寒冷可引起动物体内营养物质吸收代谢发生显著改变,进而影响动物的生存、生长和发育。近年来,“寒流”侵袭引起我国动物发生寒冷应激,最终给畜牧业生产带来重大损失。此外,人与动物由于意外、救援、娱乐、溜冰等原因落入冰水时受到的寒冷应激也较为严重[1]。机体受到寒冷应激时会引起自身生理平衡紊乱,机体随之启动一系列非特异性的自身防御机制来适应寒冷应激的影响。此过程往往伴随血液细胞及一些生化分子物质的变化[2-3]。许友卿等[4]研究表明,寒冷应激可改变基因表达,抑制转录和翻译,同时改变细胞膜双分子层的分子排列结构。血液是机体运输氧气、代谢物质和体液免疫分子的载体,其中血常规、血清生化和免疫指标能综合反映机体基本状态。本试验拟通过研究犬在短期冰水刺激下血常规、血清生化与免疫指标的变化规律,为临床上降低寒冷应激对犬的危害提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 试验动物与试验设计试验动物为8条健康的中华田园犬,年龄1.5~2.5岁、体重(5.67±0.88) kg。试验犬单笼饲养,自由采食和饮水。饲喂通用型犬种饲粮(营养标准:粗蛋白质含量≥28%;粗脂肪含量≥16%;粗纤维含量≤4.5%;粗灰分含量≤9%;钙含量≥1.1%;总磷含量≥0.9%;水分含量≤10%)。
试验犬在温度(28±1) ℃、相对湿度60%~70%的环境中适应性饲养1周。试验开始后,将犬脊柱平行于冰水平面置于冰水中0.5 h。冰水刺激结束后,迅速用干毛巾将犬身上的水擦干,置于温控试验台(30~40 ℃)上。分别在冰水刺激前、冰水刺激结束时(置于冰水0.5 h后)以及恢复0.5、1.0、3.0、7.0 h时采样。
1.2 样本采集及指标测定在各采样时间点,颈静脉采集乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)抗凝血和非抗凝血各0.5 mL,分别用于血常规、血清生化和免疫指标测定。血液红细胞计数(red blood cell count, RBC)、平均红细胞体积(mean corpuscular volume,MCV)、平均红细胞血红蛋白量(mean hemoglobin,MCH)、红细胞压积(hematocrit,HCT)、白细胞计数(white blood cell count, WBC)、血红蛋白浓度(hemoglobin concentration,HGB)、平均红细胞血红蛋白浓度(mean hemoglobin concentration,MCHC)、红细胞分布宽度变异系数(red blood cell distribution width coefficient of variation,RDW-CV)、淋巴细胞计数(lymphocyte count,Lym)、单核细胞计数(monocyte count, Mon)、粒细胞计数(granylocyte count,Gran)、淋巴细胞百分比(lymphocyte percentage,Lym%)、单核细胞百分比(monocyte percentage,Mon%)、粒细胞百分比(granylocyte percentage,Gran%)、嗜酸性粒细胞百分比(eosinophile granulocyte percentage,Eos%)、血小板计数(platelet count,PLT)、平均血小板体积(mean platelet volume,MPV)、血小板分布宽度变异系数(platelet distribution width coefficient of variation,PDW-CV)、血小板压积(plateletcrit,PCT)利用迈瑞BC-2800兽用血常规分析仪测定。血清谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、γ-谷氨酰转移酶(γ-glutamyl-transferase,γ-GT)、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)活性以及直接胆红素(direct bilirubin,D-bil)、总胆红素(total bilirubin,T-bil)、尿酸(uric acid, UA)、尿素、肌酐含量利用迈瑞BS-200全自动生化分析仪测定,所用试剂盒购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司。血清免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)、免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)、补体3(complement 3,C3)含量采用免疫比浊法测定,所用试剂盒购自南京建成生物工程研究所。血清γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)、白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)含量采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定,所用试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。
1.3 数据处理与分析试验结果用平均值±标准差表示。各时间点试验数据采用PASW statistics 18.0软件进行单因素重复测量方差分析,并采用LSD法进行多重比较。P<0.05表示差异显著。
2 结果与分析 2.1 短期冰水刺激对犬血常规指标的影响 2.1.1 短期冰水刺激对犬血液中红细胞相关指标的影响由表 1可知,与冰水刺激前相比,冰水刺激结束时血液RBC、HGB、HCT显著增加(P<0.05),恢复1.0、3.0、7.0 h时血液RBC、HGB、HCT显著降低(P<0.05)。与冰水刺激结束时相比,各恢复时间点(0.5、1.0、3.0、7.0 h)血液RBC显著降低(P<0.05),恢复1.0、3.0、7.0 h时血液HGB、HCT显著降低(P<0.05)。犬经冰水刺激后恢复0.5 h时,血液RBC、HGB、PCV与冰水刺激前无显著差异(P>0.05)。而试验结束即犬经冰水刺激后恢复7.0 h时,血液RBC、HGB、PCV比冰水刺激结束时分别降低24.19%、23.89%和23.08%,差异显著(P<0.05)。
由表 2可以看出,与冰水刺激前相比,冰水刺激结束时血液Lym%和Mon%显著升高(P<0.05),恢复0.5 h时血液Mon%显著升高(P<0.05),而血液Eos%显著降低(P<0.05),恢复1.0、3.0、7.0 h时血液Gran与Gran%显著增加(P<0.05),而血液Lym%与Eos%显著降低(P<0.05)。与冰水刺激结束时相比,各恢复时间点血液Lym显著降低(P<0.05),恢复1.0、3.0、7.0 h时血液WBC、Gran和Gran%显著增加(P<0.05),而血液Lym、Lym%显著降低(P<0.05)。犬经冰水刺激后恢复7.0 h时血液WBC显著高于冰水刺激前[(15.36±3.80)×109/L vs. (10.18±2.24)×109/L)]。犬经冰水刺激后恢复0.5 h时,血液Lym、Lym%和Mon恢复至冰水刺激前水平。犬经冰水刺激后恢复7.0 h时,血液WBC、Mon、Gran分别比冰水刺激结束时增加56.26%、44.19%和81.07%,差异显著(P<0.05),而血液Lym和Lym%则较冰水刺激结束时显著降低(P<0.05)。
由表 3可以看出,与冰水刺激前相比,冰水刺激结束时血液中血小板各项相关指标均未发生显著性变化(P>0.05)。与恢复3.0 h相比,恢复7.0 h时血液PLT显著增加(P<0.05)。犬经冰水刺激后恢复7.0 h时,血液中血小板各相关指标与冰水刺激结束时相比均无显著变化(P>0.05)。
由表 4可以看出,与冰水刺激前相比,各时间点AST活性、尿素含量均显著升高(P<0.05),冰水刺激结束时血清ALT、ALP活性以及UA、肌酐含量显著升高(P<0.05),恢复1.0、3.0、7.0 h时血清ALP、肌酐含量显著降低(P<0.05)。与冰水刺激结束时相比,各恢复时间点血清CK活性显著升高(P<0.05),血清ALP活性显著降低(P<0.05),恢复1.0 h时血清D-bil、T-bil和UA含量显著降低(P<0.05)。犬经冰水刺激后恢复7.0 h时,血清T-bil、UA、肌酐含量以及ALT、ALP活性分别比冰水刺激结束时降低38.07%、71.04%、18.02%、16.33%和12.01%,差异显著(P<0.05)。犬经冰水刺激后恢复7.0 h时,血清AST、CK活性与尿素含量均未恢复到冰水刺激前水平。冰水刺激引起的血清T-bil、D-bil、UA、肌酐含量与ALP活性的升高分别在结束冰水刺激0.5、0.5、1.0、0.5、0.5 h后恢复至冰水刺激前水平。
由表 5可以看出,与冰水刺激前相比,恢复3.0、7.0 h时血清IgM含量显著降低(P<0.05),冰水刺激结束时以及恢复0.5、1.0、3.0 h时血清C3含量显著升高(P<0.05)。与冰水刺激结束时相比,恢复3.0、7.0 h时血清IgM含量显著降低(P<0.05),恢复3.0 h时血清C3含量显著升高(P<0.05)。犬经冰水刺激后恢复7.0 h时,血清IgM含量比冰水刺激结束时降低23.28%,差异显著(P<0.05),且血清IgM含量在整个试验恢复过程中呈现持续降低的趋势。
机体长期处于寒冷环境下,体内多种物质代谢会发生显著改变,刺激机体红细胞生成[5]。本试验研究结果显示,犬在短期冰水刺激后血液RBC、HCT和HGB均显著增加。其原因一方面是寒冷应激引起犬脾脏、骨髓等贮备红细胞进入血液循环系统;另一方面是发生寒冷应激时血管收缩,末梢循环血液灌注量降低,引起机体大血管内红细胞等相关指标增加[6-7]。恢复1.0、3.0、7.0 h时,血液RBC、HCT和HGB均显著下降说明短期冰水刺激恢复期增强了组织液向血液中的渗出,引起这3项指标的相对下降[8]。整个试验过程中RDW-CV未发生显著变化,说明短期冰水环境对红细胞大小的均匀度无显著影响,非同质性红细胞无显著变化。
白细胞是包括淋巴细胞、单核细胞、粒细胞在内的一类具有非特异性免疫功能的血液细胞。本试验结果显示短期冰水刺激显著增加血液Lym和Mon%,这与Lombardi等[9]的研究结果一致。其主要原因是发生寒冷应激时产生的儿茶酚胺动员周围池的白细胞进入血液循环[10]。但上述结果与袁学军等[11]的研究结果不一致,可能与寒冷应激的动物种类及导致寒冷应激时的温度不同有关。短期冰水刺激后恢复1.0、3.0、7.0 h时,血液WBC、Gran均显著升高,Lym%显著降低,表明短期冰水刺激后发生了炎症反应,同时影响机体的非特异性免疫力。恢复期Eos%降低,与Lombardi等[9]的研究结果一致。本研究表明,在冰水刺激0.5 h后,Gran无显著变化,而在恢复1.0 h时显著升高,说明短期冰水刺激后血液Gran的适应性调节仍需要一段时间,而在寒冷应激发生时血液Lym显著增加和Eos%显著减少表现更加敏感。血小板是评价机体凝血功能的重要指标。本试验结果显示短期冰水刺激后犬血液MPV、PCT和PDW-CV均未发生显著变化,表明短期冰水刺激对血小板物理特征的影响较小。而犬血液PLT在短期冰水刺激后的恢复期(恢复0.5、1.0、3.0 h时)逐渐降低,但差异不显著。血液PLT降低是由于短期冰水刺激导致机体出血性损伤,血小板通过聚集发挥凝血作用消耗而引起[9, 11]。
3.2 短期冰水刺激对犬血清生化指标的影响血清生化指标反映了机体组织、器官的功能状态。机体细胞受到外界因素影响后,细胞膜通透性增大引起细胞内物质外流至血液,引起血清生化指标的变化。AST主要存在于线粒体,而ALT主要存在于细胞质。本试验结果显示,短期冰水刺激引起血清AST、ALT活性显著升高,说明短期冰水刺激对犬肝脏细胞活性有显著影响,恢复7.0 h时血清AST活性仍显著高于冰水刺激前,表明短期冰水刺激可能导致部分肝细胞坏死[12]。血清中D-bil和T-bil含量在冰水刺激结束时显著升高,而在恢复1.0 h均有显著降低。结合血液中RBC的变化规律,表明短期冰水刺激引起血液循环系统中RBC的变化,进而引起血液中胆红素含量的变化。
尿素是哺乳动物排出蛋白质代谢废物的重要形式。本研究发现,短期冰水刺激引起血清尿素含量显著升高,表明短期冰水刺激下机体为对抗寒冷应激加强了体内蛋白质的分解代谢,且此时肾脏由于受到寒冷应激影响其排泄尿素功能降低,最终导致血清中尿素含量升高[13]。短期冰水刺激后恢复0.5、1.0、3.0、7.0 h时,血清中尿素含量仍然较高,说明短期冰水刺激对蛋白质分解代谢的增强作用持续时间较长。短期冰水刺激下犬血清中UA含量显著升高,在结束冰水刺激后恢复1.0 h时恢复至冰水刺激前水平,表明冰水刺激下犬嘌呤代谢旺盛,氧化成UA的数量增加,同时由于受到寒冷应激的影响导致肾脏UA排泄功能降低,且功能代偿性恢复较快[13]。血清肌酐含量表现出了与UA类似的变化规律,其升高与寒冷应激下机体肌肉震颤,肌酸供能产生的肌酐过多和冰水刺激下肾脏的排泄功能降低有关[14]。冰水刺激结束后血清肌酐含量迅速恢复至正常水平与寒冷应激结束后肌肉活动迅速降低且肾脏排泄功能逐渐恢复有关[15]。
本研究发现,短期冰水刺激能引起血清ALP活性显著增高而后迅速恢复,表明短期冰水刺激可能显著影响犬肝脏的代谢能力,对肝细胞造成一定程度的损伤,导致肝细胞膜通透性加大,引起血清ALP活性显著升高。CK、LDH是动物细胞内能量运转和再生以及肌肉收缩相关的重要激酶。黄丽波等[16]研究表明,血清LDH、CK活性可以作为白凤雏鸡的寒冷应激检测指标。短期冰水刺激后犬血清CK活性显著升高,表明短期冰水刺激可使心肌、肌肉细胞膜的完整性受到破坏,导致CK逸出进入血液。本试验还发现犬血清LDH活性的基准值及冰水刺激后每条犬的血清LDH活性变化差异较大,但未表现出明显的规律,表明LDH活性与动物的个体密切相关[17]。
3.3 短期冰水刺激对犬血清免疫指标的影响研究表明,重度寒冷应激抑制动物免疫功能发挥,而慢性温和寒冷应激引起免疫功能增强。计红等[18]的研究表明,猪受到冷应激(4~8 ℃)6 h时,血清IL-2含量显著升高,而IFN-γ、IgG含量无显著变化;而周文芸等[19]的研究指出,大鼠受到冷应激(4 ℃)后血清IL-2和IFN-γ含量无显著变化。本试验结果表明,短期冰水刺激后恢复期血清IgM的含量持续降低,而血清IgA、IgG含量无显著变化,表明短期冰水刺激降低了机体对免疫球蛋白的合成,且对不同种类的免疫球蛋白合成的影响不尽相同。短期冰水刺激对犬血清IFN-γ和IL-2含量无显著影响,提示短期冰水刺激虽然引起犬淋巴细胞增多,但其分泌IL-2和IFN-γ的功能有所降低[3]。C3是血清中最重要的补体,由肝脏和免疫细胞合成。本研究表明,短期冰水刺激导致犬血清C3含量显著增加,可能与短期冰水刺激引起机体的炎症反应有关。冰水刺激结束后,犬血清C3含量持续增加,在恢复3.0 h时达到最高,表明短期冰水刺激引起的机体炎症反应持续时间较长。
4 结论短期冰水刺激可引起犬血液RBC、HGB、HCT、Lym、Lym%、Mon%以及血清AST、ALT、ALP活性与尿素、UA、肌酐、C3含量显著增加;短期冰水刺激后恢复7.0 h时,与冰水刺激前相比,血液RBC、HGB、HCT、Lym%、Eos%以及血清T-bil、UA、肌酐、IgM含量与ALP活性显著降低,血液WBC、Mon、Gran以及血清AST活性、尿素含量显著增加,而血液Lym、Mon%以及血清ALT活性、C3含量恢复到试验开始时水平。这表明短期冰水刺激可引起犬部分血常规、血清生化和免疫指标发生显著变化,且恢复7.0 h后仍有部分指标未完全恢复至试验开始时水平,提示临床上动物在受到冰水刺激后要及时纠正血常规、血清生化和免疫指标的变化,增强机体免疫力,缓解冰水刺激对动物的持续危害。
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