近年来，天然中草药饲料添加剂因没有抗生素类药物的一些普遍弊病而逐步被人们所重视，促使着饲料添加剂由化工型逐渐向中草药型转变。但是，中草药作为饲料添加剂，其有效成分功效不明确，作用机理研究不充分，进而影响着中草药提取物发挥更高效作用[1]。因此，了解中草药有效成分在生物体内的功效成为研发高效绿色中草药饲料添加剂的切入点。杜仲(Eucommia ulmoides)是我国特有经济树种，具有抗菌、抗病毒、抗氧化和保肝护肾等作用[2-3]，其有效成分作为饲料添加剂已有研究[4-5]。芦丁(rutin)是杜仲中一种重要黄酮类物质，其在杜仲叶中的含量可达到2%，若以杜仲叶作为饲料添加剂，则需了解芦丁在动物体内的作用。芦丁具有清除自由基、抗氧化、保肝护胆和提高免疫力等作用[6-8]，其作为饲料添加剂在银鲶(Rhamdia quelen)[9]、罗非鱼(Oreochromis niloticus)[10]、中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)[11]等上已有初步探究，目前芦丁作为饲料添加剂的研究主要集中在体内生理生化反应，而对机体生长性能、体成分以及组织器官响应的研究甚少。草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国淡水养殖四大家鱼之一，其具有生长迅速、饲料来源广、肉质鲜嫩等特点，因此深受人们的喜爱。本试验以草鱼为对象，系统研究芦丁对草鱼生长、体成分、非特异性免疫力和肠道消化酶活性的影响，明确芦丁在草鱼饲料中的适宜添加剂量及其功效，为杜仲的高效利用提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料本试验所用草鱼幼鱼购自于陕西省咸阳市眉县渔场；芦丁购自上海源叶有限公司，芦丁有效含量为97%。
1.2 试验饲料选用豆粕、棉籽粕、菜籽粕、鱼粉为主要蛋白质源，豆油为主要脂肪源，配制基础饲料。在基础饲料中分别加入有效含量为0(对照)、97.4(低剂量)、388.4 mg/kg(高剂量)的芦丁(芦丁添加剂量参考郑尧等[10])，以微晶纤维素调平，配成3种等氮等能试验饲料。试验饲料组成及营养水平见表 1。各种饲料原料经粉碎过筛后，按照配方称取各原料，搅拌混匀，制成直径为2 mm的颗粒饲料，风干后4 ℃冰箱保存备用。
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表 1 试验饲料组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) |
水产箱(670 mm×480 mm×440 mm)以高锰酸钾浸泡，试验鱼以1%的食盐水消毒5~10 min。将购置的草鱼幼鱼暂养于室内水产箱中，试验用水为充分曝气(24 h)的自来水。选择体表观察良好、体重为(5.10±0.17) g的草鱼幼鱼135尾，随机分为3组，每组3个重复，每个重复15尾，对照组饲料驯化1周后开始正式试验，试验期为56 d。试验期间每日投喂时间为08:00、12:00、16:00，投喂量为鱼体重的2%~4%，投喂饲料1 h后清除残饵和粪便，换1/3体积水。每日检测水温、水质，试验期间水温24~28 ℃，溶氧含量>6.0 mg/L，氨氮含量＜0.2 mg/L，pH 7.2~7.4，每日光照12 h，光照灯为日光灯。
1.4 样品采集养殖试验结束前禁食1 d，MS-222麻醉，每个重复随机抽取2尾鱼，保存于-20 ℃冰箱，用于体成分的测定；每个重复随机抽取3尾鱼测量体重、体长后在冰盒上解剖，取内脏，分离肝脏、肠道等，用于形体指标的检测；肝脏、前肠称重后以塑封袋保存于-20 ℃冰箱用于相关酶活性的测定。采样后准确称量剩余鱼总重，随机抽取3条尾鱼，鳍静脉采血，采集的血样4 ℃静置过夜后3 500 r/min离心10 min，取上清液，用于血清生化指标的检测。
1.5 指标测定 1.5.1 生长性能和形体指标按照如下公式计算各生长性能和形体指标：
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式中：Wt为终末均重(g)；W0为初始均重(g)；t为饲养天数(d)；F为摄食饲料总重量(g)；L为体长(cm)；Wv内脏重(g)；Wh肝脏重(g)；Wi为肠道重；W为体重(g)。
1.5.2 常规营养成分含量饲料、全鱼中水分含量采用105 ℃烘箱干燥法(GB 5009.3—2016)测定，粗蛋白质含量采用凯氏定氮法(GB 5009.5—2016)测定，粗脂肪含量采用索氏提取法(GB 5009.6—2016)测定，粗灰分含量采用550 ℃马弗炉高温灼烧法(GB 5009.4—2016)测定。其中，全鱼粗蛋白质含量是以干重为基础测定，粗脂肪、粗灰分、水分含量是以湿重为基础测定。
1.5.3 非特异性免疫指标肝脏与血清超氧化物歧化酶(SOD)活性采用微板法测定，碱性磷酸酶(AKP)活性采用微量酶标法，溶菌酶(LZM)活性采用比浊法；肝脏过氧化氢酶(CAT)活性采用可见光法测定，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定；血清总蛋白(TP)含量采用考马斯亮蓝法测定，白蛋白(ALB)含量采用微量酶标仪法测定，球蛋白(GLB)含量为TP含量与ALB含量的差值。上述指标测定所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
1.5.4 肠道消化酶活性肠道淀粉酶(AMS)活性采用碘-淀粉比色法测定，脂肪酶(LPS)活性采用比浊法测定，胰蛋白酶(PRS)活性采用比色法测定。上述指标测定所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
1.6 数据处理试验数据采用SPSS 19.0软件的单因素方差分析(one-way ANOVA)进行处理，并采用LSD法多重比较组间差异显著性，数据以平均值±标准差(mean±SD)形式表示，显著水平为P＜0.05。
2 结果与分析 2.1 芦丁对草鱼生长性能和形体指标的影响如表 2所示，与对照组相比，饲料中添加97.4、388.4 mg/kg芦丁可以降低草鱼的HSI，提高ISI，且高剂量组草鱼的HSI以及低剂量组草鱼的ISI与对照组的差异均达到显著水平(P＜0.05)；此外，饲料中添加97.4、388.4 mg/kg芦丁还可以显著降低草鱼的VSI(P＜0.05)。饲料中添加不同剂量的芦丁对草鱼WGR、FCR、SGR和CF的影响不显著(P>0.05)。
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表 2 芦丁对草鱼生长性能和形体指标的影响 Table 2 Effects of rutin on growth performance and physical indices of grass carp |
如表 3所示，与对照组相比，饲料中添加97.4 mg/kg芦丁可以显著提高草鱼全鱼粗蛋白质含量(P＜0.05)。各组草鱼全鱼水分、粗脂肪、粗灰分含量差异不显著(P>0.05)。
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表 3 芦丁对草鱼体成分的影响 Table 3 Effects of rutin on body composition of grass carp |
如表 4所示，与对照组相比，饲料中添加97.4 mg/kg芦丁可以显著提高草鱼肝脏中SOD活性(P＜0.05)；饲料中添加97.4和388.4 mg/kg芦丁可以显著降低肝脏中MDA含量(P＜0.05)，且呈剂量效应；饲料中添加388.4 mg/kg芦丁可以显著提高肝脏中CAT活性(P＜0.05)；芦丁对草鱼肝脏中AKP活性的影响与添加剂量呈正相关，高剂量的芦丁可以显著提高肝脏中AKP活性(P＜0.05)；饲料中添加97.4和388.4 mg/kg芦丁可以显著提高肝脏中LZM活性(P＜0.05)。芦丁可以提高草鱼血清中LZM活性，且呈剂量效应，高剂量组显著高于对照组(P＜0.05)；低剂量芦丁对草鱼血清中AKP活性有一定的提高作用，但高剂量芦丁则对草鱼血清中AKP活性有抑制作用，表现为高剂量组显著低于对照组和低剂量组(P＜0.05)；各组血清SOD活性以及TP、ALB和GLB含量无显著差异(P>0.05)。
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表 4 芦丁对草鱼非特异性免疫指标的影响 Table 4 Effects of rutin on non-specific immune indices of grass carp |
如表 5所示，与对照组相比，饲料中添加芦丁可以提高肠道AMS活性，且低剂量组与对照组的差异达到显著水平(P＜0.05)；高剂量芦丁对肠道PRS活性有抑制作用，表现为高剂量组PRS活性较对照组显著降低(P＜0.05)，而低剂量组则与对照组差异不显著(P>0.05)；各组草鱼肠道LPS活性无显著差异(P>0.05)。
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表 5 芦丁对草鱼肠道消化酶活性的影响 Table 5 Effects of rutin on intestinal digestive enzyme activities of grass carp |
芦丁是杜仲叶中重要的黄酮类物质，关于黄酮类物质对动物生长作用的研究结果并不一致。研究表明，大豆黄酮可升高体内睾酮与垂体生长激素的水平，添加到饲料中显著提高奥利亚罗非雄鱼(Oreochromis aureus)的WGR和SGR[12]；槲皮素可显著提高橄榄比目鱼(Paralichthys olivaceus)的WGR[13]。而杨继华等[14]的研究表明，桑叶黄酮对吉富罗非鱼的生长性能无显著影响，并且认为桑叶黄酮类化合物中无大豆黄酮和异黄酮类植物激素，不具备促进罗非鱼生长的效果。本研究中，芦丁对草鱼WGR、SGR、FCR和CF的影响不显著，这表明芦丁没有促草鱼生长的功效。研究表明多种中草药饲料添加剂及其有效成分具有促生长的效果[4, 15-16]，而本试验证明了芦丁并不是中草药中促生长的有效成分。芦丁对草鱼无促生长效果的原因可能是因为黄酮类物质的促生长效果因动物种类、黄酮种类、黄酮来源而异[9, 12-13]。
肠道是消化器官，ISI常被用作衡量肠道消化吸收能力的指标之一。已有研究表明，苜蓿黄酮可提高扬州鹅肠道长度、重量，促进扬州鹅肠道的发育[17]；大豆黄酮可促进大菱鲆幼鱼肠道的生长和发育，适宜添加剂量的大豆黄酮可以提高大菱鲆幼鱼肠绒毛长度，保护肠道结构完整性[18]。本试验结果显示，低剂量的芦丁可以显著提高草鱼的ISI，说明适宜添加剂量的芦丁可提高草鱼肠道的消化吸收能力。芦丁在肠道中不能直接被消化吸收，芦丁对草鱼ISI的提高可能是因为肠道需增强消化吸收能力，使芦丁在肠道中被分解成槲皮素发挥其功效[19]。本研究中，饲料中添加芦丁还可以降低草鱼的HSI和VSI，这与杨继华等[14]在桑叶黄酮对吉富罗非鱼影响的研究中所得结果相似。肝脏是营养物质储存器官，当营养物质过剩时会在肝脏中储存[20]，而黄酮物质可以调节营养物质在肝脏的储存[21]。本试验中，芦丁对ISI及肠道消化酶活性的提高促进了肠道对营养物质的消化吸收，减少了肝脏中营养物质的储存，因而降低了草鱼的HSI。
黄酮类物质对营养物质含量的影响结果不一。研究发现，芦丁可降低奶牛乳脂率，但对乳蛋白率、乳糖率无显著影响[22]；大豆黄酮可显著降低大菱鲆(Scophthalmus maximus)幼鱼全鱼粗蛋白质、粗脂肪含量[18]。本研究中，芦丁可以提高全鱼粗蛋白质含量，且低剂量组与对照组的差异达到显著水平，但对粗脂肪、水分、粗灰分含量无显著影响。黄酮类物质对脂肪酸的促分解作用会降低蛋白质作为能源的比例[21, 23]，这可能是芦丁提高全鱼粗蛋白质含量的原因。
3.2 芦丁对草鱼非特异性免疫力的影响SOD、CAT是机体抗氧化系统的重要抗氧化酶，是ROS的清除剂，可作用于过氧化氢(H2O2)和超氧阴离子自由基(O2-·)。MDA是脂质过氧化的最终产物，MDA含量降低表明降低了脂质过氧化对机体造成的损伤。SOD活性提高可以增强吞噬细胞的活性[24]，AKP是巨噬细胞内溶酶体的标志酶，常作为重要的生理指标检测。LZM是机体非特异性免疫因子之一，可以维持机体防御与非特异性免疫的平衡，在鱼体抵御病害过程中起到积极作用。血清TP与机体免疫密切相关，可分为ALB和GLB 2种，ALB与生物体物质运输、营养等密切相关；GLB是由免疫器官产生、浆细胞分泌，可评价机体抵抗力。饲料中添加芦丁有提高动物体免疫力的效果。Pês等[9]将芦丁补充到银鲶的饲料中，银鲶肝脏SOD、CAT活性得到提高；郭旭东等[25]在对大鼠的研究中发现，芦丁能促进雌性青春期大鼠、泌乳大鼠免疫器官发育；Hsieh等[26]研究发现，接种一定量芦丁可以提高溶藻弧菌攻击下的对虾的免疫力，降低对虾的应激反应；Bae等[11]研究发现，芦丁可以通过略微下调中国对虾酚氧化酶mRNA的表达，上调脂多糖-β-1, 3-葡聚糖结合蛋白mRNA的表达，提高中国对虾的免疫力。
本研究中，饲料中添加芦丁可以提高草鱼肝脏中SOD、CAT、AKP、LZM活性，降低MDA含量；增强草鱼血清中LZM活性，对血清中AKP活性具有双向调节的作用，低剂量促进，高剂量抑制，对血清SOD活性的影响不显著。此结果表明适宜添加剂量的芦丁可增强草鱼的非特异性免疫力，芦丁可能是中草药中提高免疫力的重要成分。芦丁提高机体非特异性免疫力的原因可能是鱼类非特异性免疫因子会因机体接触抗原性物质或者免疫刺激剂而上升[27]，芦丁添加到草鱼饲料中起到了免疫刺激剂的作用。而对于肝脏、血清等组织器官间SOD、LZM、AKP活性的差异性，可能是因为酶蛋白在不同组织中表达量不一致[28-29]。本研究中不同添加剂量的芦丁对草鱼血清中TP、ALB、GLB含量均无显著影响，但随着芦丁添加剂量的增加，血清中ALB含量有逐渐降低的趋势，高剂量芦丁的添加具有提高血清中GLB含量的趋势，进一步表明芦丁具有提高草鱼非特异性免疫力的作用。芦丁对草鱼血清中ALB、GLB含量的影响，可能与芦丁进入生物体后与血清ALB稳定结合，由血清ALB运输、转运，对血清ALB的二级、三级结构造成破坏有关[30]，此种结构破坏减少了ALB含量，相对提高了GLB含量，但本研究中血清中ALB、GLB含量变化不显著，具体机制仍需进一步研究。
3.3 芦丁对草鱼肠道消化酶活性的影响肠道消化酶活性是衡量鱼体对饲料消化、吸收、利用的重要指标，消化酶活性的高低反映了鱼体对营养物质利用能力的大小。王斯慧等[31]、胡小松等[32]的研究均表明，芦丁可对AMS产生抑制作用；邓静等[33]的研究显示，芦丁可与PRS结合，使PRS构象发生改变，影响PRS的生物学功能；郭旭东等[34]的研究显示，芦丁可显著降低奶牛瘤胃蛋白酶活性，但对AMS活性无显著影响，由此可见，芦丁可以通过改变消化酶活性来影响肠道消化吸收能力。本研究发现，饲料中添加芦丁可以提高草鱼肠道AMS活性，对PRS活性具有低剂量促进高剂量抑制效果，对LPS活性无显著影响，可见芦丁具有促进草鱼肠道消化吸收的作用，低剂量添加效果更优。关于芦丁提高草鱼肠道消化吸收能力的原因可能是草鱼需提高ISI、促进消化酶的分泌来满足各肠段对芦丁的吸收[19]，而添加高剂量芦丁后肠道AMS、PRS活性的降低可能是芦丁与酶蛋白结合，引起构象改变，从而改变酶活性[31-32]。
4 结论综上所述，芦丁具有影响机体非特异性免疫力和肠道消化吸收能力的作用；以生长性能为基础，综合考虑体成分、非特异性免疫力、肠道消化酶活性等指标，芦丁在草鱼饲料中适宜低剂量添加。
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