脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)主要由镰刀菌属病原真菌产生,是单端孢霉烯B族类中具有代表性的一种霉菌毒素,由于其强烈的致吐作用,又被称为呕吐毒素[1]。据联合国粮农组织报道,全世界有高达25%的粮食作物受到霉菌毒素污染,其中DON的检出率和检出量均最高[2]。DON不仅容易污染谷物及其产品,且毒性作用也较为广泛。研究表明,DON对人类和畜禽的危害较大,具有神经毒性、免疫毒性、生殖和发育毒性以及“三致”毒性作用[3]。动物摄入DON后会出现食欲下降或拒食、呕吐、消化紊乱、体重减轻以及免疫力下降等症状,且幼龄动物更为敏感[4]。DON可对断奶仔猪造成肠道黏膜损伤,增加肠道通透性,引起部分生化指标异常[5]。此外,DON可引起雏鸡血清及脑组织脂质过氧化反应,造成脑组织不同程度损伤[6]。在细胞水平上,DON的主要毒性作用是抑制蛋白质和核酸的合成,造成DNA损伤,并通过诱导细胞发生凋亡而发挥细胞毒性效应[7]。
线粒体信号通路是细胞凋亡最主要的路径之一,已知DON可破坏线粒体功能,从而诱导细胞凋亡。Li等[8]报道DON可作用于小鼠胸腺上皮细胞,引起胸腺上皮细胞线粒体功能障碍,影响相关蛋白表达,从而诱导细胞发生凋亡。此外,DON还被证明可破坏动物神经系统功能和神经内分泌功能[9-10]。Wang等[11]研究表明,DON可影响PC12细胞线粒体相关凋亡基因的表达,从而诱导PC12细胞凋亡。虽然目前对于DON细胞毒性作用的研究很多,但关于DON对神经细胞的毒性作用及其诱导细胞凋亡的信号途径还不是很清晰。猪对DON最为敏感,且海马区是中枢神经系统中最容易受到外界因素影响而损伤的区域。因此,本试验以仔猪海马神经细胞为研究对象,通过检测细胞凋亡率、线粒体膜电位变化以及线粒体通路主要凋亡基因的表达量等,探索DON诱导仔猪海马神经细胞凋亡的线粒体信号转导途径,为进一步丰富DON的神经毒性机制提供试验依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料和仪器仔猪海马神经细胞,购于赛齐(上海)生物有限公司;DON标准品(含量≥99%),购于美国Sigma公司;活性氧(ROS)检测试剂盒,购于碧云天生物技术公司;Trizol RNA提取试剂盒,购于大连宝生物工程有限公司;半胱天冬酶(Caspase)-8抑制剂(FMK),购于凯基(南京)生物技术有限公司;流式Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)试剂盒,购于万类(沈阳)生物科技有限公司;线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1),购于碧云天生物技术有限公司;BIOMIGA SYBR qPCR Mix试剂盒,购于日本Toyobo公司。
1.2 细胞培养与分组仔猪海马神经细胞采用单层贴壁法培养。将仔猪海马神经细胞转移至4 cm×6 cm培养瓶中,用适量的DMEM高糖培养基[100 mL/L胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素和100 g/mL链霉素]在培养条件为37 ℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中进行培养。待细胞覆盖瓶底80%以上后按需传代培养。
将5 mg DON标准品粉末溶于5 mL超纯水中,配成1 000 ng/mL的DON母液备用。
试验分为5个组:0(空白)、250、500、1 000 ng/mL DON组和1 000 ng/mL DON+FMK(FMK终浓度为20 μmol/L)组,每个组均设置3个重复孔。
1.3 细胞凋亡率的检测细胞凋亡率采用Annexin V-FITC/PI试剂盒测定。将处于对数生长期的仔猪海马神经细胞用含0、250、500、1 000 ng/mL DON和1 000 ng/mL DON+20 μmol/L FMK的培养液继续染毒培养24 h,收集细胞并用PBS洗涤2次,向细胞沉淀中加入500 μL binding buffer重悬细胞,依次加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI室温反应15 min后采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.4 线粒体膜电位检测将处于对数生长期的仔猪海马神经细胞用含0、250、500、1 000 ng/mL DON和1 000 ng/mL DON+20 μmol/L FMK的培养液继续染毒培养24 h,收集细胞用PBS洗涤1次,加入1 mL细胞培养液和1 mL JC-1染色工作液,混匀,于37 ℃、5% CO2培养箱中避光孵育20 min后,4 ℃、3 000 r/min离心5 min,收集细胞,JC-1染色缓冲液洗涤2次,用适量JC-1染色缓冲液重悬细胞,流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位,结果以红绿荧光强度比值表示。
1.5 ROS水平检测将处于对数生长期的仔猪海马神经细胞用含0、250、500、1 000 ng/mL DON和1 000 ng/mL DON+20 μmol/L FMK的培养液继续染毒培养24 h,弃去上清,PBS洗涤细胞3次,加入2′, 7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)使其终浓度为10 μmol/L,避光,37 ℃孵育30 min,PBS洗涤3次。胰酶消化30 s后,1 000 r/min离心5 min收集细胞,流式细胞仪检测ROS水平。
1.6 主要凋亡基因mRNA表达量的测定将处于对数生长期的仔猪海马神经细胞用含0、250、500、1 000 ng/mL DON和1 000 ng/mL DON+20 μmol/L FMK的培养液继续染毒培养24 h,Trizol法抽提RNA并测定浓度,使用First Strand cDNA Synthesis Kit将RNA反转录成cDNA。根据GenBank相关序列设计合成目的基因B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、BH3相互作用域死亡激动剂(Bid)、Caspase-2、Caspase-3、Caspase-9以及内参基因18S的引物序列,引物参数见表 1。按照StepOneTM Real-Time PCR System和BIOMIGA SYBR qPCR Mix试剂盒的说明配制实时荧光定量PCR(qRT-PCR)反应液。
采用三步法qPCR程序:预变性(95 ℃ 2 min);PCR反应(95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40个循环);55 ℃ 1 min,55 ℃→98 ℃,每0.01 s升温0.05 ℃,20 ℃ 10 s。目的基因和内参基因18S均在相同条件下进行扩增反应,重复3次。
1.7 数据处理与分析数据采用SPSS 17.0软件中的ANOVA程序进行方差分析,采用LSD法进行显著性检验。运用GraphPad Prism 7.0进行柱状图的绘制。
2 结果与分析 2.1 细胞凋亡率的变化图 1显示,细胞凋亡率随着DON浓度的增加而升高,与空白组相比,250、500 ng/mL DON组细胞凋亡率显著增加(P < 0.05),1 000 ng/mL DON组细胞凋亡率极显著增加(P < 0.01),1 000 ng/mL DON+FMK组凋亡率细胞凋亡率则无显著变化(P>0.05);与1 000 ng/mL DON组相比,1 000 ng/mL DON+FMK组细胞凋亡率极显著降低(P < 0.01)。
图 2中的细胞散点图显示,随着DON浓度的增加,绿色荧光强度逐渐增加,但添加FMK组的绿色荧光强度与空白组相比增加不明显。图 2中的红绿荧光强度比值柱状图显示,与空白组相比,250、500、1 000 ng/mL DON组红绿荧光强度比值极显著下降(P < 0.01);与1 000 ng/mL DON组相比,1 000 ng/mL DON+FMK组红绿荧光强度比值极显著上升(P < 0.01)。
图 3显示,随着DON浓度的增加,ROS水平逐渐增高。与空白组相比,250、500、1 000 ng/mL DON组ROS水平极显著增加(P < 0.01),1 000 ng/mL DON+FMK组的ROS水平增加不显著(P>0.05);与1 000 ng/mL DON组相比,1 000 ng/mL DON+FMK组的ROS水平极显著降低(P < 0.01)。
图 4-A显示,与空白组相比,250、500、1 000 ng/mL DON组Bcl-2 mRNA表达量极显著降低(P < 0.01);与1 000 ng/mL DON组相比,1 000 ng/mL DON+FMK组Bcl-2 mRNA表达量极显著升高(P < 0.01)。与空白组相比,250、500、1 000 ng/mL DON组Bax mRNA表达量极显著升高(P < 0.01);与1 000 ng/mL组相比,1 000 ng/mL DON+FMK组Bax mRNA表达量极显著降低(P < 0.01)。与空白组相比,250 ng/mL DON组Bid mRNA表达量增加不显著(P>0.05),500 ng/mL DON组Bid mRNA表达量显著增加(P < 0.05),1 000 ng/mL DON组Bid mRNA表达量极显著增加(P < 0.01);与1 000 ng/mL DON组相比,1 000 ng/mL DON+FMK组Bid mRNA表达量极显著降低(P < 0.01)。与空白组相比,250 ng/mL DON组Bax/Bcl-2增加不显著(P>0.05),500、1 000 ng/mL DON组极显著增加(P < 0.01);与1 000 ng/mL DON组相比,1 000 ng/mL DON+FMK组Bax/Bcl-2极显著降低(P < 0.01)。
图 4-B显示,与空白组相比,250、500、1 000 ng/mL DON组Caspase-2、Caspase-3 mRNA表达量极显著增加(P < 0.01);250 ng/mL DON组Caspase-9 mRNA表达量增加不显著(P>0.05),500、1 000 ng/mL DON组Caspase-9 mRNA表达量极显著增加(P < 0.01)。与1 000 ng/mL DON组相比,1 000 ng/mL DON+FMK组Caspase-2、Caspase-3和Caspase-9 mRNA表达量均极显著降低(P < 0.01)。
3 讨论研究表明,DON具有广泛的毒性效应,会对消化系统、生殖系统以及免疫系统造成损伤[12-14],且动物的敏感程度具有种属差异性,以猪最为敏感。本试验以仔猪海马神经细胞为研究对象,探讨了DON对仔猪海马神经细胞凋亡的影响以及凋亡与线粒体介导途径的相关性。已知DON能诱导细胞发生凋亡,引发线粒体功能障碍,并且呈现剂量依赖性[15-16]。本试验结果显示,仔猪海马神经细胞的凋亡率随着DON浓度的增加而升高,同时线粒体跨膜电位逐渐下降,提示线粒体介导的凋亡途径可能是DON诱导仔猪海马神经细胞凋亡的机制。
细胞调亡又称程序化死亡,是正常机体细胞内外刺激因子启动的一个主动、有序的过程,受到严格的调控信号调节[17]。引发细胞凋亡的途径有外源性途径与内源性途径,其中内源性途径是受Bcl-2家族因子调控,由促凋亡蛋白Bax激活,刺激线粒体释放细胞色素C(Cyt C),激活Caspase-9,然后触发Caspase-3执行凋亡[18-19]。
Bcl-2蛋白家族主要分布于线粒体膜外,细胞的凋亡与否主要由家族成员中的促凋亡基因Bax与抗凋亡基因Bcl-2的比值决定[20]。这些基因是细胞凋亡的中枢调控因子,上调或下调Bcl-2蛋白家族成员可激活细胞内凋亡信号级联,导致细胞凋亡[21]。Bcl-2蛋白能够稳定线粒体膜完整性,抑制线粒体释放凋亡诱导因子(AIF)和Cyt C,具有抗凋亡功能[22]。Bax是Bcl-2蛋白家族中的一员,既可以形成同聚体促进凋亡,也可以与Bcl-2结合,从而抑制Bcl-2的抗凋亡作用。Bid蛋白也是Bcl-2蛋白家族中促凋亡类蛋白,当细胞暴露于凋亡诱导因子的环境中,可被Caspase-8酶切调控,进而诱导Cyt C从线粒体内释放,从而起到促凋亡作用[23]。在本试验中,Bax与Bid mRNA表达量随着DON浓度的增加而增加,在DON浓度为1 000 ng/mL时极显著增加;而Bcl-2 mRNA表达量随着DON浓度的增加而降低,在DON浓度为1 000 ng/mL时降低极显著。与1 000 ng/mL DON组相比,1 000 ng/mL DON+FMK组仔猪海马神经细胞的凋亡基因表达变化相反,这些数据表明DON通过调节Bcl-2、Bax和Bid表达诱导仔猪海马神经细胞凋亡,Bcl-2、Bax和Bid在DON诱导仔猪海马神经细胞凋亡中起重要作用。
在细胞凋亡的信号传递中,Caspase家族居于重要地位。正常条件下Caspase都是以Caspase前体的形式存在,当细胞受到起始凋亡信号刺激时,Caspase被逐级水解而激活[24]。激活的Caspase可以诱导细胞发生凋亡,最终导致细胞皱缩、断裂,染色质聚集,DNA损伤等。多数的Caspase与细胞凋亡有关,其中细胞凋亡的起始者Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10可以通过介导相应的凋亡信号启动细胞凋亡,被称为启动性Caspase;下游的执行者Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7被活化后可破坏细胞结构完整性,被称为效应性Caspase[25]。
当Bax/Bcl-2升高,可引起线粒体膜通透性改变,线粒体释放Cyt C,由Cyt C激活Caspase-9,并进一步激活Caspase级联反应,活化Caspase-3,最终引起细胞凋亡。Caspase-9位于级联反应的最上游,是细胞线粒体依赖的凋亡途径中最重要的起始因子。当细胞接收到凋亡刺激信号时,线粒体释放Cyt C与凋亡蛋白酶活化因子-1(Apaf-1)及Caspase-9前体相结合,形成“凋亡体”,共同激活Caspase-9,并顺序激活下游Caspase最终引起细胞损伤,导致细胞凋亡[26]。Caspase-3在细胞凋亡过程中起非常重要的作用,活化后的Caspase-3会使细胞DNA断裂、染色质凝聚,并生成凋亡小体[27]。在本研究中,随着DON浓度的增加,Caspase-2、Caspase-9和Caspase-3 mRNA表达量增加,在DON浓度为1 000 ng/mL时增加极显著;与1 000 ng/mL DON组相比,1 000 ng/mL DON+FMK组仔猪海马神经细胞Caspase-2、Caspase-9和Caspase-3 mRNA表达量极显著降低,提示Caspase-2、Caspase-9和Caspase-3参与了DON诱导仔猪海马神经细胞的凋亡。
线粒体不仅为细胞生命活动提供能量,而且还在细胞凋亡过程中起到关键的调控作用。线粒体跨膜电位的改变在细胞凋亡过程中起重要作用,线粒体跨膜电位一旦耗散,细胞将进入不可逆的凋亡过程[28]。在细胞凋亡过程中线粒体跨膜电位的耗散主要是由于线粒体内膜的通透性转变,这是由于生成了动态的线粒体通透性转变孔道(PT孔道)。凡是能够作用于线粒体诱导孔道生成的物质都能引起细胞凋亡,如钙离子(Ca2+)内流增加、氧化应激等因素可以直接导致孔道的开放和线粒体膜间内容物的释放,导致线粒体功能紊乱,从而启动死亡程序[29]。过量的ROS能够对线粒体造成损伤,激活线粒体依赖性凋亡途径中的分子信号,包括PT孔道开放、线粒体膜电位降低以及线粒体物质(Cyt C)的释放,进而导致细胞凋亡。有研究表明,ROS通过上调Bax基因和下调Bcl-2基因的表达而激活线粒体凋亡通路,ROS水平的升高能导致线粒体功能停滞,进而诱导凋亡的发生[30]。本试验结果显示,DON能够诱导仔猪海马神经细胞生成过量的ROS,且ROS水平随着DON浓度的增加而升高,提示过量的ROS会加剧线粒体介导的细胞凋亡。
4 结论DON可诱导仔猪海马细胞凋亡,引起仔猪海马细胞生成过量的ROS,并导致仔猪海马细胞线粒体膜电位降低。DON可抑制线粒体相关抗凋亡基因Bcl-2的表达,刺激促凋亡基因Bax和Bid的表达,并上调凋亡相关基因Caspase-2、Caspase-3和Caspase-9的表达,表明DON可通过线粒体途径诱导仔猪海马神经细胞凋亡。
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