紫花苜蓿(Medicago sativa L.)产量高、适应性强、营养价值较高，是畜禽饲粮中常用的优质豆科牧草，国内外广泛种植，其蛋白质含量较高，同时含有多种生物活性物质，具有提高畜禽生产性能和改善畜产品品质等功效^[1-3]。苜蓿干草是在苜蓿产量和质量均佳的时期刈割，经自然晾晒或人工干燥调制而成的优质饲草，是反刍动物必不可少的饲草，也是支撑奶业发展的基础，其品质的优劣直接影响到奶牛的产奶量及健康状况^[4]。评价苜蓿干草品质的指标主要有粗蛋白质(crude protein, CP)、中性洗涤纤维(neutral detergent fiber, NDF)、酸性洗涤纤维(acid detergent fiber, ADF)含量等常规营养指标，传统的饲料检测手段(CP含量：凯氏定氮法；NDF和ADF含量：Van Soest洗涤纤维分析方法等)需要消耗大量的人力、财力和物力，且分析过程中使用的化学试剂会对环境造成一定的污染，因此，寻求一种快速简便、无污染的检测方法来替代传统测定方法用以评价苜蓿干草品质是非常必要的。

近红外光谱技术(near infrared reflectance spectroscopy, NIRS)具有分析速度快和分析效率高(多种预设指标同时快速检测)、不需要前处理和破坏样品、不需要化学试剂、方便大批量样品测定等优点，被广泛应用于多个行业^[5]。其中，NIRS在饲料检测方面也取得了一定的成果，GB/T 18868—2002规定了饲料原料和配合饲料中水分、CP含量等指标的近红外测定方法，近年来，国内外学者也将NIRS应用到苜蓿干草、青贮苜蓿以及草颗粒等苜蓿产品营养成分含量的检测中^[6-10]，且取得了较好的效果，但这些试验研究的材料大多选自试验田或集中在某几个苜蓿品种中，针对奶牛场和牧草企业一线生产基地苜蓿干草的近红外预测模型的研究鲜有文献报道。因此，本试验对一线生产基地的265个苜蓿样品进行了常规营养成分含量测定和近红外光谱扫描，拟建立苜蓿干草中CP、NDF、ADF、干物质(dry matter, DM)和粗灰分(Ash)含量这5个指标的近红外预测模型，旨在为生产一线利用NIRS快速准确评价苜蓿干草品质提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法 1.1 样品的采集与制备

265个苜蓿干草草捆样品在2016年8月至2017年8月采集于9个省份。河南省为主要采集地，共采集214个样品，来源分别为奶牛场、牧草企业和河南农业大学试验田，其中进口苜蓿和国产苜蓿均为107个；其他8个省份采集的51个样品均来源于牧草企业的国产牧草，采集个数分别为：宁夏回族自治区10个、甘肃省9个、内蒙古自治区9个、河北省8个、山西省5个、黑龙江省4个、新疆维吾尔族自治区3个、山东省3个。取样时，使用干草取样器(美国，Dewait)多点取样，具体步骤参照《饲草产品抽样技术规程》(NY/T 2129—2012)进行。采集的苜蓿干草先切成1 cm左右的草段，然后用植物粉碎机粉碎，过0.425 mm筛，粉碎后的样品分为3份，一份用于常规营养成分含量测定，一份用于近红外光谱扫描，一份用于留样备用。

1.2 苜蓿干草常规营养成分含量的测定

DM含量按照GB/T 6435—2014方法测定；CP含量按照GB/T 6432—2018方法测定(FOSS-8400全自动凯氏定氮仪)，NDF和ADF含量按照Van Soest洗涤纤维分析方法测定(Sennen-F10型自动纤维分析仪、Ankom-F57滤袋)^[11]；Ash含量按照GB/T 6438—2007方法测定。

1.3 苜蓿干草的近红外分析 1.3.1 苜蓿干草的近红外光谱采集

近红外仪器为美国Unity Scientific公司生产的SpectraStat 1 400 XL3光谱仪，其扫描谱区波长为1 400~2 500 nm(波数为7 143~4 000 cm^-1)，波长间隔1 nm，光学带宽10 nm，光谱扫描次数为24次。样品扫描前，仪器预热60 min左右并进行校准。扫描时取50 g左右粉碎好的苜蓿样品反复混匀后装入直径为10 cm的石英样品杯中(装填量为样品杯的2/3)，轻轻摇匀使表面平整后放置在光谱仪上进行扫描，每个苜蓿样品重复装样扫描3次，3次装载的样品量、密实程度尽可能保持一致，取3次光谱的平均光谱为该样品光谱。265个苜蓿干草样品的近红外原始光谱图见图 1，苜蓿干草样品的近红外光谱存在多个吸收峰，为其常规营养成分含量的定量分析提供了丰富的信息。

1.3.2 苜蓿干草样品集的划分

265个苜蓿干草样本采用浓度梯度法^[12]，按照样本集每个指标化学分析值的大小进行排序，隔3选1，选出199个样本作为校正集，其余的66个作为验证集。

1.3.3 苜蓿干草近红外预测模型的建立和验证

利用Ucal软件(Unity Scientific公司)对光谱进行数据分析，采用偏最小二乘法(partial least squares, PLS)建立定标模型。定标前，通过光谱散射校正和导数处理相结合的方法对原始光谱进行预处理以选出最优的定标模型。光谱散射校正方式4种：无散射(None)、标准正态变量校正(standard normal variate transformation, SNV)、去趋势校正(Detrend)和标准正态变量校正结合去趋势校正(SNV+detrend)，导数处理方式10种：1, 4, 4, 1、2, 4, 4, 1、1, 8, 8, 1、2, 8, 8, 1、1, 10, 10, 1、2, 10, 10, 1、1, 12, 12, 1、2, 12, 12, 1、1, 16, 16, 1和2, 16, 16, 1。在定标过程中，通过全局距离(GH≥3)和“T”检验(T＞2.5)剔除异常数值。模型建立后，通过定标决定系数(coefficient of determination for calibration, R_cal²)、交互验证决定系数(coefficient of determination for cross-validation, 1-VR)、定标标准偏差(standard error of calibration, SEC)、交互验证标准误差(standard error of cross-validation, SEC_V)的高低选择最优模型预处理方式，其中R_cal²、1-VR越接近1、SEC和SEC_V越低说明模型越好，其中1-VR和SEC_V更为重要^[13]。

最优定标模型确定后，通过预测决定系数(coefficient of determination for validation, RSQ_V)和预测相对分析误差(ratio of performance to deviation for validation, RPD_V，RPDV=SD/SEP)对最优定标模型进一步评价，RSQ_V越接近1，说明模型的预测性能越好。实际生产中，常设定当RSQ_V＞0.80时，定标模型可以用于实际检测；当0.66≤RSQ_V＜0.80时，定标模型可以用于粗略预测；当RSQ_V＜0.66时，模型不能用于实际检测^[14]。关于RPD_V，不同的行业、不同的研究者设定的参考范围略有不同。在饲料行业，当RPD_V≥2.5时，定标模型可用于实际检测；当2.0≤RPD_V＜2.5时，定标模型可用于样品的粗略筛选；当RPD_V＜2.0时，定标模型的使用受到限制^[15-16]。

2 结果与分析 2.1 苜蓿干草常规营养成分含量测定结果

苜蓿干草校正集和验证集DM、CP、NDF、ADF和Ash含量分布及分集情况见表 1。可以看出，DM、CP、NDF、ADF和Ash含量的变化幅度都相对较大，且校正集和验证集的最大值、最小值、平均值和标准差都比较接近，同时验证集的最大值和最小值均在校正集的范围内，能满足建立模型的需要。

2.2 苜蓿干草近红外预测模型的建立和优化

利用Ucal分析软件分别对DM、CP、NDF、ADF和Ash含量这5个指标进行4种光谱散射校正和10种导数处理后，以最高的1-VR和最低的SEC_V为选择参数的依据，5个指标最终的优化参数及定标结果见表 2。由表可知，虽然化学指标不同，其光谱预处理方式及定标结果存在着一定的差异，但5个指标的R_cal²和1-VR都相对较高，均在0.82以上。其中，CP含量的光谱预处理参数为SNV和2, 12, 12, 1时的R_cal²和1-VR最高，分别为0.975和0.961，SEC和SEC_V的数值也相对较低，分别为0.496和0.595；其次为DM含量，当光谱预处理方式为Detrend和1, 8, 8, 1时，R_cal²和1-VR分别为0.970和0.950，SEC和SEC_V的数值为5个指标中最低，分别为0.270和0.340；NDF、ADF和Ash含量的R_cal²和1-VR相对较低、SEC和SEC_V相对较高，当光谱预处理方式分别为None和1, 16, 16, 1、Detrend和1, 12, 12, 1、Detrend和1, 10, 10, 1时，R_cal²和1-VR分别为0.863和0.827、0.855和0.822、0.871和0.821，SEC和SEC_V分别为1.894和2.046、1.624和1.755、0.537和0.618。

2.3 苜蓿干草近红外预测模型的外部验证

苜蓿干草DM、CP、NDF、ADF和Ash含量的定标模型建立后，用验证集样品对这5个指标的最优定标模型进行外部验证，预测结果见表 3。由表可以看出，DM、CP、NDF、ADF和Ash含量的化学测定平均值与近红外预测平均值差异不大；5个指标中，除了Ash含量外，DM、CP、NDF、ADF含量的RSQ_V数值分别为0.926、0.960、0.864、0.864，RPD_V数值分别为3.708、4.934、2.728、2.652，RSQ_V均大于0.80、RPD_V均大于2.50，说明DM、CP、NDF和ADF含量这4个指标的定标模型可以用于实际检测，Ash含量的RSQ_V和RPD_V分别为0.793和2.102，分别低于0.80和2.50，说明Ash含量的定标模型仅能用于粗略预测。苜蓿干草5个常规营养成分含量的化学测定值和预测值的相关关系见图 2。

3 讨论

近年来，随着消费者对牛奶质量要求的不断提高，紫花苜蓿在高产奶牛养殖过程中的作用日益突出，高品质苜蓿干草的需求量不断增加，利用NIRS快速准确测定苜蓿干草品质引起了国内外学者的关注。Norris等^[17]首次以苜蓿、高羊茅等牧草为研究对象，将NIRS应用于牧草品质的测定，证实了利用NIRS快速评估牧草品质的可能性。关于NIRS在苜蓿品质方面的检测，国内外学者进行了大量的研究，所涉及的指标有：常规营养成分含量^{[7-8, 18-19]}、秋眠性^[20]、麦角固醇含量^[21]以及矿物元素含量^[22]等方面，其中营养成分含量测定是应用最广泛且效果较好的指标，应用NIRS，高燕丽等^[18]建立了CP、ADF和NDF含量，聂志东等^[19]建立了CP、Ash、NDF、ADF和酸性洗涤木质素(ADL)含量，尚晨等^[23]建立了CP和粗纤维(CF)含量以及肖红等^[24]建立了Ash含量的预测模型，且均取得了较好的效果，其RSQ_V均大于0.90；但也有文献报道，利用NIRS建立的预测模型中，Ash、ADF以及NDF含量等指标的预测效果低于其他指标，产生不同结果的原因可能与所用样本的来源及状态、建模样本的数量、近红外光谱仪的灵敏度以及化学测定的准确度等因素有关^[25]。

本试验所用的265个苜蓿干草样品采自不同省份(9个省份，主要采集地为河南)、不同来源(国产和进口)的苜蓿干草，采集地主要集中于奶牛场和牧草企业一线生产基地，样品来源分布较广，DM、CP、NDF、ADF和Ash 5个常规营养成分的含量变化较大，样品具有较广的代表性。在利用NIRS对苜蓿干草样品DM、CP、NDF、ADF和Ash含量进行定标和验证中，其结果存在一定的差异，原因可能与这些物质本身的化学结构以及测定方法的准确度和精确度存在一定的关系^[26]，因为近红外光谱是依据有机物中的含氢集团(O—H键、C—H键和N—H键等)对近红外光的吸收所形成的，物质的结构越简单，越容易形成明显的吸收光谱，定标效果越好，另外，NIRS属于典型的间接分析技术，其结果的准确性和常规测定方法的准确性和精密度有关。本试验中，CP含量的模型效果最好，这与聂志东等^[7]结论一致，CP含量模型较好的原因可能有2个方面：一方面，蛋白质、氨基酸等含氮化合物的主要官能团为N—H键等含氢集团，其在近红外光谱区大量出现会产生较强的吸收峰，从而获得较好的定标效果；另一方面，测定CP化学值的仪器采用的是FOSS-8400全自动凯氏定氮仪，其准确性和精确性可能高于其他指标^[27]。另外，本试验中，NDF和ADF含量的定标效果略低于CP含量，其原因可能在于组成NDF和ADF的纤维素、半纤维素和木质素等物质的内部结构比较复杂，这些复杂的结构可能会使NDF和ADF含量模型的准确性低于其他简单的含氢化合物；另外，NDF和ADF含量检测方法的误差可能也大于CP含量，这也会影响模型的准确性^{[7, 23]}。在所测定的5个指标中，Ash含量的定标及验证效果最差，这可能与Ash不含H键，其无机成分在近红外光谱区没有特征的吸收光谱，而是通过和其他有机物结合成复合物进行间接测定，这种间接的定标方法可能会降低Ash含量的定标及验证结果，使实际预测效果不稳定^{[16, 28]}。

4 结论

本试验利用NIRS建立了苜蓿干草DM、CP、NDF、ADF和Ash含量这5个指标的近红外预测模型。其中DM、CP、NDF和ADF含量的RSQ_V均大于0.80、外部验证RPD_V均大于2.50，可用于实际测定；而Ash含量的RSQ_V和RPD_V分别低于0.80和2.50，模型预测效果不太理想，仅能用于粗略预测。