氏阴性菌(嗜水气单孢菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌)都具有很好的抑制效果,最低抑菌浓度(MIC)均在50 μmol/L以下,同时发现抗菌肽SCY2在青蟹的抗菌免疫中起着重要的作用。李军等[15]从萝卜籽中分离的蛋白提取物对28株来源于鲟鱼的腐败菌均有抑制作用。本试验从辣椒籽中分离得到的抗菌肽同样表现出了良好的广谱抑菌效果。该抗菌肽具有广谱的抑真菌活性,同时可抑制部分细菌。对饲料原料等农副产品中常见腐败菌(黄曲霉、黑根霉、黑曲霉、指状青霉、瓜果腐霉)以及对食源性病原菌(蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、鼠伤寒沙门氏菌、光滑念珠菌、白色念珠菌)的抑菌活性显示了其在饲料和食品安全以及药物开发中的潜力。对植物致病菌(串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌、立枯丝核菌)具有较强的抑制作用,显示了其开发为生物农药在绿色农业中的应用前景。植物乳杆菌、短乳杆菌可用于发酵领域[16-17],但对于酿酒生产则有危害[18],而酿酒酵母虽然可以用于酿造工业,但也是引起葡萄腐败的主要原因之一[19],在本试验中,抗菌肽对这3种菌的抑菌活性说明辣椒籽抗菌肽可应用于发酵业中防止过度发酵,也可以作为生鲜农产品的保鲜剂。
抗菌物质的稳定性决定了其在实际应用中的潜力和适用范围。多数研究表明,抗菌肽具有较好的稳定性,抗菌肽在不同温度、酸碱等处理后仍具有明显的抑菌作用。如胡俊[20]研究发现,地衣芽孢杆菌产生的抗菌肽具有较强的稳定性,高温(100 ℃)、酸碱变化等外界因素均不能使其抗菌效价明显下降。罗文杰等[21]从大黄鱼(Larimichthys crocea)中获得的抗菌肽Lc-NKlysin-1a对温度、pH和盐等具有良好的耐受性;魏晓晓等[22]研究的抗菌肽JH-3经过75~100 ℃的高温、80~100 mmol/L的高浓度NaCl和pH 4.0及pH 10.0的高酸碱性处理后,JH-3的抑菌活性也没有明显的变化。
本研究中的辣椒籽抗菌肽经梯度稀释至0.625 mg/mL仍能形成明显抑菌圈,以抑菌圈直径(y)和抗菌肽浓度(x)作图可知,抑菌圈直径和抗菌肽浓度为线性关系,方程为y=0.667x+11.238(R2=0.91),这与姜太玲等[23]研究的花椒籽蛋白抗菌肽的浓度稳定性结果一致;辣椒籽抗菌肽的抑菌活性经高温、紫外线照射、尿素处理后与对照比较均无显著性差异,说明其具备较强的抗变性能力;不同蛋白酶对辣椒籽抗菌肽抑菌活性无显著影响,该结果与萝卜籽抗菌肽[15]及芽孢杆菌抗菌肽[24]的蛋白酶稳定性结果一致,这可能与抗菌肽的结构有关,酶切位点没有影响到抗菌肽的功能片段;辣椒籽抗菌肽对Fe2+敏感,而对金属离子Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Cu2+表现出良好的稳定性,说明辣椒籽抗菌肽可以应用于含少量金属离子物质的防腐;酸碱处理后,辣椒籽抗菌肽的抑菌活性有所变化。有研究报道,小麦蛋白抗菌肽在酸性条件下随着pH的升高,抑菌率呈上升趋势,在接近中性pH时,抗菌肽抑菌活性变化不大,但在碱性条件下,样品的抑菌活性又随pH升高而降低[25]。戊糖乳杆菌31-1菌株所产的细菌素在pH 2~8内活性保持稳定,当pH≥9时,活性逐渐降低[26]。已被批准并广泛应用于食品防腐保鲜的乳链菌肽具有很好的酸稳定性,但在中性条件下活性衰减,pH 5.0失去40%抑菌活性,pH 6.0失去90%抑菌活性,在pH 8.0以上基本完全失活[27]。乳链菌肽和小麦蛋白抗菌肽在中性条件下活性衰减的特性极大地限制了其在中性和碱性条件下的应用。这与本试验研究的不同pH对辣椒籽抗菌肽抑菌活性的结果刚好相反,其原因可能因为不同抗菌肽因结构不同其等电点不同导致。本试验从辣椒籽中筛选的抗菌肽具有较强的酸耐受力,pH 2条件下处理4 h,辣椒籽抗菌肽的抑菌活性仍可以保持80%;且活性在碱性条件下增强,pH 10和12条件下处理4 h,辣椒籽抗菌肽的抑菌活性分别升高17.46%和35.38%。辣椒籽抗菌肽在碱性条件下活性升高的特性,决定了其更适用于中性及碱性条件下的应用,可以弥补乳链菌肽和其他碱性条件活性衰减的抗菌肽在生产中应用的不足。
4 结论① 辣椒籽抗菌肽具有较广范围的抑菌谱,对常见的腐败菌(黄曲霉、黑根霉、黑曲霉、指状青霉、瓜果腐霉)、食源性病原菌(蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、鼠伤寒沙门氏菌、光滑念珠菌、白色念珠菌)和植物致病菌(串珠镰刀菌、尖孢镰刀菌、立枯丝核菌)以及绿色木霉菌、酿酒酵母、植物乳杆菌、短乳杆菌具有较强的抑制作用。
② 辣椒籽抗菌肽具有良好的稳定性,经不同温度(25~121 ℃)、蛋白酶、紫外线照射、尿素处理后抑菌活性差异不显著,具有一定的耐酸能力,碱性条件下抑菌活性更佳,对Fe2+较为敏感,其他金属离子处理对其抑菌活性无影响。
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