石斛多糖是石斛属植物中各种多糖化合物的总称,广泛存在于石斛属植物的根茎叶中。研究发现其具有抗氧化[1]、增强免疫[2]、抗炎[3]、降血糖[4]等药理作用,但目前主要局限于医药学领域的研究。随着绿色健康养殖这一理念不断深入人心,以及石斛种植产业的快速发展和石斛多糖提取工艺的不断进步,石斛多糖因其绿色、无毒副作用并具有多种生理功能,具备开发成为一种功能性饲料添加剂的潜力。因此,本文旨在就石斛多糖的生物学功能、可能的作用机制以及在畜牧生产中潜在的应用价值等方面进行综述,以期为石斛多糖在畜牧生产中的研究和开发应用提供理论参考。
1 石斛多糖的理化性质和消化吸收机制 1.1 石斛多糖的理化性质石斛多糖是一种水溶性多糖化合物,呈灰色粉末状,可溶于水,易溶于稀碱和酸液,不溶于乙醇、丙酮等有机试剂。研究证实石斛多糖的生理作用与其分子质量[5]和化学结构[6]密切相关。通过查阅近些年学者们关于各种石斛多糖组分化学结构的研究发现,石斛多糖主要由葡萄糖、甘露糖和半乳糖组成,同时伴有少量的阿拉伯糖、木糖和鼠李糖,不同品种石斛单糖组分的摩尔比有很大差异,其分子质量分布从几千至上百万ku不等[7-12]。石斛多糖主链主要由(1→6)/(1→4)-α-D-葡萄吡喃糖基/甘露吡喃糖基和(1→6)-β-D-葡萄吡喃糖基等组成,常见的侧链基团包括α/β-D-甘露吡喃糖基/葡萄吡喃糖基等,并且其化学结构中常含有O-乙酰基[9-14]。
1.2 石斛多糖的消化吸收机制目前,关于石斛多糖的消化吸收机制研究较少。李凡[15]和Xie等[16]研究发现霍山石斛多糖经过唾液后,其分子质量和还原糖含量不发生变化,而经过胃液作用降解成一个在肠液中稳定存在的片段,然后被吸收进入血液。与之类似,研究表明铁皮石斛多糖和兜唇石斛多糖经过唾液后,其分子质量不变,经胃肠消化后其多糖的整体结构完好,但分子质量均有不同程度地下降,并且还原糖增加,同时在体外酵解试验中发现,这2种多糖的糖苷键可被肠道细菌降解生成单糖,并作为发酵的底物生成挥发性脂肪酸促进结肠发育,改善肠道功能[17-18]。这表明不同的石斛多糖在胃肠道中的降解和吸收机制的研究结果存在一定差异,其具体机制还有待进一步研究。
2 石斛多糖来源石斛多糖是存在于兰科石斛属植物中的糖类化合物的总称。石斛属植物来源广泛,世界上存在1 500种左右,我国有74种,主要分布于云南、贵州、福建和两广等地区。在本草考证中石斛的药用部位是茎部,目前市场上多以石斛茎秆为原料加工成枫斗、胶囊等产品,但研究发现石斛的根、叶、花中也存在不同质量分数的多糖成分[19]。因此可通过将石斛全株作为原料来源以提高石斛资源的利用率,降低生产成本,以促进其开发利用。
粗多糖的一般提取流程如图 1所示。首先将原料进行烘干、粉碎、有机溶剂浸泡,然后离心过滤并保留滤渣,用合适的方法对滤渣处理,保留滤液。随后将上述提取液进行浓缩后,加有机溶剂反复进行沉淀、离心,最终经干燥得到粗石斛多糖。目前常采用的分离提取方法有:水提醇沉法、超声波辅助法、微波辅助法和酶解辅助法。水提醇沉法是目前最常用的提取石斛多糖的方法,此法操作简单、设备要求低、对多糖的活性影响小,但提取率较低。黄晓君等[20]对水提醇沉法提取铁皮石斛多糖的工艺进行优化,结果表明,最佳提取工艺为温度为90 ℃、提取时间为2 h、水料比为30:1,多糖提取率可达30.56%。研究发现超声波和微波辅助提取可显著缩短提取时间,但多糖的糖苷键在超声或微波条件下可能会发生断裂[21]。酶解辅助法提取多糖所需条件温和且提取率较高,但酶的价格较高,提取时对温度和pH的控制要求十分严格,且所用的酶可能会影响多糖的高级结构[22]。以上方法获取的石斛粗多糖中往往含有蛋白质杂质,这会给粗多糖的进一步分离纯化造成障碍,因此需要去除其中的蛋白质。去除多糖中的蛋白质常采用Sevag法[23],该法利用蛋白质在三氯乙烷等有机溶剂中变性的特点,将提取液与Sevag试剂(三氯乙烷和正丁醇按照一定的比例混合而成)混合、振荡、离心,变性后的蛋白质介于提取液与Sevag试剂交界处,从而很容易被分离除去。此法操作简单、反应条件温和并且不会引起多糖的变性,因此被广泛应用于多糖的除杂工艺中。赵俊凌等[24]用Sevag法对齿瓣石斛粗多糖除蛋白质工艺进行优化,研究表明,Sevag试剂即三氯乙烷:正丁醇=4:1(体积比),样品:Sevag试剂=4:1(体积比),振荡时间30 min的条件下脱蛋白效果最佳。
石斛多糖的抗氧化机制主要体现在以下几个方面:1)提供质子的能力。羟基自由基是机体内最有害的自由基,它会引起脂类、蛋白质、DNA等生物分子氧化损伤,从而导致细胞死亡和组织损伤[25-26]。Luo等[27]研究发现,金钗石斛多糖在0.5 mg/mL浓度时清除羟基自由基的活性接近于维生素C,可能的机制为多糖提供的氢与羟基自由基结合形成稳定的自由基,从而终止自由基链式反应[28]。2)石斛多糖具有较强的金属螯合活性。某些金属离子,如Fe2+在脂质氧化中起催化作用,通过Fenton反应可使过氧化物产生自由基,从而导致细胞中的脂质、蛋白质、DNA等化合物受损。Luo等[9]研究发现,在0.05~0.80 mg/mL浓度内,铁皮石斛多糖的金属螯合能力从6.3%提高到85.2%。3)石斛多糖通过维持细胞线粒体的正常结构和功能从而减少氧自由基的生成。线粒体是机体内活性氧产生的主要场所,在大多数细胞中超过90%的氧在线粒体中被消耗,其中2%的氧在线粒体内膜和基质中被转变成为氧自由基[29]。因此,维持线粒体结构和功能的完整有助于减少自由基的生成。研究表明,石斛多糖保护细胞线粒体可能机制是:通过干扰肿瘤坏死因子-α(TNF-α)与其受体结合,减少TNF-α对线粒体结构和功能的损伤[30],以及抑制机体自然衰老表达过程中p53/Bcl-2介导的线粒体凋亡信号通路从而改善线粒体功能[31]。4)参与激活细胞中的核因子E2相关因子2(Nrf2)-Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)-抗氧化反应元件(ARE)信号通路,从而强化其自我保护机制,维持细胞内氧化还原稳态。研究表明,石斛多糖可通过上调机体内Nrf2基因的转录水平,增加Nrf2蛋白表达和Nrf2蛋白核移位进而促进醌氧化还原酶1基因mRNA和蛋白的表达,提高血液和组织中抗氧化酶的水平,从而抵抗高糖诱导下的氧化应激损伤,维持细胞内的氧化还原稳态[32-33]。
3.2 免疫调节作用免疫器官、免疫细胞和免疫分子共同组成机体的免疫系统。胸腺作为中枢免疫器官是T淋巴细胞发育成熟的场所,并且其胸腺基质细胞可以产生多种肽类激素参与调节外周成熟的T细胞。脾脏是机体最大的免疫器官,含有大量的免疫细胞,是体液免疫和细胞免疫的中心。对免疫器官指数的影响,可作为评价某一物质免疫调节作用的初步指标[34]。研究表明,石斛多糖可增加脾脏指数[35]和胸腺指数[31]。T淋巴细胞和B淋巴细胞分别参与细胞免疫和体液免疫,在宿主防御中发挥重要作用。有报道称石斛多糖能够促进脾脏T细胞和B细胞的增殖和活化[7, 36]。辅助T细胞(Th)主要分为1型辅助T细胞(Th1)与2型辅助T细胞(Th2)2种,其中Th1参与细胞免疫和迟发性超敏性炎症反应,Th2可辅助B细胞分化为抗体分泌细胞参与体液免疫应答。研究表明,铁皮石斛多糖[37]和霍山石斛多糖[38]均能通过促进Th细胞增殖并诱导其产生相关的细胞因子。Xie等[39]进一步研究发现,铁皮石斛多糖可能通过改变Th1/Th2平衡进而增加干扰素-γ(IFN-γ)与白细胞介素-4(IL-4)的比率,从而促进小鼠肠道分泌型免疫球蛋白A(SIgA)的产生并调节小肠黏膜结构,最终有效调节肠道免疫功能。NK细胞作为淋巴细胞类的一员,在机体免疫反应的早期阶段可控制感染[40]。研究表明石斛多糖可以增加脾脏NK细胞的数量并促进NK细胞的细胞毒性[8]。巨噬细胞是动物机体抵御外来病原体入侵、清除异物和识别并杀伤癌变细胞的第1道防线[41]。研究证实石斛多糖具有促进巨噬细胞增殖、分泌免疫活性物质以及增强其吞噬能力的作用[42]。蔡海兰等[43]和Li等[44]研究发现,石斛多糖可促进小鼠巨噬细胞(RAW264.7)分泌炎性细胞因子,激活Jun氨基末端激酶(JNK)、细胞外信号调节激酶(ERK)、p38丝裂原激活蛋白激酶(p38)以及核因子-κB(NF-κB)信号通路,增加TNF-α的表达。这表明石斛多糖对巨噬细胞的免疫调节涉及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和NF-κB信号通路。Xie等[45]进一步研究证实,石斛多糖通过结合巨噬细胞表面的Toll样受体4(TLR4)进而触发TLR4信号转导,从而激活MAPK、NF-κB和磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)-丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)信号通路,最终促进炎性细胞因子的分泌。Huang等[46]研究表明,铁皮石斛多糖能显著刺激脾淋巴细胞的增殖并促进脾淋巴细胞中IFN-γ和IL-2的分泌,从而激活巨噬细胞。此外,石斛多糖免疫调节功能可能与自身抗氧化活性有关。例如,巨噬细胞作为促氧化剂作用的主要靶点可被一些具有毒性作用的细菌通过刺激产生活性氧导致死亡[47],而石斛多糖通过清除机体内过多的自由基减少其对免疫细胞的攻击,从而间接发挥免疫调节作用。
综上所述,近几年国内外对石斛多糖的研究偏向于动物体液免疫、细胞免疫和细胞因子诱生等方面,而对石斛多糖在免疫细胞上的受体、细胞表面和细胞内信号传递以及调控其所控制基因的表达机制等方面还有待进一步深入研究。
3.3 抗炎作用动物机体的适度炎症反应对机体免疫具有促进作用,相反过度的炎症反应会造成机体细胞、组织和器官损伤。目前,学者们常用四氯化碳(CCl4)或脂多糖(LPS)刺激动物机体构建炎症模型,研究表明这2种物质的致炎机制均涉及LPS与靶细胞表面TLR4结合,进而通过TLR4介导的信号传导通路触发下游MAPK和NF-κB信号通路,促进TNF-α和NO等炎性因子大量产生[48-49]。Tian等[50]和黄杰等[51]分别在采用CCl4和LPS诱导的小鼠巨噬细胞所构建的炎症模型中研究发现,石斛多糖可通过降低炎性细胞因子的分泌从而减轻巨噬细胞的炎症损伤。推测其可能的机制是石斛多糖与LPS竞争细胞膜表面的TLR4,由于石斛多糖对细胞的刺激较为温和,相较于LPS,石斛多糖对NF-κB和MAPK这2个信号通路的刺激较弱,因此相对于CCl4和LPS介导的炎症模型组,石斛多糖组可缓解LPS诱导的小鼠巨噬细胞内NF-κB信号通路的过度激活以及相关炎性细胞因子mRNA的表达,从而减少炎性因子的分泌。此外,小鼠RAW264.7细胞表型可分为M1型和M2型。M1型表面主要含有CD16和CD32标记物,分泌促炎因子白细胞介素-6(IL-6)、TNF-α、一氧化氮(NO)等。M2型表面标记物主要含有CD206,分泌抗炎因子白细胞介素-10(IL-10)、转化生长因子-β1(TGF-β1)等。研究发现,LPS可诱导RAW264.7细胞向M1型极化,而铁皮石斛多糖可促进RAW264.7细胞向M2型极化,逆转LPS的作用从而起到抗炎作用[52]。Lin等[38]研究发现,铁皮石斛多糖诱导的抗炎因子白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)的水平是白细胞介素-1β(IL-1β)的10倍,表明石斛多糖诱导的抗炎活性可能超过IL-1β介导的炎症活性从而表现出抗炎效果。TNF-α是激活NF-κB的一种重要炎性介质,其诱导的细胞凋亡及炎症被认为是通过激活TNF-α受体(TNFR1和TNFR2)介导的[52]。研究发现,石斛多糖呈剂量依赖性抑制TNF-α对人涎腺细胞系A-253细胞内NF-κB和MAPK信号通路的激活,并且使用抗凋亡药物抑制TNF-α与其受体结合同样可以抑制NF-κB的激活,因此推测石斛多糖可能通过干扰TNF-α与其受体形成复合物从而抑制下游信号通路的激活[30]。此外,氧化应激反应是炎症反应的一个重要组成部分,石斛多糖的抗氧化活性也可在一定程度上有助于抵抗机体炎症反应。
综上所述,石斛多糖的抗炎活性可能归因于3个方面:1)诱导细胞产生抗炎因子,如IL-1ra和IL-10;2)与致炎物质竞争细胞膜表面的TLR4并干扰炎性细胞因子与受体结合形成复合物,从而抑制其介导的NF-κB、MAPK等下游信号通路的过度激活;3)其抗氧化活性有助于降低氧化应激从而抑制炎症反应。
3.4 降血糖Pan等[53]研究发现,3个不同品种石斛的多糖对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠均有明显的降糖作用,同时提高肝脏和肾脏抗氧化酶的活性,并可干预胰腺组织损伤。胰腺十二指肠同源盒-1(PDX-1)是胰岛β细胞发育过程中的重要调控因子[54], 其活性与正常表达是保证胰岛细胞的完整性和正常功能的重要条件[55]。过度的氧化应激可通过激活JNK信号途径抑制PDX-1蛋白的核内转位[56],最终导致胰岛素的生物合成减少[57]。因此,石斛多糖的降血糖活性与其抗氧化功能密切相关。另外,研究证实铁皮石斛多糖可显著降低高血糖小鼠的血糖水平并促进胰岛素分泌,但对正常老鼠血糖以及血清胰岛素水平无显著影响,同时发现铁皮石斛多糖通过抑制肾上腺素引起的肝糖原分解和促进肝糖原合成从而发挥胰外降血糖作用[58]。胰岛素抵抗(IR)己成为Ⅱ型糖尿病的主要病理标志[59]。税维智[60]研究表明,石斛多糖的降血糖活性与胰岛素受体底物1(IRS1)-PI3K-葡萄糖转运子2(Glut2)信号通路密切相关,其通过抑制JNK的表达,促进IRS1蛋白表达及其与胰岛素受体β(IR-β)结合,增加PI3K的表达,从而影响PI3K通路进而促进Glut2表达增加,最终改善IR发挥调节血糖的作用。此外,肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物A基因(MafA)是调控胰岛素转录的重要因子之一,MafA蛋白正常的表达对胰岛β细胞的成熟及维持其功能至关重要[61]。赵亨[62]研究表明,金钗石斛多糖可显著减轻高糖对MafA基因表达的抑制作用,从而维护胰岛β细胞的功能发挥降血糖的作用。
综上所述,石斛多糖主要通过以下途径调节机体血糖:1)通过自身抗氧化、抗炎活性以及减弱高糖对相关基因mRNA表达的抑制作用维护胰岛β细胞正常的生理功能;2)抑制肾上腺素导致的糖原分解,同时促进肝脏细胞糖原的合成,发挥胰外降血糖功能;3)调节IRS1-PI3K-Glut2信号通路改善胰岛素抵抗,从而起到降血糖的作用。
4 在动物生产中的潜在应用价值石斛属植物生境独特,对小气候环境要求严格,种子细小、无胚乳、发芽困难[63]。这导致其野生资源临近枯竭、价格昂贵,其研究主要局限于医药学领域。目前,石斛种植产业已经度过起步期进入发展期。石斛产业从原料种植到加工成相关产品已经形成了完整的产业链,初具一定的产业规模,而且在品种选育、细胞组织培养、设施栽培等关键技术上也已取得突破性进展[64]。同时据相关研究报道石斛种苗价格、种植成本和销售价格近年来有很大幅度下降[65]。受石斛种植和加工产业的规模效应以及相关技术革新等因素的影响,石斛多糖的生产成本有望进一步降低。此外,由上述可知,石斛多糖具有抗氧化、调节免疫、抗炎、降血糖等生理功能,能通过多靶点不同途径在动物机体内发挥广泛而有效的免疫调节作用。Xie等[39]研究表明,石斛多糖能促进小鼠肠道SIgA的产生并增加小肠绒毛高度和隐窝深度,从而有利于动物的肠道免疫和养分消化吸收。在集约化养殖过程中,动物常常会出现氧化应激以及炎症反应造成动物生长性能下降。石斛多糖所具有的抗氧化和抗炎活性能有效减缓这些不利影响,这在老鼠身上已得到证实[66]。综上所述,石斛多糖具备替代抗生素的潜力。同时国家农业农村部规定在2020年饲料中全面禁抗,这对畜牧行业既是一个挑战也是一个机遇。在国家法律和政策的导向下加快对天然、绿色、安全、无公害的饲料添加剂的开发和应用既是大势所趋也是时代赋予畜牧人的使命。在此背景下,作为明星中草药之一的石斛被进一步深入研究并开发应用于动物生产中具有其现实意义与潜在经济价值。
5 小结石斛多糖在抗氧化、调节机体免疫、抗炎、降低血糖等方面起着重要的作用,这使得石斛多糖在动物生产中具有潜在的应用价值。然而,其在动物生产上的应用仍存在很多问题。首先,石斛种植产业起步较晚、规模较小、而且石斛多糖提取工艺尚不成熟,导致其生产成本较高。其次,关于石斛多糖发挥各种生理功能的具体作用机制仍不是特别明确,还有待进一步探索和研究。今后随着石斛种植产业规模的扩大、石斛多糖提取工艺的成熟以及关于石斛多糖作用机制研究的进一步深入,石斛多糖有望作为一种天然、绿色、无公害的饲料添加剂应用于动物生产中,促进绿色无抗养殖的良好发展。
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