反刍动物的瘤胃在消化过程中会产生大量甲烷[1],2015年我国反刍动物甲烷排放量为10.2 Tg,占农业生产甲烷排放量的50%,占人为甲烷排放总量的20.5%[2]。甲烷的生成会造成饲料能量的浪费,损失量约占食入代谢能的3.9%~10.7%[3]。甲烷既作为主要温室气体,导致全球变暖,又作为瘤胃能量流失的途径,严重影响饲料的能量利用率。因此,如何减少瘤胃甲烷排放成为了目前的研究热点。笔者将目前降低甲烷排放的方法总结为三大类,即降低瘤胃氢气生成、降低产甲烷菌的数量与活性及添加其他耗氢化合物。本文将综述瘤胃甲烷生成的机理和调控途径,并着重阐述添加耗氢化合物对降低甲烷排放及瘤胃菌群的影响,为实现反刍动物甲烷减排与改善瘤胃发酵提供技术依据。
1 瘤胃甲烷生成的机理反刍动物瘤胃内存在着复杂的微生物发酵系统,不同微生物种群共同作用,协助动物体对纤维素、非蛋白氮等物质的利用。但瘤胃微生物在利用结构性碳水化合物时会产生的大量氢气,若氢气不断积累,则会抑制瘤胃微生物的正常活动,使瘤胃发酵受阻[4]。产甲烷菌作为瘤胃内主要的氢利用菌,可迅速利用氢气将二氧化碳转化为甲烷,并通过嗳气排出体外,由此降低瘤胃内氢分压,解除氢气的抑制作用[5]。若能干预和调控瘤胃甲烷生成的任意一个环节,就能达到降低甲烷排放的目的。
2 调控瘤胃甲烷生成的途径目前研究降低瘤胃甲烷生成的方法从目的上看可分为三大类,即降低氢气生成、抑制产甲烷菌活动、添加耗氢化合物并增加耗氢微生物活性。
2.1 降低瘤胃氢气生成瘤胃微生物在消化利用粗饲料时主要进行乙酸发酵,此途径会产生氢气,随着粗饲料比例的升高,氢气产量增加,使甲烷产生增多。孙德成等[6]使用不同精粗比的全混合日粮饲喂荷斯坦奶牛,发现随精料比例的升高,乙酸浓度及乙酸与丙酸比值逐渐降低,甲烷的释放量也显著降低,崔安等[7]、周艳等[8]、丁静美等[9]的试验均得到相同的结果。但因精料比例过高会引起瘤胃酸中毒,实际生产中需结合生产成本,选择合适的精粗比,虽不能使甲烷生成完全停止,但能在一定程度上降低甲烷生成。
2.2 降低产甲烷菌的数量和活性抑制产甲烷菌活性的方法是近些年研究的热点方向,主要分为2种方法:一是通过使用抗生素等方法来直接抑制产甲烷菌的数量和活性[10-11];二是通过驱除原虫间接性的减少产甲烷菌的数量[12]。大部分体外与体内试验表明,此类方法能在短时间内大幅度减少甲烷生成,但长期试验会使瘤胃产生适应性,使降低甲烷生成的效果变差[13-14]。产生这种结果的原因可能是瘤胃内复杂的微生物群落存在自我调节能力,此类方法只减少产甲烷菌的活性,却未减少氢气生成量,使氢分压上升,抵消了对产甲烷菌的抑制效果。
2.3 添加耗氢化合物耗氢化合物主要包括不饱和脂肪酸、硝酸盐、延胡索酸及其盐、硫酸盐等。除产甲烷菌外,试验中主要关注的瘤胃内其他耗氢微生物有延胡索酸利用菌、硝酸盐还原菌、硫酸盐还原菌、产乙酸菌及酵母菌。耗氢化合物在瘤胃内被微生物利用,进行代谢并消耗一定量的氢气,降低瘤胃氢分压。此类方法没有抑制产甲烷菌,而是提供另外的氢气释放途径,因而不会对纤维素分解产生不利影响。因此,调控这些化合物的添加量,增加其他耗氢微生物的活性,使其能与产甲烷菌竞争氢气底物,便可在不影响瘤胃发酵的情况下降低甲烷排放。
3 主要耗氢化合物及耗氢微生物的研究进展 3.1 不饱和脂肪酸不饱和脂肪酸进入瘤胃后,与瘤胃内的氢气反应,增加其饱和度,这被称为瘤胃的生物氢化作用。生物氢化作用消耗了氢气底物,这可能是不饱和脂肪酸降低甲烷生成的原因之一。但也有研究表明,不饱和脂肪酸主要是通过对原虫或产甲烷菌的抑制作用,降低产甲烷菌的数量,从而降低甲烷产生[15]。
吴端钦等[16]在羊草底物里添加不同水平的亚油酸盐,体外培养24 h后甲烷产量和总产气量显著降低;Wu等[17]在羊草中加入油酸的体外试验中也得到相同的结果。天然植物油富含多不饱和脂肪酸,Vargas等[18]用添加2%葵花籽油的饲粮进行体外试验,结果表明,添加油脂会显著降低甲烷产量。乌日娜[19]通过体内试验和体外试验结合发现,添加大豆油可使甲烷产量显著降低,大豆油添加剂量越高,对纤维素降解率的抑制作用就越明显,这是由不饱和脂肪酸的添加抑制了纤维分解菌的数量和活性导致的,由于纤维分解菌是主要的产氢菌,这可能也是瘤胃甲烷产量降低的原因之一。Bayat等[20]用添加4种不同植物油的青贮饲料饲喂奶牛,在不影响产奶量的情况下降低了甲烷的产生。不饱和脂肪酸作为一种优良的能量饲料添加剂,在产生其他效益的同时,能降低甲烷排放,对其在反刍动物饲粮中适宜添加水平与添加形式的研究是十分有意义的。
3.2 硝酸盐与硝酸盐还原菌硝酸盐可作为非蛋白氮为瘤胃微生物提供氮源[21],硝酸盐还原菌在瘤胃内将硝酸盐还原成亚硝酸盐,再进一步被转化为氨,此过程消耗氢气,理论上可降低瘤胃甲烷生成。硝酸盐还原菌所利用的硝酸盐作为强电子受体,对氢气亲和力强,可与产甲烷菌产生有效竞争。但因硝酸盐易在瘤胃体内被还原成亚硝酸盐,若产生的亚硝酸盐不能及时被分解利用,则会对动物机体产生毒害作用,若沉积在动物产品内,则可能造成更大的危害。而Le Huyen等[21]将硝酸盐作为唯一非蛋白氮源添加到低蛋白质饲粮中,并给动物4周左右的适应期,并未对动物产生毒害作用。这可能是瘤胃微生物在适应过程中增加了亚硝酸盐还原菌的活性,使产生的亚硝酸盐被及时分解利用所致。Mbiriri等[22]用大蒜油、富马酸盐和硝酸盐的混合物进行体外试验,在维持总挥发性脂肪酸产量不变的情况下,显著降低了甲烷的产量,证明硝酸盐与其他耗氢化合物混合使用有降低甲烷排放的潜力,但需更多的体内试验总结出硝酸盐的适宜添加水平。
3.3 延胡索酸与延胡索酸利用菌延胡索酸利用菌可将延胡索酸还原成琥珀酸,再通过脱羧作用生成丙酸,并消耗氢气,使产甲烷菌可利用氢减少。山羊瘤胃液中存在大量延胡索酸利用菌[23]。饲粮中添加延胡索酸可增加延胡索酸利用菌的活性[24],消耗更多氢气,减少瘤胃内氢分压,减少甲烷生成。Li等[25]在未泌乳的新农萨能奶山羊饲粮中添加延胡索酸后降低了瘤胃甲烷产量,且对干物质降解率无显著影响。
延胡索酸的酸度较高,为避免添加延胡索酸导致瘤胃pH失衡,在试验中可使用其钠盐或钙盐形式[26]。杨洋[27]在慢性瘤胃酸中毒的奶山羊饲粮中添加延胡索酸二钠与瘤胃素,发现延胡索酸二钠既可作为缓冲剂维持瘤胃内pH稳定,还可增加乳酸利用菌活性,使瘤胃pH升高,这与赖瀚卿等[28]在断奶羔羊饲粮中添加延胡索酸二钠的试验所得结论相同。但仍有部分试验显示添加延胡索酸或其盐产物只改变瘤胃内挥发性脂肪酸的比值,并没有产生降低甲烷排放的作用,这可能是由于瘤胃中还存在延胡索酸分解产生乙酸和氢气的反应,延胡索酸分解产生的氢气抵消了其消耗的氢气,没有使甲烷产量发生变化[29]。因此,关于延胡索酸的作用机理以及添加延胡索酸对延胡索酸利用菌菌群的影响仍需进一步研究。
3.4 硫酸盐与硫酸盐还原菌自然环境中的硫酸盐还原菌和产甲烷菌可能存在竞争作用[30-31],硫酸盐还原菌与产甲烷菌竞争同一电子供体,在硫酸盐缺乏或耗尽的生态系统(如淡水)中,主要是产甲烷菌占优势,利用氢和乙酸盐;在富含硫酸盐的情况下(如海水中),硫酸盐还原菌占优势,产甲烷菌受到抑制,因为硫酸盐还原菌对底物氢和乙酸盐的亲和力大于产甲烷菌。
在瘤胃内硫酸盐含量高时,硫酸盐还原菌能与产甲烷菌竞争氢气等反应底物生成硫化氢,从理论上可降低甲烷生成。体外培养液中,随着硫水平的增加,甲烷生成量显著减少[32];饲粮中添加硫可减少瘤胃甲烷的产生[33]。氢气在硫酸根(SO42-)、硫等电子受体存在时,可形成硫化氢[34],使用于甲烷生成的氢气减少,进而使甲烷产量降低。也有体内试验证明,增加饲粮硫水平能增加小公牛[35]和绵羊[36]瘤胃中总硫酸盐还原菌数量。Wu等[37]通过体外培养试验发现,饲粮中添加硫能提高瘤胃硫酸盐还原菌的丰度,减少甲烷排放量。
因硫酸盐在瘤胃内反应的终产物硫化氢有毒性,故相关研究相对较少。但也有研究表明,在饲粮中添加梭杆菌菌属瘤胃还原菌,在降低甲烷排放的同时不会产生硫化氢,这可能是由于硫化氢被瘤胃中其他微生物如纤维分解菌及时利用而生成含硫氨基酸的缘故[38]。目前添加硫酸盐对甲烷生成及对硫酸盐还原菌的影响仍不明确,还需更多的体内试验来验证。
3.5 产乙酸菌产乙酸菌是指能通过乙酰辅酶A代谢途径消耗氢气,将二氧化碳还原为以乙酸为主的有机化合物的一类瘤胃微生物[39]。该类微生物能与产甲烷菌竞争氢气底物,降低氢分压,生成的乙酸能重新被反刍动物利用,可在降低甲烷排放的同时减少饲料能量浪费。产乙酸菌在白蚁、鸵鸟肠道内大量存在,与产甲烷菌存在竞争关系,且在袋鼠肠胃内是优势菌群[40]。有研究表明,在初生羔羊瘤胃内最先定植的氢利用菌是产乙酸菌,但随着羔羊的生长,产甲烷菌逐渐替代产乙酸菌成为优势菌种[41],这可能是由于产甲烷菌利用氢气的氢分压较产乙酸菌低所导致。因此,若能增强瘤胃内产乙酸菌活性,增加其氢气利用量,建立新的瘤胃微生态平衡,理论上可降低甲烷排放。
3.6 酵母菌酵母在瘤胃中有建立有益微生物菌群、稳定瘤胃pH和增加纤维降解的作用[42]。酵母能够产生一些促进瘤胃微生物生长的物质,如苹果酸、生物素和对氨基苯甲酸,这些物质可以促进瘤胃微生物生长。添加酵母菌可降低瘤胃甲烷排放,有学者认为这是酵母菌通过竞争改变瘤胃微生物区系,促进了产乙酸菌活性所引起的[43]。Chaucheyras等[44]的试验表明,添加酵母可提高产乙酸菌的氢利用效率和丙酸生成量,甚至可提升5倍以上;Salinas-Chavir等[45]在荷斯坦奶牛饲粮中补充酶解酵母后使瘤胃内乙酸的摩尔比下降,丙酸摩尔比增加,且降低了瘤胃甲烷产量。无论是活酵母还是死酵母,均有降低甲烷生成的效果[4]。但关于酵母的体内和体外试验结果常常不一致[42],不同种类酵母的实际应用效果也不尽相同,因此对于有效酵母菌种的筛选和其促进产乙酸菌活性的机理仍需进一步研究。
4 小结在研究瘤胃调控时,能准确了解瘤胃中不同微生物区系在瘤胃代谢过程中起到的作用会对研究过程起很大帮助。添加不同种类的耗氢化合物,从根本上来说是调节其他耗氢微生物与产甲烷菌的竞争关系,减少产甲烷菌的氢气利用量,从而降低甲烷的排放。因此,了解瘤胃发酵系统中不同种微生物的相互关系,使瘤胃微生物朝着有利的方向发展,才能在不影响瘤胃发酵的前提下长期、有效地降低甲烷排放。
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