2. 广东省水产动物精准营养与高效饲料工程技术研究中心, 湛江 524088;
3. 农业部华南水产与畜禽饲料重点实验室, 湛江 524000
2. Aquatic Animals Precision Nutrition and High-Efficiency Feed Engineering Research Center of Guangdong Province, Zhanjiang 524088, China;
3. Key Laboratory of Aquatic, Livestock and Poultry Feed Science and Technology in South China, Ministry of Agriculture, Zhanjiang 524000, China
胆碱是动物生长发育所必需的一种水溶性维生素,在动物神经发育、肝脏脂肪沉积和转运中起着十分重要的作用[1]。胆碱主要参与3类代谢途径:1)作为卵磷脂的前体,是细胞膜和脂蛋白的重要组成部分,参与组织脂肪代谢;2)作为神经递质乙酰胆碱(ACH)的组成成分,参与神经系统信息的传递;3)甜菜碱合成的前体物质,作为甲基化反应中不稳定的甲基供体[2-3]。
胆碱尽管可以自身合成,但其合成的量和速率远不能满足动物快速生长的需要[4]。已有研究发现,投喂缺乏胆碱的饲料,鱼类会出现生长缓慢、饲料转化率降低、存活率低等现象[5-6]。当饲料中胆碱水平为8.1 mg/kg时,斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)出现生长缓慢、死亡率较高等胆碱缺乏症[7];而适宜胆碱水平(602.5~1 511.5 mg/kg)能显著提高斜带石斑鱼的生长性能。此外,胆碱被认为是防止脂肪过度沉积和脂肪肝形成的重要营养因子[4]。摄食添加胆碱饲料的红鼓鱼(Sciaenops ocellatus)肝脏脂肪含量显著低于不添加组[8]。但畜禽饲粮中胆碱过量会引起血管扩张、血压下降等中毒现象,影响生长性能,降低饲养动物的生长速度和饲料效率[9-10]。对斜带石斑鱼[7]、异育银鲫(Carassius auratus gibelio)[11]研究结果表明,饲料中过量的胆碱会降低鱼类的生长性能。
凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)又称南美白对虾,是世界三大主养虾类之一。以往的试验表明,日本囊对虾(Penaeus japonicus)(0.5~1.0 g)饲料氯化胆碱适宜水平为600 mg/kg[12];斑节对虾(Penaeus monodon)(1.18 g)饲料胆碱适宜水平为6 200 mg/kg[13];Gong等[14]的试验结果表明,凡纳滨对虾(7.20 g)饲料氯化胆碱适宜水平为871 mg/kg;而夏明宏[15]的研究结果得出,凡纳滨对虾(0.30 g)饲料胆碱最低水平为3 254.1 mg/kg。以往研究数据差异较大,因此本试验以平均初重为(0.40±0.01) g的凡纳滨对虾作为研究对象,探讨饲料胆碱水平对凡纳滨对虾幼虾生长性能、体成分、组织胆碱含量、血清生化指标及肝胰腺抗氧化能力的影响,以确定凡纳滨对虾幼虾胆碱适宜需要量,试验结果可为凡纳滨对虾高效精准配合饲料的生产提供基础数据。
1 材料与方法 1.1 试验饲料以脱维酪蛋白(购自Sigma)、白鱼粉等为蛋白质源,鱼油和玉米油为脂肪源,玉米淀粉为糖源,配制基础饲料。在基础饲料中分别添加0(对照)、1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 mg/kg的氯化胆碱(购自Sigma-Aldrich,纯度≥98%),共配制6种试验饲料,饲料中胆碱实际水平分别为9.30(对照)、980.67、1 985.42、2 991.63、3 987.27、4 988.69 mg/kg,试验饲料组成及营养水平见表 1。饲料原料粉碎后过80目筛,根据饲料配方称取各原料,饲料制作过程中,微量成分采用逐级扩大法混合均匀,然后添加30%~40%(质量分数)的水制成团状,用双螺杆挤条机制成粒径为1.0、1.5 mm的饲料,在阴凉干燥环境中风干后封口袋密封,-20 ℃保存。
养殖试验在广东省湛江市东海岛广东海洋大学海洋生物研究基地室内海水养殖系统中进行,凡纳滨对虾幼虾购于湛江市东海岛中联虾苗厂。幼虾购回后,在室外水泥池中标粗至所需规格。正式试验开始前投喂基础饲料1周,使对虾适应饲料。禁食24 h后,挑选规格均匀、健壮、活力强的对虾[(0.40±0.01) g]960尾,随机分配到6个组,每组4个重复,每个重复1个0.30 m3的玻璃钢桶,每桶40尾虾,养殖期8周。每天投喂4次(07:00、11:00、17:00、21:00),饱食投喂,投喂1 h后查料,根据对虾摄食情况及天气情况调整投喂量。试验前2周每2 d换水1次,后期每天换水1次。养殖期间不间断充氧,水温为23~26 ℃,盐度为26~28,pH为7.8~8.2,溶氧含量≥5 mg/L,氨氮含量 < 0.2 mg/L,亚硝酸盐含量 < 0.05 mg/L。
1.3 样品采集与测定 1.3.1 样品采集试验结束禁食24 h后,以桶为单位,称重、计数,计算生长性能指标。每桶随机取15尾虾,其中5尾虾剖取肝胰腺称重,用于肝体比(HSI)的测定;剩余10尾用1 mL注射器从第五步足基部血窦取血,合并置于Eppendorf管中,4 ℃冰箱保存过夜,以3 000 r/min离心10 min后收集血清,-80 ℃冰箱保存,备测血清生化指标。然后每桶另取5尾虾剖取肝胰腺和肌肉,液氮冷存,后转移至-80 ℃冰箱备测胆碱含量;剩余的对虾沥干水分后装于封口袋中,备测常规营养成分含量。
1.3.2 饲料及全虾常规营养成分分析饲料及全虾常规营养成分含量测定采用AOAC(1997)[16]方法。水分含量采用105 ℃烘干恒重法测定,粗蛋白质(CP)含量采用凯氏定氮法(KjeltecTM 8400,瑞典)测定,粗脂肪(EE)含量采用索式抽提法(抽提剂为石油醚)测定,粗灰分(Ash)含量采用马弗炉550 ℃灼烧法测定。饲料和组织胆碱含量采用Augustin[17]的方法测定。
1.3.3 血清生化指标测定血清中总蛋白(TP)、总胆固醇(T-CHO)、甘油三酯(TG)含量及谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)活性均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定,测定步骤按照试剂盒说明书进行。
1.3.4 肝胰腺酶活性及丙二醛(MDA)含量测定肝胰腺中的超氧化物歧化酶(SOD)活性、还原型谷胱甘肽(GSH)和MDA含量采用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定,测定步骤按照试剂盒说明书进行。
1.3.5 生长性能指标计算增重率(WGR,%)=100×(末体重-初体重)/初体重;
特定生长率(SGR,%/d)=100×(ln末体重- ln初体重)/饲养天数;
饲料系数(FCR)=摄食饲料干重/(末体重-初体重);
成活率(SR,%)=100×试验结束时虾尾数/试验开始时虾尾数;
HSI(%)=100×肝胰腺重/虾体重。
1.4 数据处理试验结果用“平均值±标准差”表示。采用SPSS 20.0统计软件对数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA),若存在显著性差异,再采用Duncan氏法进行多重比较,检验组间的差异显著性,P < 0.05表示差异显著;采用Excel 2016的二次回归曲线拟合得出凡纳滨对虾幼虾胆碱适宜需要量。
2 结果 2.1 饲料胆碱水平对凡纳滨对虾生长性能的影响由表 2可知,饲料胆碱水平可显著影响对虾WGR、SGR、FCR、SR(P < 0.05),对HSI无显著影响(P>0.05)。WGR、SGR、SR随着饲料胆碱水平的增加呈现先上升后下降的趋势,其中,WGR和SGR在3 987.27 mg/kg组达到最大值,SR在2 991.63 mg/kg组达到最大值,均显著高于对照组(P < 0.05);FCR呈现先下降后稳定的趋势,在2 991.63 mg/kg组达到最低值。以WGR为判断依据,通过二次回归曲线分析得出凡纳滨对虾幼虾胆碱适宜需要量为2 965.97 mg/kg(图 1)。
由表 3可知,饲料胆碱水平显著影响凡纳滨对虾体EE、Ash的含量(P < 0.05),对虾体水分及CP含量的影响不显著(P>0.05);虾体EE含量随着饲料胆碱水平的升高呈逐渐下降的趋势,对照组显著高于其他组(P < 0.05);虾体Ash含量在1 985.42 mg/kg组达到最大值,显著高于对照组(P < 0.05)。
由表 4可知,凡纳滨对虾肝胰腺胆碱含量呈先上升后下降的趋势,在3 987.27 mg/kg组达到最大值,并显著高于其他各组(P < 0.05);随着饲料胆碱水平的升高,肌肉胆碱含量先上升后趋于稳定,并在4 988.69 mg/kg组达到最大值,与3 987.27 mg/kg组无显著差异(P>0.05),但显著高于其他各组(P < 0.05)。以肝胰腺胆碱含量为判断依据,通过二次回归曲线分析可得凡纳滨对虾幼虾胆碱适宜需要量为3 737.41 mg/kg(图 2)。
由表 5可知,随着饲料中胆碱水平的提高,对虾血清ALT活性呈先上升后下降趋势,而AST活性呈逐渐下降趋势;与对照组相比,饲料中添加1 985.42~4 988.69 mg/kg胆碱均显著降低对虾血清ALT及AST活性(P < 0.05)。随着饲料中胆碱水平的提高,血清TG、T-CHOL及TP含量均呈先上升后趋于稳定的趋势;其中,4 988.69 mg/kg组血清TG、T-CHOL含量显著高于对照组(P < 0.05);2 991.63 mg/kg组血清TP含量显著高于对照组和980.67 mg/kg组(P < 0.05)。
由表 6可知,饲料胆碱水平显著影响凡纳滨对虾肝胰腺GSH及MDA含量(P < 0.05),对SOD活性无显著影响(P>0.05)。49 88.69 mg/kg组肝胰腺MDA含量最低,显著低于对照组和980.67 mg/kg组(P < 0.05),与其他组无显著差异(P>0.05)。
饲料中添加适宜水平胆碱可显著提高艾维茵肉仔鸡[18]、北京鸭[19]、青农灰鹅[20]日增重和采食量。在对水产动物的研究中,Luo等[21]研究发现,适宜胆碱(1 156.4 mg/kg)组黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)的WGR、SGR显著高于胆碱缺乏(239.2 mg/kg)组和胆碱过量(2 273.6 mg/kg)组。饲料添加适宜胆碱(2 103 mg/kg)显著提高团头鲂(Megalobrama amblycephala)的WGR和摄食量(FI)[22]。饲喂6 734 mg/kg胆碱组斑节对虾有最大的WGR和饲料效率(FE),且显著高于饲喂182~1 906 mg/kg胆碱组[13]。本试验中,饲料中适宜胆碱水平显著提高了凡纳滨对虾的生长性能及饲料效率,与上述研究结果一致,也与斑点叉尾(Lctalurus punctatus)[23]、军曹鱼(Rachycentron canadum)[11]及斜带石斑鱼[7]的报道相一致。饲喂24 mg/kg氯化胆碱的日本囊对虾SR(55%)显著低于饲喂600和3 000 mg/kg氯化胆碱的对虾SR(80%和90%)[12]。本试验中,低水平胆碱(9.30~980.67 mg/kg)组对虾的SR显著低于其他组(1 985.42~4 988.69 mg/kg),这与上述结果相一致,表明缺乏胆碱会降低水产动物SR。饲料胆碱水平的缺乏或过量会破坏肝脏转运脂质平衡,加重机体代谢负荷,造成动物代谢紊乱,影响摄食效果[7, 24],这已在奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus×O. aureus)[25]、异育银鲫[26]等研究中得到了证实。
本试验通过二次回归曲线分析得出,凡纳滨对虾(0.4 g)饲料脂肪水平为8%时,胆碱适宜需要量为2 965.97 mg/kg,这与夏明宏[15]得出的凡纳滨对虾(1.03 g)饲料脂肪水平为7%时,胆碱需要量(3 254.1 mg/kg)相接近,但与Gong等[14]得出的凡纳滨对虾(7.20 g)饲料脂肪水平为8%时,氯化胆碱添加水平(871 mg/kg)差异较大,这可能与对虾生长阶段密切相关。养殖对象对胆碱需要量的差异,可以归因于养殖对象种类、年龄/大小和水温等环境因子等[27-28]。
3.2 饲料胆碱水平对凡纳滨对虾体成分的影响本试验中,饲料胆碱水平对凡纳滨对虾体水分和CP含量无显著影响,这与斜带石斑鱼[7]、军曹鱼[11]的研究结果一致。饲料添加0.6%~0.9%氯化胆碱可显著降低大口黑鲈(Micropterus salmoides)EE含量[29];饲料氯化胆碱水平可显著降低草鱼EE含量[30];本试验结果与之类似。但部分研究发现,饲料胆碱水平可使虹鳟(Oncorhynchus mykiss)[31]、黄鲈(Perca flavescens)[3]EE含量呈现上升趋势,也在凡纳滨对虾[15]、斑节对虾[13]、军曹鱼[11]等研究中发现对EE含量无显著影响。目前,饲料中添加胆碱对养殖动物EE含量的影响尚无一致结论,其影响机制有待进一步研究。
3.3 饲料胆碱水平对凡纳滨对虾组织胆碱含量的影响组织胆碱含量可反映出动物体内胆碱营养状况,是衡量动物对胆碱需要量指标之一[11]。在本试验中,肝胰腺胆碱含量呈先上升后下降的趋势,这与斑节对虾[13]和奥尼罗非鱼[25]的研究结果相似。军曹鱼[11]、团头鲂[22]肌肉胆碱含量呈现先上升后稳定的趋势,与本试验结果相一致,表明对虾肌肉胆碱含量达到饱和后,不会再随着饲料胆碱水平的升高而升高;不同组织的胆碱含量会有所差异,可能与其功能相关[11],但具体原因还有待进一步研究。本试验通过WGR拟合得出凡纳滨对虾幼虾的胆碱适宜需要量与肝胰腺胆碱含量拟合得出的适宜需要量相差较大,说明凡纳滨对虾维持特殊的生理功能比维持正常生长所需的胆碱需要量要高,这可能与肝胰腺脂肪代谢功能相关[22]。
3.4 饲料胆碱水平对凡纳滨对虾血清生化指标的影响磷脂酰胆碱是合成脂蛋白重要原料,当饲料中胆碱缺乏,可造成磷脂酰胆碱合成量不足;TG是肝脏脂肪的主要成分,脂蛋白可以将肝脏TG向肝外组织转运,以防止脂肪肝的形成。本试验中,4 988.69 mg/kg组对虾血清TG和T-CHOL的含量显著高于对照组,这与中华鲟(Acipenser sinensis)[32]、大西洋鲑鱼(Salmo salar)[33]等研究结果一致,表明饲料胆碱水平的增加,促进了磷脂酰胆碱的合成,提高了肝胰腺TG向肝外的转运。然而,夏明宏[15]研究中,不同饲料胆碱水平对凡纳滨对虾血清TG和T-CHOL含量均无显著影响,这可能是因为试验饲料中卵磷脂含量不足,造成机体脂肪代谢紊乱。AST和ALT是氨基酸代谢过程中重要的氨基酸转氨酶,一般存在于肝细胞,只有当肝细胞受到损伤时,才会导致AST和ALT从肝细胞进入血液中,它们是反映肝脏损伤的敏感指标[34]。本试验对虾血清中AST和ALT活性随着饲料胆碱水平的升高而显著降低,说明饲料胆碱添加有助于肝脏脂肪的转运,对肝脏有保护作用。在星斑川鲽(Platichthys stellatus)[35]研究中也得到了类似的结果。
3.5 饲料胆碱水平对凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化能力的影响MDA作为脂质过氧化产物,可以作为反映机体内脂质过氧化程度的指标,也被认为是肝脏损伤的指标[36-37]。在正常生理条件下,活性氧(自由基)类高活性分子的生成和清除维持在稳定状态;当活性氧的生成超过机体清除能力,就会导致氧化应激;而SOD可有效清除氧自由基,GSH同样具有抗氧化、解毒等作用,是甲壳类非特异性免疫系统的重要组成部分[38]。本试验中,凡纳滨对虾肝胰腺的MDA含量随饲料胆碱水平呈下降趋势,4 988.69 mg/kg组显著低于对照组;饲料胆碱水平显著降低了肝胰腺GSH的含量,对SOD活性没有显著影响,这与夏明宏[15]研究结果相同。团头鲂高脂饲料随着胆碱水平的增加,其肝脏的MDA含量及SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性显著降低[39]。这表明饲料中胆碱的添加可降低肝脏氧化应激损伤程度。
4 结论以WGR为判断依据,通过二次回归曲线分析得出:饲料脂肪水平为8%时,凡纳滨对虾幼虾胆碱的适宜需要量为2 965.97 mg/kg。
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