小麦作为我国第二大粮食作物，在玉米价格高于小麦一定价格时，畜牧生产中可用小麦代替一定比例玉米，以降低生产成本[1-2]。由于收获2个月内的新小麦含有大量非淀粉多糖(NSP)，其中可溶性NSP可增加消化物黏度，植物细胞壁中的不溶性NSP包裹营养物使其难以消化[3-4]。本实验室的前期研究表明熟化后小麦NSP含量降低，代谢能升高[5]。因此，鉴定小麦熟化程度可以正确指导小麦的合理利用。目前，国内外许多学者对谷物的新陈度进行了深入的研究，主要有感官鉴定法、发芽率法、愈创木酚法、四氮唑盐染色法、酸度指示剂法、脂肪酸值法、降落数值法、KI法、近红外光谱技术、电子鼻技术等[6-10]。但是，关于鉴别小麦是否完成熟化尚未有报道。因此，本试验旨在寻找一种鉴定小麦新陈度、熟化程度以及新陈掺杂问题的方法。
1 材料与方法 1.1 材料和试剂材料：7种新收获小麦(济麦22、烟农173、烟农999、良星77、山农25、Sh5186、科源088)以及贮存1(济麦21、烟麦17)、2年的陈小麦(烟麦17)，所有小麦样品均采自山东。
试剂：1%愈创木酚、3%过氧化氢、0.1%四氮唑盐溶液、甲基红、溴百里香酚蓝、无水乙醇、蒸馏水。1%愈创木酚溶液、3%过氧化氢溶液、酸性指示剂原液参照赵建华等[11]配制。
1.2 试验方法 1.2.1 新陈小麦鉴定 1.2.1.1 愈创木酚法参考何学超等[12]采用的小麦新陈鉴定的方法测定，自小麦样品中取50粒饱满、完整、无霉变的麦粒于15 mL试管中，加1%愈创木酚溶液4 mL，滴加3%过氧化氢溶液0.15 mL，振摇20 s，放置2.0、2.5、3.0 min观察小麦籽粒着色情况或溶液颜色变化，确定最佳反应时间。鉴定标准：新鲜小麦的过氧化物酶活性较高，在1~3 min内能使无色的愈创木酚溶液转变为红褐色，且有部分麦粒着色；陈化的小麦过氧化物酶活性较低，愈创木酚溶液不变色或者溶液颜色很浅，麦粒小部分着色且着色较浅。
每个小麦样品设置3个重复，每个重复50粒小麦，进行检测。
1.2.1.2 四氮唑盐染色法参考杨慧萍等[13]采用的四氮唑盐染色法测定，自小麦样品中取50粒饱满、完整、无霉变的麦粒，麦粒沿胚纵切为两半，加入0.1%四氮唑盐染色液(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)4 mL，40 ℃水浴暗处理25 min，立即用清水冲洗，观察籽粒染色情况，计算染色率。鉴定标准：有活力的麦粒种胚全部染为红色，无活力的麦粒种胚全部不染色或染成浅红色。染色率计算公式如下：
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新陈小麦最佳染色时间确定：为获得明显的籽粒染色差异，区分出相应的贮存年限以及是否熟化，通过预试验对反应时间进行了改进，设置时间梯度为5、6、7、8 min对小麦进行上述试验处理，对其着色进行比较，根据新陈小麦籽粒染色率差异，确定最佳染色时间为8 min。
每个小麦样品设置3个重复，每个重复50粒小麦，进行检测。
1.2.1.3 酸度指示剂法参照赵建华等[11]采用的稻谷新陈度快速测定方法中的酸度指示剂法测定，首先确定适合小麦的工作液最佳稀释倍数。将原液与蒸馏水分别按1:8、1:10、1:12、1:15的比例稀释为工作液，取50粒完整的小麦样品分别置于试管内，加入5 mL工作液，振动后静置10 min，观察溶液显色情况，确定原液最佳稀释比例为1:10。新陈小麦由于新鲜度的不同，工作液颜色呈现绿色到黄色等深浅不等的颜色。
每个小麦样品设置3个重复，每个重复50粒小麦，进行检测。
1.2.2 新陈小麦掺杂鉴别利用酸度指示剂法开展新陈小麦掺杂鉴别研究。选取籽粒饱满、无虫害的7个品种贮存4周的新小麦和1(烟麦17、济麦21)、2年的陈小麦(烟麦17)，染色10 min观察染色液颜色，15 min记录染为红色、绿色的小麦籽粒数，计算染色率。鉴定标准：新小麦茸毛和皮部染为绿色，陈小麦茸毛和皮部染为红色。由于新小麦籽粒(以4周为例)会有部分染为红色，陈小麦籽粒会有部分染为绿色，且它们的比例都小于10%，为了方便统计只要有红色出现即判定为陈小麦。染色率计算公式如下：
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选择7个品种贮存4周的新小麦分别与贮存1年的陈小麦(烟麦17)按照1:9、3:7、5:5、7:3的比例混合，选取50粒完整小麦置于试管内，每个样品3个重复，加入稀释比例为1:10的工作液5 mL，充分振动摇匀后，15 min记录染为红色、绿色的小麦籽粒数，计算染色率。
1.2.3 小麦新陈度的定量测定选取7个品种贮存1~14周的新小麦及贮存1、2年的陈小麦(均为烟麦17)，每个样品3个重复，选取50粒完整小麦样品置于试管内，加入蒸馏水5 mL，充分振动摇匀后，每隔10 min测定1次水浸液的pH，连续测定6次，记录试验数据。
7个品种贮存4周的新小麦分别与贮存1年的陈小麦(烟麦17)按照1:9、3:7、5:5、7:3的比例混合，重复上述操作步骤，记录水浸液的pH。
1.3 数据统计分析试验数据采用SAS 9.1.3统计软件进行单因素方差分析，各平均值之间用Duncan氏法进行多重比较。试验数据用平均值±标准差表示，P＜0.05为差异显著。
2 结果与分析 2.1 愈创木酚法鉴别小麦新陈如图 1所示，新小麦染色快且颜色深，溶液及胚部呈棕红色(图 1-A、图 1-C)；陈小麦染色慢且颜色浅(图 1-B)，小麦染色在2 min时最便于观察。新小麦因品种不同而显色的速度与显色程度存在一定差异(图 1-C、图 1-D)。济麦21有1个重复(图 1-E)的染色液颜色和显色时间与新小麦差异不明显，甚至与新小麦一致，有1个重复的染色液颜色和显色时间与新小麦差异明显(图 1-B)。济麦21染色液颜色和显色时间与新小麦Sh5186差异明显(图 1-B、图 1-A)。
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A：Sh5186(1周)染色2 min；B、E：济麦21(1年)染色2 min；C：烟农999(1周)染色2 min；D：烟麦17(1周)染色2 min。 A: Sh5186 (1 week) was dyed for 2 min; B, E: Jimai 21 (1 year) for 2 min; C: Yannong 999 (1 week) for 2 min; D: Yanmai 17 (1 week) for 2 min. 图 1 愈创木酚法鉴别小麦新陈 Fig. 1 Identification of fresh and aged wheat by guaiacol method |
由表 1和表 2可知，0.1%四氮唑盐染色液染色25 min时，不同贮存阶段的新小麦(1~14周)籽粒染色率为99%~100%。烟麦17(1年)、济麦21(1年)籽粒染色率在88%~90%、88%~100%，平均值分别为88.67%、93.00%；烟农17(2年)籽粒染色率在74%~86%，平均值为78.67%。
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表 1 四氮唑盐染色法测定不同品种新小麦籽粒染色率 Table 1 Dyeing rate of different varieties of fresh wheat by triphenyl tetrazolium chloride method |
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表 2 四氮唑盐染色法测定不同品种陈小麦籽粒染色率 Table 2 Dyeing rate of different varieties of aged wheat by triphenyl tetrazolium chloride method |
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表 3 酸度指示剂法测定新陈小麦籽粒染色率 Table 3 Dyeing rate of fresh and aged wheat by acidity indicator method |
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表 4 酸度指示剂法测定不同新陈比例小麦籽粒染色率 Table 4 Dyeing rate of mixed samples with fresh and aged wheat by acidity indicator method |
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表 5 不同新陈比例小麦水浸液pH Table 5 pH of aqueous solution of mixed samples with fresh and aged wheat |
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表 7 新陈小麦pH比较 Table 7 Comparison of pH of fresh and aged wheat |
0.1%四氮唑盐染色液染色8 min时，1~8周新小麦籽粒染色率为92%~96%，10~14周新小麦籽粒染色率为77%~85%，烟麦17(1年)和济麦21(1年)籽粒染色率分别为46%~65%、40%~80%，平均值分别为56.67%、62.67%；烟农17(2年)籽粒染色率为2%~6%，平均值为4.33%。因此，小麦籽粒在40 ℃反应8 min时，能够区分出8周内新小麦与贮存10周至1年的小麦(即已经熟化的小麦)；相同品种不同贮存年限的小麦染色率差距明显，即能够区分出不同贮存年限的小麦。
2.3 酸度指示剂法鉴别小麦新陈 2.3.1 小麦新陈度的定性测定用酸度指示剂对小麦籽粒处理10 min时，新陈小麦染色液差异明显，新小麦染色液为绿色，陈小麦染色液为橙色。如图 2所示，贮存1、2年的陈小麦染色液均为橙色，差异不明显(图 2-A、图 2-B)；新小麦1、12周染色液深浅差异明显(图 2-B)。所以酸度指示剂法能很好地判断小麦的新陈，但区分不出具体的贮存年限。
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A：①为新小麦(4~12周)，②为济麦21(1年)，③为烟麦17(1年)，④为烟麦17(2年)；B：①为新小麦(1周)，②为新小麦(4周)，③为新小麦(8周)，④为新小麦(12周)，⑤为济麦21(1年)，⑥为烟麦17(1年)，⑦为烟麦17(2年)；C：①为烟农173(1周)，②为烟农173(4周)，③为烟农173(6周)，④为烟农173(7周)，⑤为烟农173(8周)，⑥为烟农173(14周)，⑦为烟农173(10周)；D：①为良星77(1周)，②为良星77(8周)，③为烟农999(1周)，④为烟农999(8周)，⑤为济麦22(1周)，⑥为济麦22(8周)；E：①为Sh5186(4周)；②为Sh5186(8周)，③为Sh5186(10周)，④为Sh5186(12周)，⑤为Sh5186(14周)；F：①为良星77(4周)，②为良星77(8周)，③为良星77(10周)，④为良星77(12周)，⑤为良星77(14周)。 A: ① was fresh wheat (4 to 12 weeks), ② was Jimai 21 (1 year), ③ was Yanmai 17 (1 year), ④ was Yanmai 17 (2 years); B: ① was fresh wheat (1 week), ② was fresh wheat (4 weeks), ③ was fresh wheat (8 weeks), ④ was fresh wheat (12 weeks), ⑤ was Jimai 21 (1 year), ⑥ was Yanmai 17 (1 year), ⑦ was Yanmai 17 (2 years); C: ① was Yannong 173 (1 week), ② was Yannong 173 (4 weeks), ③ was Yannong 173 (6 weeks), ④ was Yannong 173 (7 weeks), ⑤ was Yannong 173 (8 weeks), ⑥ was Yannong 173(14 weeks), ⑦ was Yannong 173 (10 weeks); D: ① was Liangxing 77 (1 week), ② was Liangxing 77 (8 weeks), ③ was Yannong 999 (1 week), ④ was Yannong 999 (8 weeks), ⑤ was Jimai 22 (1 week), ⑥ was Jimai 22 (8 weeks); E: ① was Sh5186 (4 weeks), ② was Sh5186 (8 weeks), ③ was Sh5186 (10 weeks), ④ was Sh5186 (12 weeks), ⑤ was Sh5186 (14 weeks); F: ① was Liangxing 77 (4 weeks), ② was Liangxing 77 (8 weeks), ③ was Liangxing 77 (10 weeks), ④ was Liangxing 77 (12 weeks), ⑤ was Liangxing 77 (14 weeks). 图 2 酸度指示剂法鉴别小麦新陈 Fig. 2 Identification of fresh and aged wheat by acidity indicator method |
除了烟农173染色慢且1~14周染色液均呈褐色外(图 2-C)，其他6个品种的小麦均有明显的颜色差异：前8周染色液均为橄榄土褐色/深绿色(图 2-D)，从第10周开始至第14周均呈褐绿色(图 2-E、图 2-F)，1、2年小麦染色液均呈橙色，新陈小麦染色液差异明显。
由表 3可知，样品全部为陈小麦时，籽粒染为绿色的染色率为4%~6%、染为红色的染色率为94%~96%；籽粒全部为新小麦时，染为绿色的染色率为94%~96%、染为红色的染色率为4%~6%。
由表 4可知，新陈小麦比例分别为1:9、3:7、5:5、7:3时，小麦籽粒染为红色的染色率分别为10%~18%、29%~43%、46%~52%、65%~73%，平均值分别为13.14%、33.00%、48.43%、69.86%。结果提示，新陈小麦掺杂比例可根据染为红色、绿色的籽粒数来确定，新小麦比例越高，染为绿色的籽粒数越多，陈小麦的比例越高，染为红色的籽粒数越多。
由表 5可知，新陈小麦掺杂比例不同，水浸液pH有显著差异(P＜0.05)。
2.3.2 小麦新陈度的定量测定由表 6可知，不同品种小麦水浸液pH有较大差异，Sh5186在1~14周各贮存阶段的pH均最高，显著高于其他品种(P＜0.05)；山农25与烟农173在各阶段的pH最接近；各品种小麦在不同的贮存阶段pH没有统一的变化规律。
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表 6 不同品种新小麦pH Table 6 pH of different varieties of fresh wheat |
由表 7可知，新陈小麦的pH差异显著(P＜0.05)，1~14周新小麦pH在7.04~7.88，平均值为7.39，陈小麦pH在6.30~6.50。
对新陈掺杂的小麦染色发现：小麦新陈比例低于3:7(包括3:7)时，染色液的颜色接近陈小麦染色液，比例越低越接近；新陈小麦比例大于5:5时，染色液的颜色接近新小麦染色液，比例越高越接近(图 3)。
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从左到右依次为：1周新小麦；新:陈=7:3；新:陈=5:5；新:陈=3:7；新:陈=1:9。 From left to right: 1 week fresh wheat; fresh:aged=7:3; fresh:aged=5:5; fresh:aged=3:7; fresh:aged=1:9. 图 3 酸度指示剂法对新陈掺杂小麦的鉴定 Fig. 3 Identification of fresh and aged mixed wheat by acidity indicator method |
愈创木酚法鉴别小麦新陈的结果与张素苹[6]、何学超等[12]及王晓琼等[9]试验结果一致，新小麦籽粒染色快、颜色深且染色面积大，染色液显色快且颜色深，表明愈创木酚法在一定程度上能快速判断出小麦的新陈，但是重复性上存在一定的问题。相邻年份的小麦或介于新陈过渡的样品有时会出现染色差异不明显。这可能是由于小麦品种、贮存条件、贮存方法等的差异使得小麦中过氧化氢酶活性不同造成的[14]。过氧化氢酶活性越高，粮食越新鲜，产物的颜色越深。
本试验中小麦籽粒用四氮唑盐染色法在40 ℃反应25 min时，1~14周新小麦籽粒染色率为99%~100%，对于贮存时间相同但品种不同的1年小麦籽粒染色率有很大变化幅度。而杨慧萍等[13]对贮存1年5个月的小麦的籽粒进行试验，染色率为100%，这可能与小麦品种、籽粒成熟度和贮藏条件差异导致胚细胞中脱氢酶活性不同有关。杨慧萍等[13]对贮存1年5个月的小麦在40 ℃条件下进行人工陈化50 d，每间隔10 d用四氮唑盐对小麦进行染色，发现人工陈化40 d(相当于正常贮存2年)的籽粒染色率为78%，与本试验结果一致。
酸度指示剂法是基于粮食酸度的不同，与指示剂反应会出现不同的颜色，由此来鉴别小麦新陈度的一种方法。本试验中，小麦按照新鲜度由高到低，指示剂的颜色会出现由绿色到橙色的变化，这与王晓琼等[9]、何学超等[12]试验结果一致。赵建华等[11]对糙米的pH进行测定，发现新鲜糙米水浸液的pH在7.0左右，发生一定劣变的pH在6.8左右，严重陈化的pH在6.4左右，新小麦与新鲜糙米浸液的pH基本一致，发生劣变或陈化的小麦与糙米的pH有一定的差异，这可能由于谷物的品种不同有关。
3.2 对新陈小麦熟化度的鉴定愈创木酚法能够鉴别新收获2个月前后的新麦，并不能用来鉴定小麦是否完成熟化，这与何学超等[12]、张素苹[6]和王晓琼等[9]的研究结果一致。这是由于不同贮存时间的小麦过氧化氢酶活性的差异，用此法难以从颜色上鉴别出来。
杨慧萍等[13]用四氮唑盐染色法能够对在人工陈化的条件下、贮藏间隔期较短的小麦陈化度进行灵敏的鉴别。本试验在原来试验条件的基础上进一步改进试验条件，能够区分出小麦是否熟化以及相同品种不同贮存年限的小麦。这可能是由于小麦贮存时间越短，其胚内脱氢酶活性越高，还原能力越强。
利用粮食随贮藏时间的延长而pH降低的特点，赵建华等[11]用酸度指示剂法对稻谷的新陈度进行测定，根据染色剂颜色的不同即可判断出稻谷的新陈。本试验对小麦的贮存时间进行了细化，除个别品种小麦不能用酸度指示剂法鉴定是否熟化外，其他品种小麦均能用此法鉴别小麦是否熟化。
4 结论① 新小麦因品种不同染色的速度与显色程度存在一定差异。愈创木酚法在一定程度上能判断出小麦的新陈，但有的品种新小麦会出现染色较浅、陈小麦染色较深的现象，应结合小麦的感官性状加以区分。
② 用四氮唑盐染色法可鉴别出2个月内新小麦是否完成熟化以及相同品种不同贮存年限(2年内)的小麦。
③ 应用酸度指示剂法能很好地鉴别小麦的新陈、是否完成熟化，也能对新陈掺杂的小麦进行一定区分，但区分不出陈小麦具体的贮存年限。
④ 各鉴别方法目前都存在一定的优缺点，愈创木酚法和四氮唑盐染色法用到的愈创木酚和四氮唑盐价格昂贵，酸度指示剂法用到的染色液廉价易得，因此，生产中应根据实际需要加以选择。
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