2. 内蒙古农牧业科学院动物营养与饲料研究所, 呼和浩特 010031;
3. 乌拉特前旗家畜改良工作站, 巴彦淖尔 014400
2. Animal Nutrition and Feed Research Institution of Inner Mongolia Academy of Agriculture and Animal Husbandry Academy, Hohhot 010031, China;
3. Urat Front Banner Livestock Improvement Station, Bayannur 014400, China
反刍动物采食的饲粮主要经瘤胃微生物发酵后分解成乙酸、丙酸和丁酸等低级脂肪酸，再经糖异生作用转变为葡萄糖被机体所利用。Bergman等[1]研究报道，糖异生作用可提供反刍动物所需葡萄糖的90%以上。特别是在围产期，葡萄糖在肝脏的净合成量和可利用性是决定乳产量的最主要限制因素[2]。因此，围产期反刍动物糖异生的“机制”必须持续快速地运转，任何“崩溃”都可能导致严重的代谢紊乱[3]。
肝脏糖异生过程会受到丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PC)、葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase，G6P)和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK)等多个关键因子的调控，它们是糖异生途径的限速酶，其活性大小反映了机体葡萄糖异生作用的程度[4]。5-羟色胺(5-HT)是由必需氨基酸色氨酸(Trp)经2步反应合成的内源活性物质，5-羟基色氨酸(5-HTP)和Trp是其2步合成反应的前体物。Laporta等[5]研究报道，给母鼠饲喂5-HT前体物5-HTP和Trp，能够调节围产期母鼠的肝脏糖代谢，促进母鼠肝脏糖异生关键酶的mRNA表达。Zabala等[6]给大鼠服用5-HT，增加了肝脏中PEPCK的mRNA表达，表明5-HT可促进肝脏葡萄糖异生。因此，本试验旨在通过研究5-HT前体物对围产期母羊肝脏糖异生关键基因mRNA和蛋白质表达量的影响，为进一步探讨5-HT对于母羊肝脏糖异生的作用机制提供研究基础，也可为减缓母羊围产期的能量负平衡、提高母羊机体健康和生长性能寻求一种有效的调控途径。
1 材料与方法 1.1 试验设计试验选择体况良好、体重(64.52±4.11) kg、处于同一围产期、经同期发情配种的经产巴美肉羊母羊30只，按体重随机分为3组，即对照组(灌注生理盐水)、5-HTP组(灌注5-HTP)和Trp组(灌注Trp)，每组10只。5-HTP组和Trp组在母羊产前第7天至产后当天(第0天)的每日08:00进行颈静脉灌注，5-HTP和Trp的灌注剂量均为0.178 mg/kg BW，浓度为0.1 mg/mL；对照组灌注同等剂量的生理盐水，灌注剂量参照文献[7]。试验期为产前第14天至产后第30天，其中，预试期为产前第14天至产前第8天，正试期为产前第7天至产后第30天。试验饲粮参照NRC(2007)绵羊营养需要量配制，基础饲粮组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) |
每日08:00和17:00各饲喂1次。试验期间所有母羊自由饮水，羊舍环境条件及饲养管理均保持一致。于母羊产后第9天，在每个试验组各随机选择3只母羊进行屠宰，采集其肝脏组织样品3 g并放入液氮中保存。
1.3 试验材料主要仪器：紫外分光光度计(UV-2600，岛津公司，日本)、可见光分光光度计(722，上海光学仪器厂)、全自动纤维分析仪(ANKOM公司，美国)、高速低温离心机(5430，艾本德公司，德国)、电泳仪(Mini-Sub Cell GT，Bio-Rad公司，美国)、实时荧光定量PCR仪(CFX Connect，Bio-Rad公司，美国)、凝胶成像分析系统(GelDoc XR+，Bio-Rad公司，美国)、0.22 μm聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore公司，美国)、蛋白质转膜仪(Bio-Rad公司，美国)、化学发光成像系统(ChemiDoc MP，Bio-Rad公司，美国)等。
主要试剂：Marker(天根生化科技有限公司)、荧光定量PCR试剂盒(SYBR Premix EX TaqⅡ，TaKaRa公司，日本)、RNA提取试剂(TaKaRa公司，日本)、反转录试剂盒(TaKaRa公司，日本)、核酸染料(天根生化科技有限公司)、蛋白质提取液(Sigma公司，美国)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白质浓度测定试剂盒(Sigma公司，美国)、一抗(Sigma公司，美国)、二抗(Sigma公司，美国)、电泳液(Sigma公司，美国)、中等蛋白质分子量Marker(Sigma公司，美国)等。
1.4 测定指标与方法 1.4.1 基础饲粮营养水平测定饲粮代谢能为计算值，参考《中国饲料成分及营养价值表(2017年第28版)》[8]中各原料的代谢能值，根据NRC(2007)绵羊营养需要量，通过各原料组成比例进行计算。粗蛋白质含量的测定使用凯氏定氮法，参考GB/T 6432—1994方法进行[9]。钙含量的测定使用乙二胺四乙酸二钠络合滴定法，参考GB/T 6436—2002方法进行[10]。磷含量的测定使用分光光度法，参考GB/T 6437—2002方法，应用紫外分光光度计进行[11]。中性洗涤纤维(NDF)含量的测定使用范氏法，参考GB/T 20806—2006，应用全自动纤维分析仪进行[12]。非纤维性碳水化合物(NFC)为计算值，公式为：
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特异性引物根据GenBank公布的引物序列并利用Primer 5.0进行设计，由宝生物工程(大连)有限公司进行合成并验证，引物信息见表 2。
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表 2 引物信息 Table 2 Primer information |
采用Trizol(Invitrogen公司，美国)法进行肝脏组织总RNA的提取，具体方法参照Simms等[14]。经酶标仪上测定吸光度(OD)260/OD280的值分布在1.8~2.2，经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。利用PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa，编号：DRR036A)试剂盒说明书进行反转录，反应条件为：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。利用实时荧光定量PCR方法检测肝脏组织样品各项基因的mRNA表达量，反应程序如下：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，进行40个循环反应；70 ℃ 0.06 s，51个循环，绘制熔解曲线。以β-肌动蛋白(β-actin)为内参，采用2-△△Ct法计算目的基因mRNA表达量。
1.4.3 肝脏糖异生关键基因蛋白质表达量的测定取100 mg肝脏组织样品，以β-actin为内参采用蛋白质印迹法(Western blot)检测肝脏中PEPCK、PC和G6P的蛋白质表达量。将总蛋白质样品60 μg与5×蛋白质凝胶电泳上样缓冲液按照4 : 1的体积比轻轻混合，95 ℃变性10 min。将样品加至凝胶点样孔中，接通电泳仪电源，将电压调至80 V，30 min，使样品完全通过。电泳结束后，将分离的蛋白质转移到PVDF膜上100 V、4 ℃、5 min。转膜后，吐温-Tris缓冲盐溶液(TBST)漂洗3次，5 min/次，室温摇床上封闭1 h，TBST漂洗3次，5 min/次。然后一抗加入PVDF膜中，4 ℃反应过夜，将反应膜用TBST洗涤3次，10 min/次。加入适宜比例二抗作用1 h，TBST洗PVDF膜3次，5 min/次。将化学发光(ECL)试剂盒中A、B液按1 : 1体积比混合并均匀加在PVDF膜表面，避光4 min，成像。
1.5 数据统计分析试验有关数据采用Excel 2010进行计算和绘图，并采用SAS 9.2进行单因素方差分析。P < 0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 5-HT前体物对围产期母羊肝脏糖异生关键基因mRNA表达量的影响5-HT前体物对围产期母羊肝脏糖异生关键基因mRNA表达量的影响见图 1。在产后第9天，5-HTP组和Trp组的肝脏PEPCK、PC和G6P的mRNA表达量均显著高于对照组(P < 0.05)，Trp组与5-HTP组之间差异不显著(P>0.05)，但5-HTP组的肝脏PEPCK和PC的mRNA表达量略高于Trp组，5-HTP组的肝脏G6P的mRNA表达量略低于Trp组。
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数据柱标相同小写字母表示差异不显著(P＞0.05)，不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。下图同。 Value columns with the same small letter mean no significant difference (P > 0.05), while with different small letters mean significant difference (P < 0.05). The same as below. 图 1 5-HT前体物对围产期母羊肝脏糖异生关键基因mRNA表达量的影响 Fig. 1 Effects of 5-HT precursor on mRNA expressions of liver gluconeogenesis key genes of perinatal ewes |
5-HT前体物对围产期母羊肝脏糖异生关键基因蛋白质表达量的影响见图 2和图 3。5-HTP组和Trp组的肝脏PEPCK、PC和G6P的蛋白质表达量均显著高于对照组(P < 0.05)；Trp组的肝脏PEPCK的蛋白质表达量显著低于5-HTP组(P < 0.05)；Trp组的肝脏PC的蛋白质表达量高于5-HTP组，但差异不显著(P>0.05)；Trp组的肝脏G6P的蛋白质表达量显著高于5-HTP组(P < 0.05)。
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图 2 5-HT前体物对围产期母羊肝脏糖异生关键基因蛋白质表达量的影响 Fig. 2 Effects of 5-HT precursor on protein expressions of liver glycosylation key genes of perinatal ewes |
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图 3 各组围产期母羊肝脏糖异生关键基因蛋白质免疫印迹图 Fig. 3 Western blot picture of liver glycosylation key gene protein of perinatal ewes in each group |
围产期是反刍母畜繁殖周期内内分泌和代谢变化最为显著的时期。大多数反刍母畜都会经历一定程度的负能量平衡、胰岛素抵抗、饲料摄入量和能量供应减少以及免疫抑制[14-16]。母体组织，特别是肝脏、乳腺和骨骼，都经历了许多适应过程来支持分娩和乳的合成[17]，这对母畜维持体内平衡的能力造成了极大的压力。此时，母畜极易受到各种疾病或代谢紊乱的影响，这些疾病或代谢紊乱会对母畜的健康产生负面影响，进而影响其整体生产性能，造成重大的经济损失[18]。葡萄糖为母羊围产期提供主要的能量来源，80%以上的葡萄糖供给是由肝脏糖异生提供的[19]。肝脏糖异生作用主要是在各种关键酶的作用下将非糖前体物合成葡萄糖[20]。在肝脏糖异生过程中，PC、PEPCK和G6P是这一过程中的3个关键限速酶，它们的活性可直接反映机体糖异生的作用程度[4]。本试验结果表明，5-HTP组和Trp组的肝脏糖异生关键基因PEPCK、G6P和PC的mRNA表达量显著高于对照组。这说明在肝脏糖异生过程中，5-HT前体物的灌注显著提升了肝脏糖异生关键限速酶基因的表达，增加了PEPCK、G6P和PC的活性，促进了非糖前体物合成葡萄糖。
Laporta等[21]的研究报道也表明，给小鼠饲喂5-HTP可诱导肝脏PC的表达，PC在葡萄糖异生途径中催化丙酮酸羧化生成草酰乙酸，PEPCK将草酰乙酸转化为磷酸烯醇丙酮酸。在饲喂5-HTP小鼠的肝脏中，PC和PEPCK的mRNA表达量增加，表明5-HT可能通过调节这些酶来调控糖异生。同时，从肝脏糖异生关键基因mRNA和蛋白质表达量来看，5-HTP组和Trp组之间的差异性规律并不完全一致，说明灌注的5-HT前体物不同，对于肝脏糖异生作用限速酶关键基因的影响在转录水平和翻译水平上有差别的。但从总体来看，5-HT前体物对于肝脏糖异生作用限速酶关键基因的影响是显著的。
Laporta等[21]的研究还显示，5-HTP组和L-Trp组之间的血液葡萄糖含量存在差异，添加L-Trp不仅增加糖异生酶的基因表达，糖酵解的关键酶磷酸果糖激酶(PFK)的mRNA表达量也升高，小鼠的血液葡萄糖含量显著降低，因此添加L-Trp可能还加速了糖酵解。本试验主要测定了与糖异生相关的基因表达，并没有测定与糖酵解相关的基因表达。同时，Watanabe等[22]研究表明，小鼠腹腔注射5-HT后，血浆胰岛素浓度升高。然而，5-HT不仅导致高胰岛素血症，同时还导致高血糖症，但没有引起肝脏和骨骼肌糖原浓度的变化。因此推论，5-HT有2种不同的葡萄糖代谢作用：一种是在胰腺B细胞中引起胰岛素分泌的直接诱导作用，另一种是在组织中抑制肝脏和骨骼肌以外的组织从血液中摄取葡萄糖。因此，5-HT前体物对于机体葡萄糖代谢的作用方式及机制还有待于进一步研究。
4 结论① 灌注5-HT前体物可使产后第9天母羊的肝脏糖异生关键基因PEPCK、G6P和PC的mRNA表达量显著升高，起到了促进肝脏糖异生的作用。
② 灌注5-HT前体物可使产后第9天母羊的肝脏糖异生关键基因PEPCK、G6P和PC的蛋白质表达量显著升高，说明5-HT前体物不仅在转录水平，也在翻译水平起到促进肝脏糖异生的作用。
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